Методическая статья

Профилирование модификации H3K4me3 в растениях с использованием расщепления под мишенями и меткой

DOI:

10.3791/62534

⸱

22 апреля 2022 г.

 ,  ,  , 
1College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, 2Central Laboratory, State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Cotton Hybrid R & D Engineering Center (the Ministry of Education), College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, 4Hainan Institute of Zhejiang University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Расщепление под мишенями и тегментацией (CUT&Tag) является эффективной стратегией эпигеномного профилирования хроматина. Этот протокол представляет собой усовершенствованную стратегию CUT&Tag для профилирования модификаций гистонов в растениях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпигеномная регуляция на хроматическом уровне, включая модификации ДНК и гистонов, поведение факторов транскрипции и некодирующие РНК с их рекрутированными белками, приводят к временному и пространственному контролю экспрессии генов. Расщепление под мишенями и тегментацией (CUT&Tag) представляет собой метод ферментного связывания, при котором специфический белок хроматина сначала распознается по его специфическому антителу, а затем антитело связывает белок слияния белка А-транспозазы (pA-Tn5), который расщепляет целевой хроматин in situ путем активации ионов магния. Здесь мы предоставляем наш ранее опубликованный протокол CUT&Tag с использованием интактных ядер, выделенных из аллортетраплоидных листьев хлопка с модификацией. Этот пошаговый протокол может быть использован для эпигеномных исследований растений. Кроме того, существенные модификации для выделения ядер растений снабжены критическими комментариями.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Участки ДНК, связывающие транскрипционный фактор, и открытый хроматин, связанный со знаками модификации гистона, играют решающую функциональную роль в регулировании экспрессии генов и являются основными направлениями эпигенетических исследований1. Традиционно анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP) в сочетании с глубоким секвенированием (ChIP-seq) были использованы для общегеномной идентификации специфических модификаций гистонов хроматина или мишеней ДНК с конкретными белками и широко распространены в области эпигенетики2. Технология расщепления под мишенями и тегментацией (CUT&Tag) была первоначально разработана лабораторией Хеникова для захвата связанных с белком фрагментов ДНК по всему геному5. По сравнению с ChIP, CUT&Tagcan генерирует библиотеки ДНК с высоким разрешением и исключительно низким фоном, используя небольшое количество клеток с упрощенной процедурой3. На сегодняшний день в клетках животных установлены методы анализа хроматиновых областей со специфическими модификациями гистонов с использованием CUT&Tag4,5. В частности, одноклеточный CUT&Tag (scCUT&Tag) также был успешно разработан для тканей и клеток человека6. Однако из-за сложности клеточной стенки и вторичных метаболитов CUT&Tag по-прежнему технически сложен для растительных тканей.

Ранее мы сообщали о протоколе CUT&Tag с использованием интактных ядер, выделенных из аллотетраплоидных листьев хлопка4. Чтобы продемонстрировать эффективность выделения ядер и захвата ДНК с помощью растительной ткани, процедура профилирования представлена здесь. Основные этапы включают выделение интактных ядер, инкубацию in situ с антителом для модификации хроматина, инкубацию транспозазы, интеграцию адаптеров и подготовку библиотеки ДНК. Поиск и устранение неисправностей сосредоточен на подготовке библиотеки CUT&Tag к выделению ядер растений и контроле качества.

В этом исследовании мы представляем усовершенствованную стратегию CUT&Tag для растений. Мы не только предоставляем пошаговый протокол профилирования H3K4me3 в листьях хлопка, но также предоставляем оптимизированную методологию выделения ядер растений, включая стратегию выбора концентрации моющего средства для правильного лизиса клеток и стратегию фильтрации ядер. Подробные шаги с критическими комментариями также включены в этот обновленный протокол.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовьте транспозазы и стоковые растворы (День 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой части олигонуклеотидные адаптеры комплексуют с транспозазой Tn5 для получения активной транспозазы.

  1. Разбавляйте грунтовки (грунтовка А, грунтовка В и грунтовка С) до концентрации 100 мкМ с использованием буфера отжига (10 мМ Tris pH 8,0, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА) (см. Таблицу 1 для информации о последовательности грунтовок и Таблицу 2 для рецептур рабочих растворов). Хранить при температуре -20 °C до использования.
  2. Наладите следующие две реакции в пробирках ПЦР: Реакция 1 (адаптер AB), 10 мкл праймера A 100 мкМ, 10 мкл праймера B 100 мкМ; Реакция 2 (адаптер переменного тока), 10 мкл 100 мкМ праймера А, 10 мкл 100 мкМ праймер С.
  3. Отожгите адаптеры в аппарате ПЦР с помощью следующей программы: нагревательная крышка (102 °C), 75 °C в течение 15 мин, 60 °C в течение 10 мин, 50 °C в течение 10 мин, 40 °C в течение 10 мин, 25 °C в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптеры представляют собой частично двухцепочечные молекулы ДНК (концентрация = 50 пмоль/мкл).
  4. Настройте следующую реакцию в центрифужной трубке объемом 1,5 мл: 10 мкл транспозазы pA-Tn5 (500 нг/мкл или 7,5 пмоль/мкл), 0,75 мкл адаптера AB (50 пмоль/мкл), 0,75 мкл адаптера переменного тока (50 пмоль/мкл), 7 мкл буфера связи. Пипетку 20x аккуратно перемешать и инкубировать при 30 °C на водяной бане в течение 1 ч. Конечная концентрация транспозазы = 4 пмоль/мкл. Хранить при -20 °С до начала использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Молярное соотношение адаптера AB: адаптера AC: транспозаза = 0,5:0,5:1.
  5. Подготовьте стоковые растворы в соответствии с рецептами, приведенными в таблице 2 , и автоклав или отфильтруйте исходные растворы для стерилизации.
  6. Автоклавные и стерилизующие ножницы, фильтровальная бумага, сито из нержавеющей стали, ступка, пестики и т.д.

2. Выделение ядер (День 2)

  1. Предварительно охладите центрифугу до 4 °C. На каждый 1 г исходного материала (хлопковых листьев) готовят 25 мл буфера ядерной изоляции A (10 мМ Tris pH 8,0, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА), 20 мл буфера ядерной изоляции B (10 мМ Tris pH 8,0, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА), 50 мл буфера ядерной промывки (10 мМ Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ спермидина, коктейль ингибитора протеазы 0,1%), 1 мл буфера антител (50 мМ Tris pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ спермидина, 1 мг/мл BSA, коктейль ингибитора протеазы 0,1%, 0,05% мас./v цифры). Дайте трубкам постоять на льду до использования.
  2. Измельченные свежие листья (~1 г) в жидком азоте до мелкодисперсного порошка и переложить в трубку объемом 50 мл, содержащую 25 мл охлажденного буфера ядерной изоляции А.
  3. Аккуратно перемешайте буферный раствор и инкубируйте трубку на льду в течение 5 мин с легким встряхиванием, чтобы равномерно рассеять материал.
  4. Центрифуга в течение 5 мин при 500 rcf при 4 °C с образованием ячейки гранулы.
  5. Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте гранулу 20 мл охлажденного буфера ядерной изоляции B, дополненного 0,5% Triton X-100. Осторожно переверните трубку, чтобы полностью повторно суспендировать гранулу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер ядерной изоляции B объемом 20 мл применим для исходного материала весом 1 г, и этот объем может быть соответствующим образом масштабирован.
    1. Выполните пилотный анализ для проверки эффекта последовательной концентрации тритона X-100 (например, 2 мл буфера ядерной изоляции B, каждый с 0,1%, 0,25%, 0,5% и 1% Triton X-100 на 100 мг измельченных тканей). На соответствующую концентрацию Тритона Х-100 указывает скопление белых/серых ядер на дне и темно-зеленого супернатанта после лизиса и центрифугирования на низкой скорости (< 500 rcf в течение 4 мин).
  6. Отфильтруйте полученный лизат клеток комбинацией двух сит: 500-сетчатое сито сверху для удаления более крупных тканевых обломков и 1000-сетчатое сито снизу для сбора ядер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите подходящий размер ячеек для сит в зависимости от размера ядер растений.
  7. Используйте стерильную фильтровальную бумагу на задней стороне сита, чтобы поглотить мелкий клеточный мусор в лизате.
  8. Перенесите оставшиеся ядра, содержащие лизат, на верхней стороне 1000-сетчатого сита в четыре свежие трубки центрифуги объемом 1,5 мл.
  9. Центрифуга в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C для сбора ядер.
  10. Удалите как можно больше супернатанта с помощью наконечника пипетки и промойте гранулу с помощью буфера ядерной промывки.
  11. Добавьте 800 мкл буфера ядерной промывки и осторожно переверните трубки, чтобы повторно суспендировать гранулу. Снова вращайте трубку в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C.
  12. Выполните в общей сложности 3 стирки.
  13. (Необязательно) Визуализируйте ядра под микроскопом для окрашивания DAPI.
    1. Перенос 100 мкл суспензии ядер в буфер ядерной промывки с шага 2.11. на новую трубку объемом 1,5 мл. Добавьте 900 мкл буфера ядерной промывки и 2 мкл исходного раствора DAPI (1 мг/мл), чтобы получить окончательную рабочую концентрацию 2 мкг/мл для DAPI. Инкубировать тюбик в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре.
    2. После окрашивания центрифугируют в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C для сбора ядер.
    3. Удалите как можно больше супернатанта с помощью наконечника пипетки. Промыть 3 раза с 800 мкл буфера ядерной промывки.
    4. Удалите как можно больше супернатанта и повторно суспендируйте ядра 100 мкл буфера ядерной промывки.
    5. Визуализируйте ядра под флуоресцентным микроскопом с помощью канала DAPI.
  14. Объедините ядра из двух пробирок (~50 мкл ядер в объеме в каждой трубке объемом 1,5 мл). Центрифуга в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C. Удалите как можно больше оставшегося буфера с помощью наконечника пипетки.

3. Инкубация антител

  1. Повторно суспендировать каждые 50 мкл ядер в пробирке объемом 1,5 мл с 1 мл буфера антител.
  2. Наладили следующие реакции в пробирках объемом 1,5 мл: две биологические реплики контрольных групп IgG со 150 мкл ядер (~ 1 мкг хроматина) и 2 мкл IgG (1 мг/мл) в каждой пробирке, две биологические реплики групп анализа H3K4me3 со 150 мкл ядер и 2 мкл антитела против H3K4me3 (1 мг/мл) в каждой трубке.
  3. Осторожно перемешайте раствор и оставьте трубки на горизонтальном шейкере для гибридизации на ночь при 4 °C и 12 об/мин.
  4. Предварительно охладите центрифугу до 4 °C. Приготовьте свежие 50 мл иммунопреципитационного (IP) промывочного буфера (10 мМ Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ спермидина, коктейль ингибитора протеазы 0,1%, ,0,05% мас./об.дигитонина) в центрифужной трубке объемом 50 мл. Дайте трубке посидеть на льду.
  5. Центрифугируйте трубки в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C. Удалите буфер антител из каждой трубки.
  6. Добавьте 800 мкл IP-буфера для промывки в каждую трубку и аккуратно перемешайте. Оставьте трубки на горизонтальном шейкере на 5 мин при комнатной температуре и 12 об/мин.
  7. После промывки центрифугируйте трубки в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C. Удалите супернатант с помощью наконечника пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать какого-либо нарушения гранул ядра, оставьте ~50-80 мкл буфера с ядрами.
  8. Повторите шаги 3.6.-3.7. еще два раза.
  9. После третьей промывки центрифугируют в течение 2 мин при 300 rcf при 4 °C. Удалите оставшийся буфер как можно больше.

4. Инкубация транспозазы

  1. Получают свежий 1 мл инкубационного буфера транспозазы (10 мМ Tris pH 8,0, 300 мМ NaCl, 0,5 мМ спермидина, коктейль ингибитора протеазы 0,1%, 0,05% мас./об.) путем смешивания 1 мл IP-буфера промывки с 30 мкл 5 М NaCl.
  2. Чтобы приготовить смесь транспозазы Tn5 для инкубации, добавляют 1 мкл транспозазы к каждому 150 мкл инкубационного буфера транспозазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала подготовьте смесь раствора транспозазы в соответствии с количеством реакций, а затем добавьте аликвоту по 150 мкл в каждую пробирку.
  3. Повторное суспендирование ядер 150 мкл раствора транспозазы.
  4. Оставьте пробирки на горизонтальном шейкере при 12 об/мин на 2-3 ч при комнатной температуре и перемешайте каждые 10-15 мин.
  5. После инкубации транспозазы центрифугируют пробирки в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C. Удалите инкубационный буфер транспозазы в каждой пробирке.
  6. Промывайте трубки с помощью IP-буфера для промывки. Для этого добавьте 800 мкл IP-буфера для промывки в каждую трубку, аккуратно перемешайте и оставьте трубки на горизонтальном шейкере при 12 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре.
  7. Центрифуга в течение 4 мин при 300 rcf при 4 °C. Удалите супернатант с помощью наконечника пипетки.
  8. Повторите шаги 4.6.-4.7. еще два раза.
  9. После третьей промывки центрифугируют в течение 2 мин при 300 rcf при 4 °C. Удалите оставшийся буфер как можно больше.

5. Тагментация

  1. Только что получить 2 мл буфера тегментации (10 мМ Tris pH 8,0, 300 мМ NaCl, 0,5 мМ спермидина, коктейль ингибитора протеазы 0,1%, 10 мМ MgCl2, 0,05% мас./об.дигитонина) путем смешивания 2 мл БУФЕРА ПРОМЫВКИ IP с 60 мкл 5 М NaCl и 20 мкл 1 М МгCl2.
  2. Повторное суспендирование ядер с 300 мкл буфера тегментации.
  3. Перемешать раствор и инкубировать на водяной бане при температуре 37 °C в течение 1 ч для маркировки.
  4. Прекращают тагментацию 10 мкл 0,5 М ЭДТА (конечная концентрация ~15 мМ) и 30 мкл 10% SDS (конечная концентрация 1%).

6. Извлечение ДНК и построение библиотеки NGS

  1. Добавьте 300 мкл буфера экстракции ДНК CTAB, как описано7. Инкубируйте трубки на водяной бане при температуре 65 °C в течение 30 мин. Инвертировать, чтобы перемешать каждые ~ 10 мин.
  2. Добавьте 600 мкл фенола: хлороформа: изоамилового спирта (25:24:1) в каждую пробирку. Тщательно перемешать.
  3. Предварительно центрифугируйте гелевые трубки с фазовой блокировкой в течение 2 мин при 13 000 rcf при 4 °C. Перенесите вышеуказанный раствор в фазовые гелевые трубки.
  4. Центрифуга в течение 10 мин при 13 000 rcf при 4 °C.
  5. Перенесите супернатант (~600 мкл) в новую трубку объемом 1,5 мл.
  6. Добавьте 600 мкл хлороформа в каждую пробирку. Тщательно перемешать.
  7. Центрифуга в течение 10 мин при 13 000 rcf при 4 °C.
  8. Переложите супернатант (~600 мкл) в новую пробирку объемом 1,5 мл.
  9. Добавьте 12 мкл 100% этанола и 2 мкл копреципитанта GlycoBlue. Тщательно перемешать и хранить при -20 °C в течение 1 ч.
  10. Центрифуга в течение 10 мин при 13 000 rcf при 4 °C.
  11. Декант супернатанта. Промыть гранулу ДНК с использованием 75% (v/v) этанола и центрифуги в течение 5 мин при 13 000 rcf при 4 °C.
  12. Декант супернатанта. Высушите гранулу ДНК на воздухе и повторно суспендируйте ДНК в 25 мкл ddH2O.
  13. Настройте реакцию ПЦР следующим образом. В общей сложности 50 мкл реакции добавьте 24 мкл ДНК, 11 мкл ddH2O, 10 мкл 5x TAE буфера, 2 мкл праймера P5 (10 мкМ), 2 мкл праймера P7 (10 мкМ) и 1 мкл фермента TruePrep Amplify. Программа ПЦР: 72 °C в течение 3 мин, 98 °C в течение 30 с; затем 14 циклов 98 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с, затем 72 °C в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первые 72 °C в течение 3 минут для продления не могут быть пропущены. Чрезмерная амплификация библиотеки приведет к высокому уровню дубликатов ПЦР в NGS. Начните с 12-14 циклов ПЦР в реакции ПЦР для H3K4me3 при использовании ~1 мкг хроматина в каждой реакции.
  14. Нагрузите 2 мкл препаратов ПЦР на 1,5% агарозный гель для электрофореза.
  15. Очистите продукты ПЦР с помощью коммерческих магнитных шариков для очистки ДНК.
  16. Количественно оцените библиотеку с помощью флуорометра и электрофореза агарозного геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективная концентрация библиотеки должна быть >2 нМ с помощью qPCR для обеспечения хорошего качества.
  17. Выполняйте секвенирование следующего поколения (NGS) и анализ данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показан рабочий процесс CUT&Tag. На рисунке 2 показано окрашивание DAPI интактных ядер. Целью этапа «изоляции ядер» было получение интактных ядер в достаточном количестве для последующей реакции CUT&Tag. На рисунке 3 показан электрофорез агарозного геля продуктов ПЦР. Отрицательный контроль IgG требуется параллельно при настройке эксперимента. По сравнению с контрольной группой IgG, основная часть фрагментов ДНК...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описали CUT&Tag, технологию для генерации библиотек ДНК с высоким разрешением и исключительно низким фоном с использованием небольшого количества клеток с упрощенной процедурой по сравнению с иммунопреципитацией хроматина (ChIP). Наш успех с профилированием H3K4me3 в листьях хлопка предполагает, что CUT&Tag, который был впервые разработан для клеток животных, также может быть использован для растительных клеток. Как буферная система Tris, обычно используемая для анализа ChIP8, так и буфер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы не имеют конфликта интересов с какой-либо компанией, торгующей одним из вышеупомянутых продуктов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) и Фондов фундаментальных исследований для центральных университетов, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Хайнаньского провинциального фонда естественных наук Китая (320LH002) и проекта JCIC-MCP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Антитела
Анти-H3K4me3Millipore07-473
Нормальный кролик IgGMillipore12-370
Chemicals
Bowon Serum Albumin (BSA)Приготовьте 10 мг/мл BSA стоковый раствор. Хранить при -20°С; C
дигитонин (~50% (TLC)Sigma-AldrichD141Сделайте 5% раствор дититонина стоковым (200 мг дигитонина [~50% чистоты] до 2 мл ДМСО). Примечание: Стерилизовать с помощью фильтра 0,22 микрона. Хранить при -20°С; C
диметилсульфоксид (ДМСО)
хлороформ
этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Приготовьте 0,5 М ЭДТА (pH = 8,5) исходный раствор. Примечание: Для приготовления 100 мл 0,5-М ЭДТА (pH = 8,5) требуется примерно 2 г гранул гидроксида натрия (NaOH) для регулировки pH
этанола
GlycoBlue Coprecipitant (15 мг/мл)InvitrogenAM9516
хлорид магния (MgCl2)Приготовьте 1 M MgCl2 коктейль
ингибиторов протеазыCalbiochem539133-1SET
хлорид калия (KCl)Приготовьте 1 М раствор спермидина KCl
фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1,v:v:v)
хлорид (NaCl)Приготовьте 5 М раствор
спермидинаПриготовьте 2 М раствор спермидина стоковый раствор, храните при -20°C.
Додецилсульфат натрия (SDS)Приготовьте 10% исходный раствор SDS. Примечание: Не автоклавировать; стерилизовать с помощью 0,22-микронной основы
фильтра TrisСделать 1 М Трис (pH = 8,0) стоковый раствор
Triton X-100Сделать 20% Тритон Х-100 стоковый раствор
<сильный>Фермент
Гиперактивный pG-Tn5/pA-Tn5 транспозаза для CUT& МеткаVazymeS602/S603Проверьте сродство антител к белку А или белку G, которые слиты с Tn5. Вообще говоря, белки A и G обладают широким сродством к антителам. Тем не менее, белок А имеет относительно более высокое сродство к антителам кроликов, а белок G имеет относительно более высокое сродство к антителам мыши. Выберите подходящие препараты транспозазы, которые соответствуют вашим антителам.
TruePrep Amplify Enzyme EnzymeTD601
Equipment
центрифугаEppendorf5424R
PCR машинаApplied BiosystemsABI9700
Орбитальный шейкерMIULABHS-25
NanoDrop One  спектрофотометрThermo ScientificНД-ОДИН-В
натрия NaCl

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
  2. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
  3. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).
  4. Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120(2020).
  5. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
  6. Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
  7. Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
  8. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11(2007).
  9. Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679(2021).
  10. Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
  11. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

H3K4me3 ModificationCUT And TagChromatin ProfilingPlant EpigenomicsNuclei IsolationHistone ModificationTn5 TransposaseAntibody IncubationDNA FragmentationHigh Throughput Sequencing

Похожие статьи