Method Article

Рассечение волокон одиночных скелетных мышц для иммунофлуоресцентного и морфометрического анализа цельномышечных соединений

DOI:

10.3791/62620

⸱

August 14th, 2021

 ,  , 
1Developmental Biology Laboratory, Histology and Embryology Department, Faculty of Medicine, Universidad de la República, 2Cell and Molecular Neurobiology Laboratory, Clemente Estable Biology Research Institute (IIBCE), Ministerio de Educación y Cultura

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность точно обнаруживать компоненты нервно-мышечного соединения имеет решающее значение при оценке изменений в его архитектуре из-за патологических процессов или процессов развития. Здесь мы представляем полное описание простого метода получения высококачественных изображений цельномонтных нервно-мышечных соединений, которые могут быть использованы для выполнения количественных измерений.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нервно-мышечное соединение (NMJ) является специализированной точкой контакта между двигательным нервом и скелетной мышцей. Этот периферический синапс проявляет высокую морфологическую и функциональную пластичность. При многочисленных расстройствах нервной системы NMJ является ранней патологической мишенью, приводящей к сбою нейротрансмиссии, слабости, атрофии и даже к гибели мышечных волокон. Благодаря своей актуальности, возможность количественно оценить определенные аспекты взаимосвязи между компонентами NMJ может помочь понять процессы, связанные с его сборкой/разборкой. Первым препятствием при работе с мышцами является получение технической экспертизы для быстрого выявления и рассечения без повреждения их волокон. Вторая проблема заключается в использовании высококачественных методов обнаружения для получения изображений NMJ, которые могут быть использованы для выполнения количественного анализа. В данной статье представлен пошаговый протокол рассечения разгибателя digitorum longus и камошистых мышц у крыс. Это также объясняет использование иммунофлуоресценции для визуализации пред- и постсинаптических элементов цельномонтных NMJ. Полученные результаты демонстрируют, что этот метод может быть использован для установления микроскопической анатомии синапса и выявления тонких изменений в состоянии некоторых его компонентов при физиологических или патологических состояниях.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нервно-мышечное соединение млекопитающего (NMJ) представляет собой большой холинергический трехсторонний синапс, состоящий из нервного окончания двигательного нейрона, постсинаптической мембраны на скелетно-мышечном волокне и концевые шванновские клетки1,2,3. Этот синапс проявляет высокую морфологическую и функциональную пластичность4,5,6,7,8даже во взрослом возрасте, когда NMJ могут подвергаться динамическим струк....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на животных выполнялись в соответствии с руководящими принципами Национального закона No 18611 об уходе за животными, используемыми в экспериментальных целях. Протокол был одобрен Институциональным этическим комитетом (CEUA IIBCE, Протокол No 004/09/2015).

1. Рассечение мышц (День 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом делайте 40 мл 0,5% параформальдегида (PFA), pH 7,4 в фосфатном физиологическом растворе Dulbecco (DPBS). Опционально сделайте 20 мл 4% PFA. Приготовить 5 мл аликвот и заморозить при -20 °C. В день рассечения разморозьте 4% аликвот и добавьте 35 мл DPBS для получения 40 мл 0,5% PFA.

  1. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предлагает простой метод выделения и иммуноокрашивания мышечных волокон из двух различных типов мышц (мышцы быстрого и медленного подергивания, см. Рисунок 1). Используя правильные маркеры и/или зонды, компоненты NMJ могут быть обнаружены и оценены с количественной точки зрения для оценки некоторых морфологических изменений, которые могут возникнуть в результате прогрессирования заболевания или специфического медикаментозного лечения. В настоящем исследовании пресинаптические и.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем подробный протокол рассечения двух скелетных мышц крыс (одна медленно дергается, а другая быстро дергается), выделения волоконных мышц и иммунофлуоресцентного обнаружения пред- и постсинаптических маркеров для количественной оценки изменений NMJ, а также процессов сборки / разборки. Этот вид протокола может быть полезен в моделях41,42 грызунов для оценки NMJ во время физиологических или патологических процессов, как покажет здесь в м.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большое спасибо CSIC и PEDECIBA за финансовую поддержку, оказанную этой работе; Наталье Розано за исправление рукописи; Марсело Касакуберте, который снимает видео, и Николасу Болатто за то, что он одолжил свой голос для него.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Стереомикроскоп с подсветкой холодным светомNikonSMZ-10A
Качалочная платформаBiometra (WT 16)042-500
Чехлы для очков (24 x 32 мм)DeltalabD102432
Premium (Plus) предметные стекла для микроскопаPORLABPC-201-16
ПинцетF.S.T11253-20
Uniband LA-4C Ножницы 125 ммE.M.S77910-26
Одноразовые хирургические лезвия # 10Sakira Medical1567
Одноразовый стерильный шприц (1 мл)Sakira Medical1569
Super PAP penE.M.S71310
100 μ l или 200 μ l пипеткаFinnpipette9400130
конфокальный микроскопZeissLSM 800 - AiryScan
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H крысыTaconic2148-M
1X PBS (Dulbecco)Gibco21600-010
ПараформальдегидSigma158127
Triton X-100SigmaT8787
ГлицинАмреско167
BSABio Basic INC.9048-46-8
ГлицеринMallinckrodt5092
TrisAmresco497
Очищенный антинейрофиламент H (NF-H), фосфорилированное антителоBioLegend801601ранее Covance # SMI 31P
Очищенный антинейрофиламент H (NF-H), нефосфорилированное антителоBioLegend801701ранее Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 козий антимышиный IgG (H+L)Thermo ScientificA11029
α-бунгаротоксин, биотин-XX конъюгатInvitrogenB1196
стрептавидин, Alexa Fluor 555 конъюгатInvitrogenS32355
Diaminophenylindole (DAPI)SigmaD8417

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
  2. Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neur....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neuromuscular JunctionMuscle Fiber DissectionImmunofluorescent AnalysisMorphometric AnalysisWhole Mount PreparationConfocal MicroscopyPre Synaptic ElementsPost Synaptic ElementsSkeletal Muscle FibersTransgenic Animal Models

Related Articles