Здесь мы описываем протокол упаковки псевдовирусов и измерения нейтрализующей активности антител.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Получение псевдотипированных вирусов гриппа птиц H5 методом трансфекции фосфата кальция и измерение нейтрализующей активности антител
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
С 1996 года высокопатогенные вирусы птичьего гриппа (ВППГ) H5 линии A/goose/Guangdong/1/96 вызывают вспышки гриппа среди домашней и дикой птиц. Иногда люди также становятся его жертвами, что приводит к высокой смертности. Тем не менее, исследования вируса ВППГ часто затруднены, учитывая, что они должны проводиться в лабораториях уровня биобезопасности 3. Чтобы решить эту проблему, псевдовирусы используются в качестве альтернативы вирусам дикого типа в некоторых экспериментах исследований H5 HPAI. Псевдовирусы оказываются идеальными инструментами для изучения нейтрализующих антител против вирусов H5 HPAI. В этом протоколе описываются процедуры и критические этапы псевдовирусных препаратов H5 HPAI и анализов псевдовирусной нейтрализации. Кроме того, в нем обсуждаются устранение неполадок, ограничения и модификации этих анализов.
Введение
С 1996 года высокопатогенные вирусы птичьего гриппа (ВППГ) H5 линии A/goose/Guangdong/1/96 вызывают постоянные вспышки гриппа среди домашней птицы и диких птиц, что приводит к огромным социально-экономическим потерям в мировой птицеводческой промышленности. Иногда им заражаются и люди, сталкиваясь с высокой летальностью 1,2. Тем не менее, исследования вируса ВППГ часто затруднены, учитывая, что им нельзя заниматься за пределами лабораторий уровня биобезопасности 3. Чтобы решить эту проблему, псевдовирусы используются в качестве альтернативы вирусам дикого типа в некоторых экспериментах исследований H5 HPAI. Пс....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все экспериментальные операции, связанные с псевдовирусом, проводились в условиях ABSL2 в Институте Пастера Шанхайской китайской академии наук (IPS, CAS). Эксперименты на животных проводились на основе протоколов IPS, CAS, одобренных Комитетом по уходу за животными и их использованию.
1. Упаковка псевдовируса с кальций-фосфатной трансфекцией
- Делают одноклеточные суспензии из HEK293FT клеток (9 х10,5 на мл) в полной среде DMEM (табл. 1). Добавьте 10 мл одноклеточной суспензии в колбу T75, инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% углекислым газом (CO2) в течение....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Экспрессия белка HA, NA и ВИЧ-1 p24 псевдовируса гриппа
Чтобы определить эффективность упаковки вируса, запасы псевдовируса гриппа были впервые обнаружены с помощью анализа HA (рис. 2A). Единицы ГК на миллилитр псевдовирусов гриппа составляют 643 (табл. 3). Вестерн-блоттинг и сэндвич-анализы ИФА использовались для проверки экспрессии белка HA, NA и ВИЧ-1 p24. Затем были рассчитаны соотношения единицы ГК и количества gag p24 для псевдовирусов. Результаты в.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
HEK293FT клетки обычно используются в качестве упаковочных клеток для производства псевдовирусов. Регулярное обнаружение микоплазмы имеет важное значение во время культивирования клеток. Заражение микоплазмой может резко снизить выход псевдовируса, а иногда и близко к нулю. По сравнению с другими загрязнениями, микоплазменные загрязнения не приводят к изменению значения рН или помутнению питательной среды клеток. Даже высокая концентрация микоплазмы не видна невооруженным глазом или под микроскопом. Тремя популярными мет.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Проекта по наращиванию инновационного потенциала провинции Цзянсу (BM2020019), Шэньчжэньского научно-технического проекта (No. JSGG20200225150702770), Стратегическая приоритетная исследовательская программа Китайской академии наук (XDB29030103), Гуандунский научно-технический проект (No 2020B1111340076) и Программа открытых исследований лаборатории Шэньчжэньского залива (No 2020B111340076) и Программа открытых исследований лаборатории Шэньчжэньского залива (No 2020B1111340076) и Программа открытых исследований лаборатории Шэньчжэньского залива (No 2020B1111340076). SZBL202002271003).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Реагент |
| 96-луночные планшеты для клеточных культур (плоское дно) | Thermo fisher научный | 167008 | расходный материал |
| 96-луночные планшеты для клеточных культур (круглое дно) | Thermo fisher Scientific | 163320 | расходный материал |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Оборудование/Центрифуга |
| BD Инсулиновые шприцы | BD | 324910 | расходный материал |
| Кальция хлорид безводный | AMRESCO | 1B1110-500G Реагент | |
| хлорохин дифосфат | Selleck | S4157 | Реагент |
| Dulbecco' s Модифицированная среда Eagle (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Реагент |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | Gibco | 16000-044 | Реагент |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Клеточная линия |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Реагент |
| HIV-1 p24 Антиген ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | набор реагентов |
| Luciferase Assay System Морозильная камера Pack | Promega | E4530 | Набор реагентов |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Клеточная линия |
| Микроцентрифужные пробирки 1,5 мл | Thermo fisher научный | 509-GRD-Q | расходный материал |
| Nunc Конические центрифужные пробирки 15 мл | Thermo fisher научный | 339650 | расходный материал |
| Nunc Конические центрифуговые пробирки 50 мл | Thermo fisher научный | 339652 | расходный материал |
| Nunc EasYFlask 75 см<суп>2 | Thermo fisher научный | 156499 | расходный материал |
| Пенициллин-стрептомицин | Gibco | 15140-122 | Наконечники |
| пипеток реагента (10 & мкм; L) | Термофишер научный | TF102-10-Q | расходный материал |
| Наконечники для пипеток (100 μ L) | Термофишер научный | TF113-100-Q | расходный материал |
| Наконечники для пипеток (1000 μ L) | Термофишер научный | TF112-1000-Q | расходный материал |
| Серологические пипетки (5 мл) | Термофишер научный | 170355N | расходный материал |
| Серологические пипетки (10 мл) | Термофишер научный | 170356N | расходный материал |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Реагент |
| Varioskan Flash | Thermo fisher научный | --Оборудование | /Считыватель микропланшетов |
| Инкубатор с водяной рубашкой | Термофишер научный | 3111 | Оборудование/Клеточный инкубатор |
| Пентобарбитал натриевая соль | Сигма | 57-33-0 | Реагент |
Ссылки
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
