Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Получение псевдотипированных вирусов гриппа птиц H5 методом трансфекции фосфата кальция и измерение нейтрализующей активности антител

2.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62626

⸱

22 ноября 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nanjing Advanced Academy of Life and Health, 2Institute of Animal Bio-technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, 3National Clinical Research Center for Infectious Diseases, Shenzhen Third People’s Hospital, Southern University of Science and Technology, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем протокол упаковки псевдовирусов и измерения нейтрализующей активности антител.

Аннотация

С 1996 года высокопатогенные вирусы птичьего гриппа (ВППГ) H5 линии A/goose/Guangdong/1/96 вызывают вспышки гриппа среди домашней и дикой птиц. Иногда люди также становятся его жертвами, что приводит к высокой смертности. Тем не менее, исследования вируса ВППГ часто затруднены, учитывая, что они должны проводиться в лабораториях уровня биобезопасности 3. Чтобы решить эту проблему, псевдовирусы используются в качестве альтернативы вирусам дикого типа в некоторых экспериментах исследований H5 HPAI. Псевдовирусы оказываются идеальными инструментами для изучения нейтрализующих антител против вирусов H5 HPAI. В этом протоколе описываются процедуры и критические этапы псевдовирусных препаратов H5 HPAI и анализов псевдовирусной нейтрализации. Кроме того, в нем обсуждаются устранение неполадок, ограничения и модификации этих анализов.

Введение

С 1996 года высокопатогенные вирусы птичьего гриппа (ВППГ) H5 линии A/goose/Guangdong/1/96 вызывают постоянные вспышки гриппа среди домашней птицы и диких птиц, что приводит к огромным социально-экономическим потерям в мировой птицеводческой промышленности. Иногда им заражаются и люди, сталкиваясь с высокой летальностью 1,2. Тем не менее, исследования вируса ВППГ часто затруднены, учитывая, что им нельзя заниматься за пределами лабораторий уровня биобезопасности 3. Чтобы решить эту проблему, псевдовирусы используются в качестве альтернативы вирусам дикого типа в некоторых экспериментах исследований H5 HPAI. Псевдовирусы достаточно безопасны для применения в лабораториях 2-го уровня биобезопасности.

Псевдовирусы H5 HPAI относятся к химерным вирусам, состоящим из ядер суррогатных вирусов, липидных оболочек с поверхностными гликопротеинами вирусов гриппа и репортерных генов. Ядра псевдовирусов обычно получают из лентивирусного вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), ретровирусов, таких как вирус мышиного лейкоза (MLV) и вирус везикулярного стоматита (VSV)3. В частности, система упаковки ВИЧ-1 широко используется для производства псевдовируса гриппа, где основными предоставленными генами являются gag и pol. Ген кляпа ВИЧ экспрессирует основные белки. Ген pol экспрессирует интегразу и обратную транскриптазу, обе из которых необходимы для экспрессии репортерного гена в трансдуцированных клетках. Имитируя геном суррогатного вируса, репортерный ген включается в ядро псевдовируса в форме РНК. Репортерный ген будет экспрессировать белок в клетках-хозяевах. Уровни экспрессии генов-репортеров могут быть использованы для измерения эффективности псевдовирусной инфекции 3,4. Основным репортером является люцифераза светлячка для измерения относительных единиц люминесценции (RLU) или относительной активности люциферазы (RLA) в трансдуцируемых клетках. Другие репортеры, такие как lacZ, Gaussia и люцифераза Renilla, также используются, только в меньшей степени5.

Псевдовирусы являются идеальными инструментами для изучения нейтрализующих антител против вирусов H5 Hapi. Для измерения активности нейтрализующих антител используются анализы псевдовирусной нейтрализации (ПН)6. Гемагглютинин (ГК) и нейраминидаза (НА) являются гликопротеинами на поверхности вируса гриппа А 7,8. Гиалуроновая кислота состоит из домена глобулярной головки для связывания рецепторов и стволового домена для слияния мембран. Белок NA обладает сиалидазной активностью, облегчающей высвобождение вируса 7,8. Анализ ПН может измерять нейтрализующие антитела, направленные на белки ГК. Нейтрализующие антитела, направленные на головную и стволовую область ГК, также могут быть обнаружены с помощью анализов прикрепления и проникновения вируса. По сравнению с вирусами дикого типа эксперименты по нейтрализации псевдовирусов имеют более чувствительные значения обнаружения, могут безопасно обрабатываться в лаборатории биобезопасности уровня 2 и, как правило, легче работать на практике.

В этом протоколе подробно представлены процедуры и критические этапы псевдовирусных препаратов H5 HPAI и анализов PN. Кроме того, в нем обсуждаются устранение неполадок, ограничения и модификации этих анализов. В этом исследовании в качестве примера использовался штамм A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) из вирусов H5N1 HPAI. Для получения иммунных сывороток, используемых в анализах, в этом протоколе был выбран белок HA, происходящий из штамма TH, в качестве иммуногена для иммунизации мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные операции, связанные с псевдовирусом, проводились в условиях ABSL2 в Институте Пастера Шанхайской китайской академии наук (IPS, CAS). Эксперименты на животных проводились на основе протоколов IPS, CAS, одобренных Комитетом по уходу за животными и их использованию.

1. Упаковка псевдовируса с кальций-фосфатной трансфекцией

  1. Делают одноклеточные суспензии из HEK293FT клеток (9 х10,5 на мл) в полной среде DMEM (табл. 1). Добавьте 10 мл одноклеточной суспензии в колбу T75, инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% углекислым газом (CO2) в течение 20 ч перед трансфекцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется HEK293FT низкий проход (<20 проходов). Убедитесь, что монослой ячейки сливается на 80-90%.
  2. Замените среду 10 мл свежей полной среды, содержащей хлорохин (100 мкМ), за 2 ч до трансфекции.
  3. Смешайте реагенты и плазмидную ДНК, как показано в таблице 2 и на рисунке 1: ddH 2 O, pCMV / R-HA, pCMV / R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl2и 2x буфер HEPES. Пипеткой вверх и вниз 5 раз аккуратно, инкубируйте смесь при комнатной температуре (RT) в течение 20 минут.
  4. Перелейте смесь в среду над ячейками и аккуратно встряхните колбу. Инкубируют клетки в клеточном инкубаторе в течение 15 ч.
  5. Замените среду 15 мл свежей полной среды DMEM. Инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 65 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет среды будет светло-оранжевым или слегка желтым, и, по крайней мере, 80% клетки должны проявлять цитопатический эффект (CPE) под микроскопом с инвертированным светом.
  6. Соберите надосадочную жидкость и центрифугируйте ее при 2095 x g в течение 20 мин при 4 ° C. Соберите надосадочную жидкость, аликвотируйте ее и храните при температуре -80 °C.

2. Обнаружение экспрессии белка HA, NA и р24 ВИЧ-1 псевдовируса гриппа

  1. Определите экспрессию белка HA с помощью анализа гемагглютинина (HA).
    1. Добавьте 50 мкл PBS в столбцы 2-12, ряды A, B и C 96-луночной пластины с круглым дном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Строки A, B и C относятся к 3 независимым тестам репликации, а столбец 12 используется в качестве отрицательного контроля.
    2. Добавьте 100 мкл псевдовируса в лунки колонки 1. Перенесите 50 мкл из колонки 1 в колонку 2, хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз 5 раз, выполните двукратное разведение до последней колонки 11 и выбросьте лишние 50 мкл из колонки 11.
    3. Добавьте по 50 мкл 0,5% эритроцита в каждую лунку, аккуратно проведите пипеткой вверх и вниз дважды. Инкубируйте планшет в течение 30-60 мин при RT или до тех пор, пока эритроциты отрицательного контроля не образуют обычные пятна на дне лунки.
    4. Наблюдайте и записывайте титры ГК псевдовируса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Единица ГК псевдовирусов является самым высоким коэффициентом разбавления вируса, который может вызвать 100% гемагглютинацию эритроцитов.
  2. Обнаружение экспрессии белков HA и NA с помощью вестерн-блоттинга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы вестерн-блоттинга выполняются в соответствии с руководством по молекулярному клонированию (4-е издание).
  3. Определите экспрессию белка ВИЧ-1 р24 с помощью набора ИФА ВИЧ-1 р24 (таблица материалов).
    1. Добавьте 50 мкл буфера для лизиса в 450 мкл образца псевдовируса. Тщательно перемешайте.
    2. Добавьте 300 мкл буфера для промывки в каждую лунку микропланшета. Ударьте по перевернутой пластине, чтобы полностью удалить буфер для стирки. Повторите стирку 5 раз.
    3. Добавьте 200 мкл стандарта и образцов в каждую лунку отдельно. Инкубируйте их при температуре 37 °C в течение ночи или в течение 2 часов.
    4. Аспирируйте содержимое пластины и вымойте пластину, как описано в шаге 2.3.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте одну лунку пробирной пластины пустой, чтобы использовать ее в качестве заготовки подложки.
    5. Добавьте 200 мкл антител детектора p24 в каждую лунку. Инкубируйте их при температуре 37 °C в течение 1 часа. Аспирируйте и вымойте пластину, как описано в шаге 2.3.2.
    6. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора стрептавидин-пероксидазы и инкубируйте их при 37 °C в течение 30 мин. Аспирируйте и вымойте пластину, как описано в шаге 2.3.2.
    7. Добавьте по 100 мкл рабочего раствора субстата в каждую лунку, включая заготовку субстрата, и инкубируйте их при 37 °C в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синий цвет будет развиваться в скважинах.
    8. Добавьте 100 мкл стоп-буфера в каждую лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синий цвет сразу же изменится на желтый.
    9. Считывание оптической плотности при длине волны 450 нм в течение 15 минут. Запишите титры р24 псевдовируса

3. Титрование псевдовирусов

  1. Сделайте одноклеточные суспензии клеток MDCK (5 x 104 на мл) в полной среде DMEM, добавьте 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 и 40000 клеток в разные лунки 96-луночной плоскодонной пластины. Инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 20 часов.
  2. Достаньте псевдовирус из холодильника с температурой -80 °C, разморозьте его на льду и встряхните псевдовирус.
  3. Добавьте 6 псевдовирусов HAU (6x единиц HA) в каждую лунку 96-луночной круглодонной пластины и пополните каждую лунку полным DMEM до 120 мкл.
  4. Пипеткой вверх и вниз по смеси 5 раз, чтобы тщательно перемешать. Инкубируйте смесь в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 1 часа.
  5. Перенесите 100 мкл смеси в ячейки 96-луночного планшета. Поместите планшет для клеточных культур обратно в инкубатор на 48, 60 и 72 часа после заражения вирусом.
  6. Достаньте тарелку из инкубатора и проведите анализ люциферазы (Таблица материалов).
  7. Осторожно извлеките средство из лунок тарелки. Промойте клетки 200 мкл PBS и удалите PBS как можно больше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переверните пластину и выбросьте надосадочную жидкость, нанеся ее на впитывающую бумагу. Если тестовая клеточная линия не может прочно прикрепиться к дну, осторожно удалите аспирацию среды.
  8. Добавьте 50 мкл лизисного буфера в каждую лунку и несколько раз встряхните культуральную пластину. Храните тарелку при температуре -80 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте 1 объем 5-кратного буфера для лизиса с 4 объемами воды, чтобы получился 1-кратный буфер для лизиса. Перед использованием уравновесьте 1x буфер лизиса до RT. Качните пластину, чтобы убедиться, что клетки полностью покрыты буфером лизиса. Один процесс замораживания-оттаивания может помочь полностью лизировать клетку.
  9. Выньте тарелку, уравновесьте при РТ в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетка должна быть полностью лизирована.
  10. Осторожно покачайте пластину несколько раз и перенесите все лизаты клеток на непрозрачные 96-луночные пластины.
  11. Добавьте 50 мкл субстрата в каждую лунку, аккуратно встряхните пластину несколько раз и тщательно перемешайте субстрат и буфер для лизиса.
  12. Измерьте свет, производимый в течение 5 минут, с помощью люминометра. Запишите титры люциферазы псевдовируса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда добавляется надлежащий субстрат, свет излучается как побочный продукт в результате химической реакции, в которой люциферин превращается в оксилюциферин ферментом люциферазой. Количество производимого света пропорционально количеству фермента люциферазы.

4. Подготовка иммунных сывороток

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунная сыворотка будет использоваться для экспериментов, связанных с клетками, и экспериментальная операция должна проводиться в асептических условиях.

  1. Подготовьте 12 восьминедельных самок мышей BALB/c. Разделите мышей поровну на две группы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одна группа была группой DDV, а другая - отрицательной контрольной группой.
  2. Групповая иммунизация DDV: дважды внутримышечно вводят 100 мкг кодон-оптимизированной плазмиды ДНК, кодирующей белок HA A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) на 0-й и 3-й неделях, и однократно внутрибрюшинно усиливают 512 вирусоподобных частиц HAU TH (VLP) на 6-й неделе.
  3. Иммунизация контрольной группы: дважды внутримышечно вводят 100 мкг пустой векторной плазмидной ДНК на 0-й и 3-й неделе и однократно интраперитонельно повышают ВИЧ-1 на 6-й неделе.
  4. Соберите кровь мыши через 2 недели после последней иммунизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мышей анестезировали пентобарбиталом натрия (65 мг / кг) во время сбора крови. После забора крови из подчелюстной вены мышей немедленно усыпляли CO2.
  5. Держите кровь в режиме ЛТ в течение 2 ч, затем 4 ° C в течение ночи. Центрифугу при 900 x g в течение 10 мин при 4 °C и собирают надосадочную жидкость. Инактивируйте сыворотку, поместив ее при 56 ° C на 30 мин.
  6. Храните иммунные сыворотки в холодильнике при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На дополнительном рисунке 1 приведена блок-схема, описывающая основные процедуры иммунизации мышей.

5. Анализ псевдовирусной нейтрализации (ПН)

  1. Сделайте одноклеточные суспензии клеток MDCK (5 x 104 на мл) в полной среде DMEM и добавьте 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночной пластины с плоским дном. Инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 20 часов.
  2. Достаньте псевдовирус и сыворотки из холодильника с температурой -80 °C, разморозьте их на льду и тщательно перемешайте.
  3. Разбавьте сыворотки в полной среде 20 раз и добавьте 100 мкл полной среды DMEM в лунки 96-луночной круглодонной пластины из колонок 2-10.
  4. Добавьте 200 мкл разбавленной сыворотки в лунки колонки 2, перенесите 100 мкл из колонки 2 в колонку 3, разбавьте сыворотку до 1:20, 1:40, 1:80 и т.д. до 1:10240 последовательно из колонки 2 в колонку 10 и отбросьте 100 мкл из колонки 10.
  5. Добавьте 100 мкл полной среды DMEM в лунки колонны 11 в качестве отрицательного контроля.
  6. Добавьте по 100 мкл псевдовирусов в каждую лунку, тщательно проведите пипеткой вверх и вниз по смеси 5 раз и инкубируйте пластину смеси при температуре 37 °C, 5% CO2 в течение 1 часа.
  7. Перенесите 100 мкл смеси из 96-луночной пластины с круглым дном в соответствующую лунку 96-луночной пластины для культивирования клеток. Поместите пластину обратно в инкубатор (37 °C, 5% CO2) на 60 часов.
  8. Выньте тарелку из инкубатора. Выполните анализ люциферазы, как описано в шагах 3.7-3.12.

6. Анализ прикрепления псевдовирусов

  1. Сделайте одноклеточные суспензии клеток MDCK (4 x 104 на мл) в полной среде DMEM и добавьте суспензии клеток 100 мкл в каждую лунку в 96-луночной пластине с плоским дном. Инкубировать клетки при 37 °C, 5%CO2 в течение 20 ч.
  2. Инкубируйте псевдовирус с сыворотками в DMEM, содержащем 1% BSA, при 4 ° C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем смеси составляет 100 мкл.
  3. Блокируйте ячейки MDCK 100 мкл на лунку DMEM, содержащую 1% BSA, при 4 ° C в течение 1 часа.
  4. Инокулируют смесь псевдовируса и сыворотки (100 мкл) на монослой MDCK и инкубируют при 4 °C в течение 2 часов.
  5. Промойте клеточную пластину 4 раза PBS, содержащим 1% BSA, чтобы удалить любой несвязанный вирус.
  6. Лизируйте клетки 100 мкл буфера для лизиса люциферазы при RT в течение 30 мин.
  7. Количественно определите количество связанного вируса на клетках с помощью набора ИФА ВИЧ-1 p24, как описано выше (раздел 2.3).

7. Оценка проникновения вируса

  1. Сделайте одноклеточные суспензии клеток MDCK (5 x 104 на мл) в полной среде DMEM и добавьте 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночной пластины с плоским дном. Инкубируют клетки при 37 °C, 5%CO2 в течение 20 ч перед анализом.
  2. Инокулируйте псевдовирус (100 мкл) на монослой MDCK в 96-луночном планшете при 4 ° C в течение 6 часов.
  3. Промойте клеточную пластину 4 раза PBS, содержащим 1% BSA, чтобы удалить несвязанные псевдовирусы.
  4. Добавьте 100 мкл серийно разбавленной иммунной сыворотки или сыворотки от фиктивных вакцинированных мышей в DMEM, содержащих 1% BSA, в монослой и инкубируйте клетку при 4 ° C в течение 2 ч.
  5. Удалите надосадочную жидкость клетки и промойте клеточную культуральную пластину 4 раза PBS, содержащим 1% BSA.
  6. Добавьте свежий DMEM в клетки и инкубируйте в течение 60 часов в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 .
  7. Измерьте относительную активность люциферазы (RLA) клеток, как описано в шагах 3.7-3.12.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусная запись, как указано RLA, была выражена в процентах от показаний, полученных в отсутствие сывороток, которые были установлены как 100%.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Экспрессия белка HA, NA и ВИЧ-1 p24 псевдовируса гриппа
Чтобы определить эффективность упаковки вируса, запасы псевдовируса гриппа были впервые обнаружены с помощью анализа HA (рис. 2A). Единицы ГК на миллилитр псевдовирусов гриппа составляют 643 (табл. 3). Вестерн-блоттинг и сэндвич-анализы ИФА использовались для проверки экспрессии белка HA, NA и ВИЧ-1 p24. Затем были рассчитаны соотношения единицы ГК и количества gag p24 для псевдовирусов. Результаты в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

HEK293FT клетки обычно используются в качестве упаковочных клеток для производства псевдовирусов. Регулярное обнаружение микоплазмы имеет важное значение во время культивирования клеток. Заражение микоплазмой может резко снизить выход псевдовируса, а иногда и близко к нулю. По сравнению с другими загрязнениями, микоплазменные загрязнения не приводят к изменению значения рН или помутнению питательной среды клеток. Даже высокая концентрация микоплазмы не видна невооруженным глазом или под микроскопом. Тремя популярными мет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Проекта по наращиванию инновационного потенциала провинции Цзянсу (BM2020019), Шэньчжэньского научно-технического проекта (No. JSGG20200225150702770), Стратегическая приоритетная исследовательская программа Китайской академии наук (XDB29030103), Гуандунский научно-технический проект (No 2020B1111340076) и Программа открытых исследований лаборатории Шэньчжэньского залива (No 2020B111340076) и Программа открытых исследований лаборатории Шэньчжэньского залива (No 2020B1111340076) и Программа открытых исследований лаборатории Шэньчжэньского залива (No 2020B1111340076). SZBL202002271003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1% Chiken ErythrocyteBio-channelBC-RBC-C001Реагент
96-луночные планшеты для клеточных культур (плоское дно)Thermo fisher научный167008расходный материал
96-луночные планшеты для клеточных культур (круглое дно)Thermo fisher Scientific163320расходный материал
Allegra X-15RBeckman coulter--Оборудование/Центрифуга
BD Инсулиновые шприцыBD324910расходный материал
Кальция хлорид безводныйAMRESCO1B1110-500G Реагент
хлорохин дифосфатSelleckS4157Реагент
Dulbecco' s Модифицированная среда Eagle (DMEM)Gibco12100-046Реагент
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаGibco16000-044Реагент
HEK293FTGibcoR700-07Клеточная линия
HEPES FREE ACIDAMRESCO0511-250GРеагент
HIV-1 p24 Антиген ELISAZeptoMetrix801111набор реагентов
Luciferase Assay System Морозильная камера PackPromegaE4530Набор реагентов
MDCK.1ATCCCRL-2935Клеточная линия
Микроцентрифужные пробирки 1,5 млThermo fisher научный509-GRD-Qрасходный материал
Nunc Конические центрифужные пробирки 15 млThermo fisher научный339650расходный материал
Nunc Конические центрифуговые пробирки 50 млThermo fisher научный339652расходный материал
Nunc EasYFlask 75 см<суп>2Thermo fisher научный156499расходный материал
Пенициллин-стрептомицинGibco15140-122Наконечники
пипеток реагента (10 & мкм; L)Термофишер научныйTF102-10-Qрасходный материал
Наконечники для пипеток (100 μ L)Термофишер научныйTF113-100-Qрасходный материал
Наконечники для пипеток (1000 μ L)Термофишер научныйTF112-1000-Qрасходный материал
Серологические пипетки (5 мл)Термофишер научный170355Nрасходный материал
Серологические пипетки (10 мл)Термофишер научный170356Nрасходный материал
Trypsin/EDTAGibco25200-072Реагент
Varioskan FlashThermo fisher научный--Оборудование/Считыватель микропланшетов
Инкубатор с водяной рубашкойТермофишер научный3111Оборудование/Клеточный инкубатор
Пентобарбитал натриевая сольСигма57-33-0Реагент
для

Ссылки

  1. Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
  2. Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854(2017).
  3. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963(2018).
  4. Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311(2020).
  5. Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
  6. Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
  7. Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
  8. Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
  9. Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
  10. Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
  11. Michael, R. G., Joseph, S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2012).
  12. Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
  13. Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
  14. Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
  15. Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69(2020).
  16. Luciferase assay system. , Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021).
  17. Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Псевдовирус H5вирус гриппа птицанализ нейтрализации псевдовирусаанализ гемагглютининалюциферазный анализклетки MDCKвестерн-блоттингуровень биологической безопасности
Получение псевдотипированных вирусов гриппа птиц H5 методом трансфекции фосфата кальция и измерение нейтрализующей активности антител
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.