2D и 3D индуцированные человеком плюрипотентные модели на основе стволовых клеток для рассечения первичного поражения ресничек во время неокортикального развития

Lucile Boutaud; Marie Michael; Céline Banal; Damelys Calderon; Sarah Farcy; Julie Pernelle; Nicolas Goudin; Camille Maillard; Clémantine Dimartino; Cécile Deleschaux; Sébastien Dupichaud; Corinne Lebreton; Sophie Saunier; Tania Attié-Bitach; Nadia Bahi-Buisson; Nathalie Lefort; Sophie Thomas

doi:10.3791/62667

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

2D и 3D индуцированные человеком плюрипотентные модели на основе стволовых клеток для рассечения первичного поражения ресничек во время неокортикального развития

3.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62667

⸱

25 марта 2022 г.

Lucile Boutaud^*¹ , Marie Michael^*¹ , Céline Banal² , Damelys Calderon¹ , Sarah Farcy¹ , Julie Pernelle¹ , Nicolas Goudin³ , Camille Maillard¹ , Clémantine Dimartino¹ , Cécile Deleschaux¹ , Sébastien Dupichaud⁴ , Corinne Lebreton¹ , Sophie Saunier¹ , Tania Attié-Bitach¹^,⁵ , Nadia Bahi-Buisson¹^,⁶ , Nathalie Lefort² , Sophie Thomas¹

¹Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, ²Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, ³Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, ⁴Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, ⁵Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, ⁶Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем подробные протоколы для генерации и характеристики 2D и 3D моделей неокортикального развития на основе 2D и 3D индуцированных человеком стволовых клеток (hIPSC), а также дополнительные методологии, позволяющие качественно и количественно анализировать биогенез и функцию первичной реснички (ПК).

Аннотация

Первичные реснички (ПК) представляют собой неподвижные динамические органеллы на основе микротрубочек, которые выступают из поверхности большинства клеток млекопитающих. Они выходят из более старой центриолы во время фазы G1 / G0 клеточного цикла, в то время как они разбираются, когда клетки возвращаются в клеточный цикл на границе фазы G2 / M. Они функционируют как концентраторы сигналов, обнаруживая и преобразуя внеклеточные сигналы, имеющие решающее значение для многих клеточных процессов. Как и в большинстве типов клеток, все неокортикальные нервные стволовые и прогениторные клетки (НСПК) содержат ПК, позволяющий им ощущать и передавать специфические сигналы, необходимые для нормального развития коры головного мозга. Здесь мы предоставляем подробные протоколы для создания и характеристики двумерных (2D) и трехмерных (3D) клеточных моделей из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hIPSC) для дальнейшего анализа участия ПК во время неокортикального развития. В частности, мы представляем протоколы для изучения биогенеза и функции ПК в 2D-нейронных розетках NFPC, включая трансдукцию пути Sonic Hedgehog (SHH). Чтобы воспользоваться преимуществами трехмерной (3D) организации церебральных органоидов, мы опишем простой метод 3D-визуализации иммуноструктурированных церебральных органоидов. После оптической очистки быстрое получение целых органоидов позволяет обнаруживать как центросомы, так и ПК на неокортикальных предшественниках и нейронах всего органоида. Наконец, мы подробно описываем процедуру иммуноокрашения и очистки толстых свободно плавающих органоидных срезов, сохраняющих значительную степень пространственной 3D-информации и позволяющих получать данные с высоким разрешением, необходимые для детального качественного и количественного анализа биогенеза и функции ПК.

Введение

Первичные реснички (ПК) представляют собой органеллы на основе микротрубочек, которые чувствуют и передают множество химических и механических сигналов из внеклеточной среды. В частности, ПК является центральной органеллой для трансдукции сигнального пути Ежа у позвоночных1,2. В то время как большинство нервных клеток уже давно имеют ПК, вклад этой органеллы в формирование центральной нервной системы уже давно недооценен. Исследования неокортикального развития привели к открытию нескольких нервных стволовых и прародительных клеток (НСПК), все из которых содержат ПК, местоположение которого, как было предложено....