Окисление белка тиола имеет значительные последствия при нормальных физиологических и патофизиологических условиях. Мы описываем детали количественного метода окислительно-восстановительной протеомики, который использует захват с помощью смолы, изобарическую маркировку и масс-спектрометрию, что позволяет идентифицировать и количественно оценивать обратимо окисленные цистеиновые остатки белков.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Улавливание с помощью смолы в сочетании с изобарической маркировкой тандемных масс-меток для мультиплексированной количественной оценки окисления тиола белка
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Обратимые окислительные модификации белковых тиолов недавно стали важными медиаторами клеточной функции. Здесь мы описываем подробную процедуру количественного метода окислительно-восстановительной протеомики, который использует смоляной захват (RAC) в сочетании с изобарической маркировкой тандемной массы (TMT) и жидкостной хроматографией-тандемной масс-спектрометрией (LC-MS / MS), чтобы позволить мультиплексированную стохиометрическую количественную оценку окисленных белковых тиолов на уровне протеома. Количественная информация об окисленных остатках цистеина для конкретных участков дает дополнительное представление о функциональном воздействии таких модификаций.
Рабочий процесс адаптируется ко многим типам образцов, включая культивируемые клетки (например, млекопитающие, прокариоты) и целые ткани (например, сердце, легкие, мышцы), которые первоначально лизируются / гомогенизируются и со свободными тиолами, алкилированными для предотвращения искусственного окисления. Окисленные белковые тиолы затем восстанавливаются и захватываются тиол-аффинной смолой, которая оптимизирует и упрощает этапы рабочего процесса, позволяя выполнять процедуры переваривания, маркировки и промывки без дополнительной передачи белков / пептидов. Наконец, меченые пептиды элюируются и анализируются LC-MS / MS, чтобы выявить комплексные стехиометрические изменения, связанные с окислением тиола во всем протеоме. Этот метод значительно улучшает понимание роли окислительно-восстановительной регуляции при физиологических и патофизиологических состояниях, связанных с окислением белка тиола.
Введение
В гомеостатических условиях клетки генерируют активный кислород, азот или серу, которые помогают облегчить процессы, такие как метаболизм и передача сигналов 1,2,3, распространяющихся как на прокариот, так и на эукариот. Физиологические уровни этих реактивных видов необходимы для правильной клеточной функции, также известной как «эустресс»1,4. Напротив, увеличение окислителей, которое приводит к дисбалансу между окислителями и антиоксидантами, может вызвать окислительный стресс или «дистресс»1,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры, описанные в протоколе, связанные с образцами/тканями животных или человека, были одобрены и соответствовали институциональным руководящим принципам Комитета по этике исследований человека и животных.
1. Гомогенизация/лизис образцов
- Замороженные образцы тканей
- Измельчите замороженную ткань (~30 мг) на предметном стекле микроскопа по сухому льду с помощью предварительно охлажденного лезвия бритвы и щипцов. Переложить измельченную ткань в предварительно охлажденную полистирольную трубку круглого дна объемом 5 мл, содержащую 700 мкл буфера А (см. таблицу 1), и инкубировать на льду в течение 30 ми....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Завершение протокола приведет к высокоспецифичному обогащению ранее окисленных цистеинсодержащих пептидов, часто со специфичностью >95% 27,35,36. Однако несколько ключевых этапов протокола требуют особого внимания, например, первоначальная блокировка свободных тиолов до лизиса/гомогенизации образца, что запрещает искусственное окисление и неспецифическое обогащение искусственно окисленных тиолов25. Обр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Улавливание с помощью смолы использовалось в различных типах образцов и биологических системах для исследования окислительных модификаций остатков цистеина 25,29,30. Этот метод позволяет оценивать образцы на нескольких уровнях и показаниях, включая белки и пептиды с использованием анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттинга, а также отдельные участки цистеина с использованием масс-спектрометрии. Независимо от типа образца или конечной .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, финансовых или иных.
Благодарности
Часть работы была поддержана грантами NIH R01 DK122160, R01 HL139335 и U24 DK112349
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-(Пиридилдитио)этиламина гидрохлорид | Med Chem Express | HY-101794 | Реагент для собственного синтеза смолы |
| 2,0 мл центрифужные пробирки LoBind | Eppendorf | 22431048 | |
| 5,0 мл Центрифуга LoBind | Eppendorf | 30108310 | |
| 5,0 мл пробирки с круглым дном | Falcon | 352054 | |
| Ацетон | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Ацетонитрил | сигма Олдрич | 34998 | |
| активированный тиол&ндаш; Сефароза 4B | Sigma Aldrich | T8512 | Потенциальная замена для тиол-аффинной смолы |
| Amicon Ultra 0,5 мл центробежный фильтр | Millipore Sigma | UFC5010BK | |
| бикарбонат аммония | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Бицинхоновая кислота (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | Пробирный анализ белка |
| Центрифуга | Eppendorf | 5810R | |
| Центрифуга | Eppendorf | 5415R | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| HEPES буфер | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Гомогенизатор | BioSpec Products | 985370 | |
| Йодоацетимид (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| N-этилмалеимид | Sigma | Aldrich 4259 | |
| NHS-активированный сефароза 4 Быстрый поток | Cytiva | 17-0906-01 | Реагент для собственного синтеза смолы |
| QIAvac 24 Plus Вакуумный коллектор | Qiagen | 19413 | |
| Хлорид натрия | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Додецилсульфат натрия (SDS) | Sigma Aldrich | L6026 | |
| Ультразвуковой аппарат | Branson | 1510R-MT | |
| Спиновые колонны | Thermo Scientific | 69705 | |
| Strata C18-E Колонны обратной фазы | Phenomenex | 8B-S001-DAK | Пептидное обессоливание |
| Термомиксер | Eppendorf | 5355 | |
| Тиопропилсефароза 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | Тиол-аффинная смола; *Производство смолы Thiopropyl Sepharose 6B было прекращено производителем (подробности см. в протоколе). |
| Изобарические метки TMT (16 плекс) | Thermo Scientific | A44522 | Реагент для пептидного мечения; доступен в нескольких форматах: |
| Буфер бикарбоната триэтиламмония (TEAB) | Sigma Aldrich | T7408 | |
| Трифторуксусная кислота (TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin | Promega | V5820 | |
| Мочевина | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Vacufuge Plus speedvac | Eppendorf | 22820001 | вакуумный концентратор |
| Вихревой смеситель | Scientific Industries | SI-0236 |
Ссылки
- Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
- Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. Reactive nitrogen species in cellular s....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
