Пространственное расстояние является ключевым параметром при оценке повреждения гипоксией/реоксигенацией в кокультурной модели отдельных эндотелиальных и кардиомиоцитарных клеточных слоев, впервые предполагая, что оптимизация пространственной среды кокультуры необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли эндотелиальных клеток в защите кардиомиоцитов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Разработка модели клеточной кокультуры для имитации ишемии сердца/реперфузии in vitro
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире. Реперфузия вызывает дополнительные травмы, помимо ишемии. Эндотелиальные клетки (ЭК) могут защищать кардиомиоциты (КМ) от реперфузионного повреждения посредством клеточных взаимодействий. Кокультуры могут помочь исследовать роль клеточно-клеточных взаимодействий. Смешанная кокультура является простейшим подходом, но ограничена, поскольку изолированные методы лечения и последующие анализы отдельных типов клеток невозможны. Чтобы выяснить, могут ли ЭК дозозависимо ослаблять повреждение клеток СМ и может ли эта защита быть дополнительно оптимизирована путем изменения расстояния контакта между двумя клеточными линиями, мы использовали эндотелиальные клетки первичной коронарной артерии мыши и кардиомиоциты взрослой мыши для тестирования трех типов вставок клеточной культуры, которые варьировались в их межклеточном слое на расстоянии 0,5, 1,0 мм и 2,0 мм соответственно. При только КМ клеточное повреждение, оцениваемое высвобождением лактатдегидрогеназы (ЛДГ), значительно увеличивалось во время гипоксии и далее при реоксигенации, когда расстояние составляло 2,0 мм по сравнению с 0,5 и 1,0 мм. Когда ЭК и КМ находились в почти прямом контакте (0,5 мм), наблюдалось лишь легкое ослабление повреждения реоксигенации КМ после гипоксии. Это затухание было значительно увеличено, когда пространственное расстояние составляло 1,0 мм. С расстоянием 2,0 мм ЕС ослабляли повреждение СМ как во время гипоксии, так и гипоксии / реоксигенации, что указывает на то, что для эк необходимы достаточные культурные дистанцирования для перекрестных помех с КМ, так что секретируемые сигнальные молекулы могут циркулировать и полностью стимулировать защитные пути. Наши результаты впервые показывают, что оптимизация пространственной среды кокультуры ЕС / СМ необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли ЭК в CM-защите от моделируемой ишемии / реперфузионного повреждения. Цель настоящего доклада состоит в том, чтобы предоставить исследователям поэтапный подход к использованию этой важной модели в своих интересах.
Введение
Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире 1,2. Тем не менее, процесс лечения реперфузии сам по себе может вызвать гибель кардиомиоцитов, известную как травма ишемии / реперфузии миокарда (ИК), для которой до сих пор нет эффективного средства3. Было предложено, чтобы эндотелиальные клетки (ЭК) защищали кардиомиоциты (КМ) посредством секреции паракринных сигналов, а также межклеточных взаимодействий4.
Модели клеточных кокультур широко использовались для исследования роли аутокринных и/или па....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Экспериментальная подготовка/покрытие
- Обслуживайте CM и EC в соответствии с инструкциями производителя.
- Оттаивайте обе клеточные линии, когда они поступают от поставщиков. Пластина в колбах Т25 после промывки свежей средой. Рекомендуется приобретать каждую среду для культивирования клеток у тех же поставщиков, у которых были приобретены клетки. На следующий день освежите клетки средой и используйте при слиянии.
- Поддерживают инкубатор клеточной культуры при температуре 37 °C с 21% O2, 5% CO2, 74%N2 и сохраняют его увлажненным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эндотелиальные клетки первичной коронарной арте....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Все три типа вставок (A, B, C), используемые в этом эксперименте, имеют одинаковый размер пор 0,4 мкм. Единственным различием между ними является высота вставки до основания, которая позволяет расстояниям между двумя совместно культивируемыми слоями клеток составлять 0,5, 1,0 и 2,0 мм соответственно (рисунок 3) и что они от разных поставщиков (подробнее см. Таблицу материалов).
Чтобы создать модель кокультуры in vitro с отдельными слоями .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Критические шаги в протоколе
Модели клеточной кокультуры были использованы для изучения клеточных механизмов кардиопротекции. Таким образом, способ создания двух отдельных слоев со значимым расстоянием между ними имеет решающее значение для разработки подходящей модели совместной культуры. Проблема в изучении смоделированного ИК, то есть ЧСС, травмы заключается в том, что не только сама ишемия (гипоксия), но и реперфузия (реоксигенация) усугубляет клеточную дисфункцию. Поэтому реалистичная модель долж.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана, в частности, Службой исследований и разработок биомедицинской лаборатории Министерства по делам ветеранов США (I01 BX003482) и институциональными фондами M.L.R.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Кардиомиоциты (КМ) взрослой мыши) | Celprogen Inc | 11041-14 | Выделено из сердечной ткани взрослой мыши C57BL/6J |
| Автоматизированный счетчик клеток Countess II | Invitrogen | A27977 | Подсчет клеток для подсчета количества клеток |
| Шкаф биобезопасности | Nuaire | NU425400 | Стерильный капюшон для клеточной культуры Клеточная |
| культура Замораживающая среда | Cell Biologics Inc | 6916 | Используется для замораживания клеток при длительном хранении клеточной линии |
| Инкубатор для клеточных культур | Nuaire | Nu-5500 | Для обеспечения нормальных условий жизни клеток (21% O<суб>2, 5% CO<суб>2, 74%N<суб>2, 37° C, увлажненный) |
| Газовый бак для инкубатора для клеточных культур | A-L Сжатые газы | UN1013 | Газ, необходимый для инкубатора для клеточных культур |
| Вставки для клеточных культур A (0,5 мм) | Corning Inc | 353095 | Используется для ко-культуры EC-CM |
| Вставки для клеточных культур B (1,0 мм) | Millicell Millipore | PIHP01250 | Используется для вставок для ко-культуры EC-CM |
| Вставки для клеточных культур C (2,0 мм) | Greiner Bio-One | 662640 | Используется для ко-культуры EC-CM |
| Центрифуга | Anstel Enterprises Inc | 4235 | Для покрытия и пассирования клеточных культур |
| Колбы для клеточных культур CMs T25 | Celprogen Inc | E11041-14 | Используется для обычной культуры CMs, покрытой производителем |
| CMs Cell Culture Medium Complete | Celprogen Inc | M11041-14S | CMs Culture Полная среда |
| CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free | Celprogen Inc | M11041-14PN | CMs Культуральная среда без фенола красного, используемая во время измерения LDH |
| CMs Cell Culture Plates 96 well | Celprogen Inc | E11041-14-96well | Используется для экспериментов по измерению ЛДГ, покрыт производителем |
| CMs Hypoxia Cell Culture Medium | Celprogen Inc | M11041-14GFPN | CMs клеточная культура в гипоксическом состоянии (без глюкозы и сыворотки) |
| Камерные предметные стекла камеры для подсчета клеток | Invitrogen | C10283 | Счетные стекла используются для клеточного счетчика |
| Cyquant LDH Cytotoxicity Kit | Термо Научный | C20301 | Набор для измерения ЛДГ |
| ECs Колбы для клеточных культур T25 | Fisher Scientific | FB012935 | Используется для обычных культур |
| ECs Среда для культивирования клеток Complete | Cell Biologics Inc | M1168 | ECs Культуральная среда для полной среды |
| ECs Среда для клеточных культур Полная среда без фенола | Cell Biologics Inc | M1168PF | Среда для культивирования ECs без фенолового красителя, используемая во время измерения ECs |
| Cell Culture Plates 96 well | Fisher Scientific (Costar) | 3370 | Используется для экспериментов с LDH измерение |
| ECs Culture Раствор покрытия на основе желатина | Cell Biologics Inc | 6950 | Используется для покрытия колб и планшетов для ECs |
| ECs Hypoxia Cell Culture Medium | Cell Biologics Inc | GPF1168 | ECs клеточная культура в гипоксическом состоянии (без глюкозы и сыворотки) |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Fisher Scientific | MT35011CV | FBS-HI USDA-одобрено для клеточного культивирования и поддержания |
| Гипоксическая камера | StemCell Technologies | 27310 | Для создания гипоксического состояния в среде 0,01%O<суб>2 |
| Камерный расходомер гипоксии | StemCell Technologies | 27311 | Для соединения с гипоксическим газовым баком для постоянной скорости потока газа |
| Гипоксический газовый бак (0,01%O<суб>2 баллон) | A-л Сжатые газы | UN1956 | Используется для промывки гипоксической среды и камеры (0,01%O<суб>2/5%CO<суб>2/94,99N<суб>2) |
| Микроскоп | Nikon | TMS | Для наблюдения за состоянием клеток |
| мыши Первичные эндотелиальные клетки коронарных артерий (ECs) | Cell Biologics Inc | C57-6093 | Выделено из коронарной артерии мышей C57BL/6 |
| NUNC 15ML CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565269 | Для процесса культивирования клеток, экспериментов, приготовления раствора и т.д. |
| NUNC 50 мл CONICL Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | Для процесса культивирования клеток, экспериментов, приготовления раствора и т. Д. |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | Используется для промывки клеток во время культивирования или экспериментов |
| Планшетный ридер | BioTek Instrument | 11120533 | Колориметрический или флуориметрический планшет |
| для чтения Реакция 96 Well Palte (прозрачный без крышки) | Fisher Scientific | 12565226 | Используется для измерения ЛДГ планшетом |
| Trypsin/EDTA для CMs | Celprogen Inc | T1509-014 | 1 x стерильный фильтрованный и проверенный на культуре тканей |
| трипсин/ЭДТА для ECs | Cell Biologics Inc | 6914/0619 | 0,25%, протестирован на клеточную нагрузку |
Ссылки
- Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial is....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
