Методическая статья

Разработка модели клеточной кокультуры для имитации ишемии сердца/реперфузии in vitro

2.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62913

⸱

13 октября 2021 г.

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Vanderbilt University Medical Center, 2Anesthesiology, TVHS VA Medical Center, 3Department of Pharmacology, Vanderbilt University

В этой статье

Краткое содержание

Пространственное расстояние является ключевым параметром при оценке повреждения гипоксией/реоксигенацией в кокультурной модели отдельных эндотелиальных и кардиомиоцитарных клеточных слоев, впервые предполагая, что оптимизация пространственной среды кокультуры необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли эндотелиальных клеток в защите кардиомиоцитов.

Аннотация

Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире. Реперфузия вызывает дополнительные травмы, помимо ишемии. Эндотелиальные клетки (ЭК) могут защищать кардиомиоциты (КМ) от реперфузионного повреждения посредством клеточных взаимодействий. Кокультуры могут помочь исследовать роль клеточно-клеточных взаимодействий. Смешанная кокультура является простейшим подходом, но ограничена, поскольку изолированные методы лечения и последующие анализы отдельных типов клеток невозможны. Чтобы выяснить, могут ли ЭК дозозависимо ослаблять повреждение клеток СМ и может ли эта защита быть дополнительно оптимизирована путем изменения расстояния контакта между двумя клеточными линиями, мы использовали эндотелиальные клетки первичной коронарной артерии мыши и кардиомиоциты взрослой мыши для тестирования трех типов вставок клеточной культуры, которые варьировались в их межклеточном слое на расстоянии 0,5, 1,0 мм и 2,0 мм соответственно. При только КМ клеточное повреждение, оцениваемое высвобождением лактатдегидрогеназы (ЛДГ), значительно увеличивалось во время гипоксии и далее при реоксигенации, когда расстояние составляло 2,0 мм по сравнению с 0,5 и 1,0 мм. Когда ЭК и КМ находились в почти прямом контакте (0,5 мм), наблюдалось лишь легкое ослабление повреждения реоксигенации КМ после гипоксии. Это затухание было значительно увеличено, когда пространственное расстояние составляло 1,0 мм. С расстоянием 2,0 мм ЕС ослабляли повреждение СМ как во время гипоксии, так и гипоксии / реоксигенации, что указывает на то, что для эк необходимы достаточные культурные дистанцирования для перекрестных помех с КМ, так что секретируемые сигнальные молекулы могут циркулировать и полностью стимулировать защитные пути. Наши результаты впервые показывают, что оптимизация пространственной среды кокультуры ЕС / СМ необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли ЭК в CM-защите от моделируемой ишемии / реперфузионного повреждения. Цель настоящего доклада состоит в том, чтобы предоставить исследователям поэтапный подход к использованию этой важной модели в своих интересах.

Введение

Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире 1,2. Тем не менее, процесс лечения реперфузии сам по себе может вызвать гибель кардиомиоцитов, известную как травма ишемии / реперфузии миокарда (ИК), для которой до сих пор нет эффективного средства3. Было предложено, чтобы эндотелиальные клетки (ЭК) защищали кардиомиоциты (КМ) посредством секреции паракринных сигналов, а также межклеточных взаимодействий4.

Модели клеточных кокультур широко использовались для исследования роли аутокринных и/или паракринных клеточно-клеточных взаимодействий в функции и дифференцировке клеток. Среди кокультурных моделей смешанная кокультура является самой простой, где два разных типа клеток находятся в прямом контакте в пределах одного культурального отсека при желаемом соотношении клеток5. Тем не менее, раздельное лечение между типами клеток и последующий анализ одного типа клеток неосуществимы, учитывая смешанную популяцию.

Предыдущие исследования показали, что гипоксические и ишемические инсульты вызывают значительное повреждение целостности клеточной мембраны, измеряемое высвобождением лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Эта травма усугубляется при реоксигенации, имитируя реперфузионную травму 6,7,8. Целью текущего протокола была проверка гипотез о том, что присутствие EC может дозозависимо ослаблять утечку CM клеточной мембраны, вызванную гипоксией и реоксигенацией (HR), и что защитный эффект EC может быть оптимизирован путем изменения расстояния контакта между двумя клеточными линиями. Таким образом, мы использовали три типа вставок клеточной культуры: эндотелиальные клетки первичной коронарной артерии мыши и кардиомиоциты взрослых мышей. Вставки под брендом Corning, Merck Millipore и Greiner Bio-One позволили нам создать три различных условия перекрестных помех клеточной культуры с расстояниями между клеточными линиями 0,5, 1,0 и 2,0 мм соответственно. В каждом случае на каждую вставку было нанесено 100 000 ЭК.

Кроме того, чтобы определить, способствует ли плотность ЭК в кокультуре ослаблению повреждения ЧСС в этой модели, мы изучили зависимость доза-реакция между концентрацией ЕС и высвобождением НРС КМ. ЭК были покрыты на 25 000, 50 000 и 100 000 на вставку, соответственно, во вставке 2,0 мм.

В этом отчете представлен поэтапный подход для исследователей, чтобы использовать эту важную модель в своих интересах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Экспериментальная подготовка/покрытие

  1. Обслуживайте CM и EC в соответствии с инструкциями производителя.
    1. Оттаивайте обе клеточные линии, когда они поступают от поставщиков. Пластина в колбах Т25 после промывки свежей средой. Рекомендуется приобретать каждую среду для культивирования клеток у тех же поставщиков, у которых были приобретены клетки. На следующий день освежите клетки средой и используйте при слиянии.
    2. Поддерживают инкубатор клеточной культуры при температуре 37 °C с 21% O2, 5% CO2, 74%N2 и сохраняют его увлажненным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эндотелиальные клетки первичной коронарной артерии мыши, используемые в этом протоколе, выделены из коронарных артерий мышей C57BL/6, а кардиомиоциты взрослых мышей выделены из сердца взрослых мышей C57BL/6J и получены в коммерческих целях (см. Таблицу материалов).
  2. Плиты СМ в стерильных условиях на дно 24-луночных плит (нижний слой). Через 24 ч пластинчатые ЭК во вставку (или верхнюю часть) кокультурного колодца. Через 24 часа после нанесения покрытия EC поместите вставки EC на основания пластин CM, начиная период совместного культивирования. Дайте клеткам совместно культивировать в течение не менее 12-24 ч перед использованием. Эти шаги подробно описаны ниже.
    1. Оцените слияние клеточных линий СМ под световым микроскопом. Когда клетки окажутся на 90%-100% сливающимися в культуральных колбах, приступают к экспериментальному покрытию.
    2. Удалите среду из колб, содержащих сливающиеся клеточные культуры, и попробуйте 3-5 мл трипсина/этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для колб Т25. Аккуратно перемешайте колбу, высиживают при 37 °C в течение 2-5 мин, а затем оценивают прогресс ферментатики под световым микроскопом. Как только клетки начнут округляться, используйте скребок для клеток, чтобы отделить клетки от поверхности.
    3. После отслоения инактивируют раствор трипсина, добавляя раствор трипсина/клетки в пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл среды для колб T25. Центрифугируют клеточную суспензию при 120 х г в течение 2 мин с получением мягкой клеточной гранулы. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл среды.
    4. Чтобы выполнить подсчет клеток и подтвердить жизнеспособность клеток, смешайте аликвоту 10 мкл повторно суспендированных клеток и 10 мкл трипанового синего красителя. Подсчитайте живые клетки с помощью счетчика ячеек. Разбавьте клетки свежими обычными средами для достижения желаемой плотности посева. Объемы рассчитываются в зависимости от желаемой плотности семян и клеточной концентрации исходных растворов. Все гальванические покрытия должны выполняться в стерильных условиях.
    5. Пластинчатые КМ при плотности высева 300 000 на скважину на дно 24-луночной пластины, предварительно покрытой внеклеточным матриксом. Поддерживайте ячейки при 37 °C с 21% O2 и 5% CO2 в течение ночи.
    6. Через 24 ч пластинчатые ЭК во вставки с оптимальной плотностью покрытия 100 000 на вставку (площадь культивирования составляет 33,6мм2), (рисунок 1). После 24 ч покрытия ЕС поместите вставки ЕС внутрь скважин СМ, инициируя совместное культивирование. Дайте клеткам совместно культивировать в течение 12-24 ч перед проведением экспериментов.
    7. Убедитесь, что к моменту проведения экспериментов как КМ, так и ЭК достигли 80-90% слияния.

2. Гипоксия/реоксигенация для имитации ишемии/реперфузионного повреждения In Vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены, как описано, не останавливайтесь между ними.

  1. Подготовьте гипоксическую среду, налив ~25 мл среды в коническую трубку объемом 50 мл. Запечатайте верхнюю часть силиконовой мембраной и используйте стерилизованную пипетку, чтобы пробить отверстие. Создайте еще одно отверстие, на этот раз оставив пипетку погруженной примерно на 2/3 в среду.
  2. Промывайте среду гипоксическим газом (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99%N2) в течение 5 мин при расходе 30 л/мин. Это минимизирует O2 , растворенный в среде, когда начинается гипоксия (шаг 2.5).
  3. Отбросьте среду 24-луночных пластин или культуральных вкладышей, содержащих прикрепленные клетки, и очень осторожно промыть 100 мкл/лунку 10% фосфатного буферизованного физиологического раствора (PBS). После этого добавьте 500 мкл свежеприготовленной гипоксической среды в каждую лунку пластин или вкладышей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гипоксия в среде прерывается как можно короче во время этой стадии, прежде чем истинная гипоксия для клеток и сред начнется на этапе 2.5.
    1. В нормоксической контрольной группе заменить исходные среды свежими нормальными средами, содержащими глюкозу и сыворотку.
  4. Увлажните камеру гипоксии, поместив чашку Петри, наполненную стерильной водой, в камеру. Затем поместите пластины, содержащие гипоксические группы, в камеру.
  5. Промывайте камеру гипоксии гипоксическим газом (0,0125% O2, 5% CO2, 94,99%N2) в течение 5 мин при расходе 30 л/мин. Поместите камеру в инкубатор при температуре 37 °C на 24 ч.
  6. После гипоксии культивируют КМ и ЭК в нормальных условиях. Для этого отбросьте старую среду пластин/вкладышей, замените ее нормальной средой (содержащей глюкозу и сыворотку; 500 мкл каждой лунки/вставки) и храните ее в инкубаторе в нормальных условиях культивирования (21% O2, 5% CO2, 74%N2, 37 °C) в течение 2 ч для имитации реперфузии.
  7. Чтобы контролировать любые эффекты замещения среды, изменяйте среду нормоксических клеток одновременно с изменением гипоксической среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлен схематический обзор этого протокола.

3. Оценка конечных точек

  1. Перенесите среду клеточного культуры с 24-луночной пластины в 96-луночную пластину. Используют 200 мкл среды из каждой скважины 24-луночной плиты и равномерно распределяют на четыре скважины 96-луночной плиты соответственно. Используйте по одной пластине для нормоксии против гипоксии против ЧСС.
  2. Определить степень клеточного повреждения, например, путем измерения абсорбции ЛДГ с использованием набора для анализа цитотоксичности в соответствии с инструкциями производителя. Выполните анализ в 96-луночной пластине в соответствии с инструкциями в протоколе анализа.

4. Статистика

  1. Отображение параметрических данных в виде среднего/стандартного отклонения и непараметрических данных в виде прямоугольных графиков с медианным/межквартильным диапазоном. Следует проводить адекватные параметрические и непараметрические множественные сравнительные тесты с приемлемыми пост-специальными тестами для снижения вероятности ошибки типа 1. Значимость обычно устанавливается на уровне альфа 0,05 (двуххвостый).
  2. Для всех экспериментов, проведенных в текущем исследовании, выполните, по крайней мере, три хорошо воспроизведенных в течение одного эксперимента. Было от трех до шести повторений каждого эксперимента, используемого для статистического анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Все три типа вставок (A, B, C), используемые в этом эксперименте, имеют одинаковый размер пор 0,4 мкм. Единственным различием между ними является высота вставки до основания, которая позволяет расстояниям между двумя совместно культивируемыми слоями клеток составлять 0,5, 1,0 и 2,0 мм соответственно (рисунок 3) и что они от разных поставщиков (подробнее см. Таблицу материалов).

Чтобы создать модель кокультуры in vitro с отдельными слоями ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические шаги в протоколе
Модели клеточной кокультуры были использованы для изучения клеточных механизмов кардиопротекции. Таким образом, способ создания двух отдельных слоев со значимым расстоянием между ними имеет решающее значение для разработки подходящей модели совместной культуры. Проблема в изучении смоделированного ИК, то есть ЧСС, травмы заключается в том, что не только сама ишемия (гипоксия), но и реперфузия (реоксигенация) усугубляет клеточную дисфункцию. Поэтому реалистичная модель долж...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана, в частности, Службой исследований и разработок биомедицинской лаборатории Министерства по делам ветеранов США (I01 BX003482) и институциональными фондами M.L.R.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Кардиомиоциты (КМ) взрослой мыши)Celprogen Inc11041-14Выделено из сердечной ткани взрослой мыши C57BL/6J
Автоматизированный счетчик клеток Countess IIInvitrogenA27977Подсчет клеток для подсчета количества клеток
Шкаф биобезопасностиNuaireNU425400Стерильный капюшон для клеточной культуры Клеточная
культура Замораживающая средаCell Biologics Inc6916Используется для замораживания клеток при длительном хранении клеточной линии
Инкубатор для клеточных культурNuaireNu-5500Для обеспечения нормальных условий жизни клеток (21% O<суб>2, 5% CO<суб>2, 74%N<суб>2, 37° C, увлажненный)
Газовый бак для инкубатора для клеточных культурA-L Сжатые газыUN1013Газ, необходимый для инкубатора для клеточных культур 
Вставки для клеточных культур A (0,5 мм)Corning Inc353095Используется для ко-культуры EC-CM
Вставки для клеточных культур B (1,0 мм)Millicell MilliporePIHP01250Используется для вставок для ко-культуры EC-CM
Вставки для клеточных культур C (2,0 мм)Greiner Bio-One662640Используется для ко-культуры EC-CM
ЦентрифугаAnstel Enterprises Inc4235Для покрытия и пассирования клеточных культур
Колбы для клеточных культур CMs T25Celprogen IncE11041-14Используется для обычной культуры CMs, покрытой производителем
CMs Cell Culture Medium CompleteCelprogen IncM11041-14SCMs Culture Полная среда
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol freeCelprogen IncM11041-14PNCMs Культуральная среда без фенола красного, используемая во время измерения LDH
CMs Cell Culture Plates 96 wellCelprogen IncE11041-14-96wellИспользуется для экспериментов по измерению ЛДГ, покрыт производителем
CMs Hypoxia Cell Culture MediumCelprogen IncM11041-14GFPNCMs клеточная культура в гипоксическом состоянии (без глюкозы и сыворотки)
Камерные предметные стекла камеры для подсчета клетокInvitrogenC10283Счетные стекла используются для клеточного счетчика
Cyquant LDH Cytotoxicity KitТермо Научный C20301Набор для измерения ЛДГ
ECs Колбы для клеточных культур T25Fisher Scientific FB012935Используется для обычных культур
ECs Среда для культивирования клеток CompleteCell Biologics IncM1168ECs Культуральная среда для полной среды
ECs Среда для клеточных культур Полная среда без фенолаCell Biologics IncM1168PFСреда для культивирования ECs без фенолового красителя, используемая во время измерения ECs
Cell Culture Plates 96 wellFisher Scientific (Costar)3370Используется для экспериментов с LDH измерение
ECs Culture Раствор покрытия на основе желатинаCell Biologics Inc6950Используется для покрытия колб и планшетов для ECs
ECs Hypoxia Cell Culture MediumCell Biologics IncGPF1168ECs клеточная культура в гипоксическом состоянии (без глюкозы и сыворотки)
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Fisher ScientificMT35011CVFBS-HI USDA-одобрено для клеточного культивирования и поддержания
Гипоксическая камераStemCell Technologies27310Для создания гипоксического состояния в среде 0,01%O<суб>2
Камерный расходомер гипоксииStemCell Technologies27311Для соединения с гипоксическим газовым баком для постоянной скорости потока газа
Гипоксический газовый бак (0,01%O<суб>2 баллон)A-л Сжатые газыUN1956Используется для промывки гипоксической среды и камеры (0,01%O<суб>2/5%CO<суб>2/94,99N<суб>2)
Микроскоп NikonTMSДля наблюдения за состоянием клеток
мыши Первичные эндотелиальные клетки коронарных артерий (ECs)Cell Biologics IncC57-6093Выделено из коронарной артерии мышей C57BL/6
NUNC 15ML CONICL TubesFisher Scientific12565269Для процесса культивирования клеток, экспериментов, приготовления раствора и т.д.
NUNC 50 мл CONICL TubesFisher Scientific12565271Для процесса культивирования клеток, экспериментов, приготовления раствора и т. Д.
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma-AldrichD8662Используется для промывки клеток во время культивирования или экспериментов
Планшетный ридерBioTek Instrument11120533Колориметрический или флуориметрический планшет
для чтения Реакция 96 Well Palte (прозрачный без крышки)Fisher Scientific12565226Используется для измерения ЛДГ планшетом
Trypsin/EDTA для CMsCelprogen IncT1509-0141 x стерильный фильтрованный и проверенный на культуре тканей
трипсин/ЭДТА для ECsCell Biologics Inc6914/06190,25%, протестирован на клеточную нагрузку

Ссылки

  1. Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).
  2. Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target. The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).
  3. Gottlieb, R. A. Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).
  4. Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease. The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).
  5. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).
  6. Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury. Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639(2020).
  7. Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).
  8. Martindale, J. J., Metzger, J. M. Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).
  9. vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device. Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).
  10. Bidarra, S. J., et al. Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells. Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).
  11. Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PloS One. 6, 25661(2011).
  12. Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures. PloS One. 7, 31711(2012).
  13. Miki, Y., et al. The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).
  14. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  15. Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6, 25661(2011).
  16. Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitro

Похожие статьи