Методическая статья

Мультиплексированное флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание четырех типов иммунных клеток эндометрия при рецидивирующем выкидыше

DOI:

10.3791/62931

⸱

4 августа 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 2Department of Orthopaedics and Traumatology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, Shenzhen Baoan Women’s and Children’s Hospital, Shenzhen University, 4School of Medicine, Faculty of Medicine and Health Sciences, Keele University, 5Li Ka Shing Institute of Health Sciences; School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на достижения в мультиплексной иммуногистохимии и мультиспектральной визуализации, характеристика плотности и кластеризации основных иммунных клеток одновременно в эндометрии остается проблемой. В этой статье описывается подробный протокол мультиплексного окрашивания и визуализации для одновременной локализации четырех типов иммунных клеток в эндометрии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммуногистохимия является наиболее часто используемым методом идентификации и визуализации тканевых антигенов в биологических исследованиях и клинической диагностике. Он может быть использован для характеристики различных биологических процессов или патологий, таких как заживление ран, иммунный ответ, отторжение тканей и взаимодействие тканей с биоматериалом. Однако визуализация и количественная оценка нескольких антигенов (особенно для иммунных клеток) в одном участке ткани с использованием обычного иммуногистохимического (IHC) окрашивания остается неудовлетворительной. Следовательно, в последние годы были внедрены мультиплексированные технологии для идентификации нескольких биологических маркеров в одном образце ткани или ансамбле различных образцов тканей.

Эти технологии могут быть особенно полезны для дифференциации изменений в иммунных межклеточных взаимодействиях в эндометрии между фертильными женщинами и женщинами с рецидивирующими выкидышами во время имплантации. В этой статье описывается подробный протокол мультиплексированного флуоресцентного окрашивания IHC для исследования плотности и кластеризации четырех основных типов иммунных клеток одновременно в точно синхронизированных образцах эндометрия во время имплантации эмбриона. Метод включает в себя пробоподготовку, мультиплексную оптимизацию маркерами для подтипов иммунных клеток и сканирование слайдов с последующим анализом данных с конкретной ссылкой на обнаружение иммунных клеток эндометрия.

Используя этот метод, плотность и кластеризация четырех основных типов иммунных клеток в эндометрии могут быть одновременно проанализированы в одном участке ткани. Кроме того, в этом документе будут обсуждаться критические факторы и устранение неполадок для преодоления возможной флуорофорной интерференции между применяемыми флуоресцентными зондами. Важно отметить, что результаты этого метода мультиплексного окрашивания могут помочь обеспечить глубокое понимание иммунологического взаимодействия и регуляции во время имплантации эмбриона.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Повторный выкидыш (РМ) может быть определен как потеря двух или более беременностей до 24 недель беременности1. Этим частым репродуктивным состоянием страдает до 1% пар во всем мире2,3. Патофизиология является многофакторной и может быть разделена на эмбриологически обусловленные причины (в основном из-за аномального эмбрионального кариотипа) и материнские причины, которые влияют на эндометрий и / или плацентарное развитие. Это проявление может быть результатом родительских генетических аномалий, аномалий матки, протромботических состояний, эндокринологических факторов и иммунологических нарушений4.

В последние годы дисфункция иммунных эффекторных клеток была вовлечена в патогенез ранней потери беременности5. Это вдохновило многие исследования по выяснению конкретных популяций иммунных клеток в эндометрии во время менструального цикла, имплантации и ранней беременности, с конкретными ролями на ранних сроках беременности. Среди этих иммунных клеток клетки-естественные киллеры матки (uNK) играют решающую роль во время имплантации эмбриона и беременности, особенно в процессах трофобластической инвазии и ангиогенеза6. Исследования показали повышенную плотность клеток uNK в эндометрии женщин с РМ7,8,хотя этот вывод не был связан с повышенным рискомвыкидыша 9. Тем не менее, это стимулировало исследования, оценивающие плотность других типов иммунных клеток (таких как макрофаги, дендритные клетки матки) в эндометрии у женщин с RM10,11. Тем не менее, остается неясным, происходит ли значительное изменение плотности иммунных клеток в периимплантационном эндометрии у женщин с РМ.

Одним из возможных объяснений неопределенности является то, что оценка плотности иммунных клеток эндометрия может быть затруднена из-за быстрых изменений в эндометрии во время окна имплантации. В течение 24-часового периода значительные изменения в эндометрии изменяют плотность иммунных клеток и секрецию цитокинов, вводя источник вариаций в эти результаты12. Кроме того, большинство отчетов в основном основаны на использовании одноклеточного окрашивания (например, традиционных методов IHC), которые не могут исследовать несколько маркеров на одном и том же участке ткани. Хотя проточная цитометрия может быть использована для обнаружения нескольких клеточных популяций в одном образце, большое количество необходимых клеток и трудоемкая оптимизация препятствуют популярности и эффективности этого метода. Следовательно, недавний прогресс в мультиплексном окрашивании IHC может решить эту проблему путем иммуноокрашивания нескольких маркеров на одном слайде для оценки нескольких параметров, включая клеточную линию и гистологическую локализацию отдельных иммунных субпопуляций. Кроме того, эта технология может максимизировать информацию, полученную в случае ограниченной доступности тканей. В конечном счете, этот метод может помочь прояснить различия во взаимодействиях иммунных клеток в эндометрии между фертильными женщинами и женщинами с РМ.

Две группы женщин были набраны из больницы принца Уэльского, в том числе фертильные контрольные женщины (FC) и женщины с необъяснимым повторным выкидышем (RM). Фертильный контроль был определен как женщины, у которых был по крайней мере один живой род без какой-либо истории спонтанного выкидыша, а женщины РМ были определены как те, у кого была история ≥2 последовательных выкидышей до 20 недель беременности. Испытуемые из двух групп соответствовали следующим критериям включения: (a) возраст от 20 до 42 лет, (b) некурящий, (c) регулярный менструальный цикл (25-35 дней) и нормальная структура матки, (d) не использование какого-либо гормонального режима в течение как минимум 3 месяцев до биопсии эндометрия, (e) отсутствие гидросальпинкса с помощью гистеросальпингограммы. Кроме того, все набранные субъекты имели нормальное кариотипирование, нормальную 3-мерную ультрасонографическую гистеросальпингограмму, фолликулостимулирующий гормон 2-й день < 10 МЕ / л, среднелютеиновый прогестерон > 30 нмоль / л, нормальную функцию щитовидной железы и отрицательный результат на антикоагулянты волчанки и антикардиолипиновые антитела IgG и IgM.

Чтобы лучше понять иммунологическую основу РМ, было бы наиболее желательно одновременно количественно оценить и локализовать основные типы иммунных клеток, присутствующих в эндометрии во время имплантации. В этой статье описывается весь протокол от подготовки образцов, мультиплексной оптимизации с маркерами для подтипов иммунных клеток и сканирования слайдов с последующим анализом данных с конкретной ссылкой на обнаружение иммунных клеток эндометрия. Кроме того, в данной работе описывается, как определить плотность и кластеризацию типов иммунных клеток одновременно в эндометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование было одобрено Объединенным комитетом по этике клинических исследований Восточного кластера Китайского университета Гонконга и Новых территорий. Информированное согласие было получено от участниц перед сбором биопсии эндометрия. Критерии включения контрольной и РМ групп см. в разделе введения.

1. Пробоподготовка

  1. Убедитесь, что все женщины в этом исследовании проходят ежедневный анализ мочи с 9-го дня менструального цикла, чтобы идентифицировать всплеск лютеинизирующего гормона (ЛГ) для выявления овуляции, и вовремя биопсию эндометрия точно на7-й день после всплеска ЛГ (ЛГ + 7).
  2. Получите фрагмент биопсии эндометрия размером0,5 см2 с помощью пробоотборника Pipelle или Pipet Curet у фертильных женщин и женщин с необъяснимым РМ. Маркируйте контейнер и поместите образец сразу в 10% нейтрально-буферизованный формалин (рН 7) для ночной фиксации при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем фиксатора должен быть в 5-10 раз больше, чем у ткани.
  3. Поместите ткань в картридж для обезвоживания в машине для обработки тканей, прежде чем встраивать ее в расплавленный парафиновый воск. Встраивают ткани в парафин при 58-60 °C.
  4. Дайте парафиновому блоку остыть в течение ночи при комнатной температуре. Используйте микротом, чтобы обрезать парафиновые блоки до толщины 3 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование дистиллированной воды способствует правильному креплению тканей и сцеплению на протяжении всего мультиплексного окрашивания.
  5. Поместите парафиновую ленту на водяную баню при 40-45 °C в течение 30 с.
  6. Установите секции на стеклянные стекла микроскопа с поли-L-лизином (0,1% мас./об.) с покрытием. Поместите горки тканью вверх и дайте высохнуть при 37 °C в течение ночи. Храните слайды в коробке для слайдов вдали от экстремальных температур до дальнейшего использования.

2. Определите идеальную концентрацию антител для мультиплексного IHC с помощью обычного IHC.

ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно для определения уровня экспрессии и структуры каждого иммунного маркера в образце эндометрия и определения последовательности окрашивания каждого маркера, а также связанных с ними пар флуорофоров с амплификацией тирамидного сигнала (TSA).

  1. Протестируйте антитела на их пригодность для мультиплексного IHC с помощью ручного обычного IHC13.
  2. Используйте ткани эндометрия для тестирования на одиночные антитела.
  3. Включают положительный контроль (например, селезенка) и отрицательный контроль (контроль изотипа) для оптимизации состояния окрашивания каждого антитела.
  4. Выполните окрашивание, используя разведение, рекомендованное в техническом описании антитела.
  5. Выполняют дополнительное окрашивание с использованием концентраций выше и ниже рекомендуемого разбавления, используемого на этапе 2.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клинический патологоанатом должен оценивать окрашенные слайды вслепую, чтобы подтвердить локализацию зондирования антител и клеточную целостность.

3. Метод мультиплексного окрашивания

  1. Подготовка и фиксация слайдов
    1. Выложите горки (из шага 1.6) плоской тканью вверх в духовку и выпекайте при 60 °C в течение не менее 1 ч.
    2. Извлеките горки из духовки и дайте им остыть не менее 20 минут при комнатной температуре, прежде чем поместить их в вертикальную скользящую стойку.
    3. Депаракс и регидратация закрепленных формалином, парафиновых слайдов с 10 мин, отведенных на каждый из следующих этапов: ксилол (2x), 100% этанол (2x), 95% этанол (1x), 70% этанол (2x) и дистиллированная вода (2x).
    4. Поместите стойку с горками в пластиковую коробку и погрузите их в физиологический раствор, буферизованный Tris (TBS, pH 7,6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Горки должны оставаться влажными, начиная с этого этапа регидратации до монтажа на заключительном этапе.
    5. Зафиксируйте образцы, погрузив слайды в пластиковую коробку, заполненную смесью формальдегида, разведенного метанолом (1:9) на 30 мин в темноте.
    6. Дважды вымойте горки в деионизированной воде в течение 2 минут, а затем приступайте к извлечению антигена.
  2. Извлечение эпитопов
    1. Поместите стойку с горками в термостойкую коробку и заполните ее буфером лимонной кислоты (рН 6,0), чтобы покрыть слайды.
    2. Поместите коробку в микроволновую печь и нагревайте слайды в течение 50 с при 100% мощности, а затем 20 минут при 20% мощности для поддержания той же температуры.
    3. Дайте слайдам остыть в течение примерно 15 минут при комнатной температуре.
    4. Промойте горки в воде в течение 2 минут, а затем TBS-Tween 20 (TBST) в течение 2 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: TBST состоит из 25 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl и 0,05% Tween 20 (v/v).
  3. Блокировка
    1. Блокируют активность эндогенной пероксидазы в ткани, погружая слайд на банку, содержащую раствор, блокирующий пероксидазу (см. Таблицу материалов)на 10 мин.
    2. Мойте горки с помощью TBST в течение 5 минут.
    3. Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы отметить границу вокруг участка ткани на слайде.
    4. Накройте участки тканей блокирующим буфером (см. Таблицу материалов)или бычьим сывороточным альбумином (5%, мас./об.) и инкубируйте слайды в увлажненной камере в течение 15 мин.
  4. Применение антител и сигналов
    1. Удалите блокирующие реагенты.
    2. Инкубировать с первичным антителом, представляющим интерес (например, CD3, разведение 1:100 в разбавителе антител, см. Таблицу 1)в увлажненной камере при комнатной температуре в течение 30 мин.
    3. Удалить первичное антитело. Мойте 3x с TBST в течение 5 минут каждый раз.
    4. Инкубировать с полимерным пероксидазой (HRP)-меченым вторичным антителом(таблица 1)в течение 15 мин в увлажненной камере при комнатной температуре. Мойте 3x с TBST в течение 5 минут каждый раз.
    5. Применяют рабочий раствор опалового флуорофора TSA (1:100 в амплификационном разбавителе) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы обеспечить конъюгацию флуорофора с образцом ткани в местах первичного связывания антител. Мойте с ПОМОЩЬЮ TBST в трех экземплярах в течение 5 мин каждый раз.
  5. Зачистка на основе микроволновой печи
    1. Промыть антигенным буфером (цитратный буферный раствор, рН 6,0).
    2. Выполните вскрышную обработку на основе микроволновой печи для удаления первично-вторичного комплекса HRP для введения следующего первичного антитела (например, CD20).
    3. Поместите слайды в буфер извлечения антигена, разогрейте их в микроволновой печи на 100% мощности в течение 50 с, а затем 20% мощности в течение 20 минут в контейнерах, безопасных для микроволновой печи, и охладите их при комнатной температуре в течение 15 минут.
    4. Повторяйте шаги с 3.2.4 по 3.5.2 до тех пор, пока образцы тканей не будут исследованы всеми первичными антителами.
  6. Крепление и монтаж
    1. После очистки в микроволновой печи и охлаждения буфера извлечения антигена промойте слайды в дистиллированной воде и TBST.
    2. Инкубировать с 4', 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) раствором (1,0 мкг/мл) в течение 5 мин в увлажненной камере при комнатной температуре.
    3. Мойте 3x с TBST в течение 5 минут каждый раз. Промыть водой один раз в течение 5 мин.
    4. Высушите горку на воздухе и установите ее с помощью соответствующего монтажного носителя (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для моноплексных слайдов, используемых для разработки спектральной библиотеки, не требуется контрраскрашивание.

4. Изображение и анализ

  1. Подготовка слайдов спектральной библиотеки
    1. Создавайте библиотечные слайды (однопятнистые эталонные изображения) для каждого флуорофора, DAPI и автофлуоресценции с одной и той же управляющей тканью для мультиспектрального анализа изображений.
    2. Используя слайды образцов биопсии эндометрия от женщин с РМ и фертильных женщин, выполните шаги от 1,1 до 3,6,4 для обнаружения одного антитела для каждого слайда (без дальнейшего добавления антител или флуорофора).
    3. Для каждого обнаружения антител окрашивают один из слайдов DAPI (как на этапе 3.6.2) и оставляют один слайд незапятнанным для обнаружения любой возможной автофлуоресценции тканей в спектре.
    4. Используйте соответствующие фильтры на рабочей станции для получения изображения для этого набора слайдов для каждого антитела и загрузите их в библиотеку анализа изображений (как описано в шаге 4.2).
    5. После захвата изображения выберите inForm в качестве источника спектральной библиотеки и создайте спектральную библиотеку.
    6. Поскольку флуорофоры используются, выберите в меню пункт Пятна/Флуоры...
    7. При выборе пятен или флуорофоров сузьте выбор, выбрав одну или несколько групп. Выберите Все, чтобы отобразить все спектры, совместимые с изображениями.
  2. Спектральная визуализация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения были сделаны с помощью рабочей станции Mantra с спектральной библиотекой, созданной с помощью программного обеспечения inForm Image Analysis.
    1. Захватите изображение слайдов, окрашенных одним антителом, с помощью соответствующих эпифлуоресцентных фильтров, как предложено в таблице 2 (например, DAPI, флуоресцеин изотиоцианат [FITC], CY3, Texas Red и CY5) с помощью рабочей станции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые фильтры для конкретных флуорофоров, используемых в этом протоколе, приведены в таблице 2.
    2. Определите подходящее время экспозиции для оптимального сигнала, изучив каждый маркер в соответствующем флуоресцентном канале.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный сигнал определяется по ориентиру на позитивность и локализацию, полученному при окрашивании одиночным антителом.
    3. Определить фиксированное время воздействия для каждого анализируемого вещества (комбинация антитело-флуорофор) для стандартизации сравнения перекрестных образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определение фиксированного воздействия зависит от интенсивности в выборке интересов.
    4. Сканируйте мультиплексные окрашенные слайды в соответствующем режиме сканирования со встроенным алгоритмом автофокусировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установленная спектральная библиотека будет использоваться для дифференциации мультиспектрального куба изображения на отдельные отдельные компоненты (спектральное размешивание). Это позволило бы обрабатывать цветовую идентификацию всех маркеров, представляющих интерес, с использованием следующих двух основных этапов: учебная сессия и сессия анализа изображений.
  3. Анализ изображений
    1. Подсчет клеток выбранных типов иммунных клеток в эндометрии
    2. Захватите не менее 10 полей для анализа при 200-кратном увеличении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поля были захвачены путем сканирования всего раздела без какого-либо выбора. Это может обеспечить одновременный захват всех клеточных компонентов эндометрия, например, просветной эпителиальной границы, стромы и желез.
    3. Чтобы подсчитать ячейки, нажмите кнопку «Подсчитать объекты» на панели шагов, чтобы отобразить панель «Параметры подсчета объектов».
    4. Установите флажок «Отменить объект, если прикоснуться к краю», чтобы исключить любые объекты, касающиеся края изображения, области процесса или области ткани.
    5. Если ткань сегментирована, выберите категорию тканей, в которой должны быть найдены объекты. Не подсчитывайте объекты за пределами выбранной категории тканей.
    6. Выберите нужный подход для идентификации объектов: объектно-ориентированный или пиксельный (пороговый).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подход на основе пикселей (порог) следует выбирать в случае надежного или согласованного пятна, для которого применение простого порога даст пиксели объекта. Объектно-ориентированный подход рекомендуется, когда требуются более продвинутые подходы, основанные на морфометрии, в случае отсутствия согласованности и специфичности окрашивания объектов.
    7. Выберите нужное масштабирование сигнала: Автоматическое масштабирование или Фиксированное масштабирование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор автоматического масштабирования приведет к автоматическому масштабированию каждой плоскости компонента перед выполнением сегментации объекта. Параметр «Фиксированное масштабирование» рекомендуется, когда требуется более высокая производительность сегментации, а сигналы пятна являются последовательными и надежными.
    8. Выберите основной компонент для сегментации объектов из раскрывающегося списка.
    9. Настройте минимальное значение сигнала для основного компонента на требуемое пороговое значение.
    10. Чтобы автоматически заполнять отверстия в объектах, выберите «Заполнить отверстия».
    11. Чтобы обнаружить объекты, которые касаются других объектов, как отдельные объекты, а не как один объект, установите флажок Уточнить разделение после установки флажка Максимальный размер (пикселы).
    12. Чтобы исключить объекты на основе округлости объекта, установите флажок Округлость и укажите требуемую минимальную цикличность.
    13. Подсчитайте все стромальные клетки (CD3−/CD20−/CD68−/CD56−и DAPI+),включая клетки, окружающие кровеносные сосуды.
    14. Подсчитывайте иммунные клетки отдельно, включая Т-клетки (CD3+ и DAPI+),В-клетки (CD20+ и DAPI+),макрофаги (CD68+ и DAPI+) и uNK-клетки (CD56+ и DAPI+).
    15. Экспрессируйте данные в процентах иммунных клеток относительно общего количества стромальных клеток для каждого захваченного изображения и сообщайте окончательное количество клеток как среднее значение всех полей.
    16. Используйте редактор представлений для просмотра результирующих таблиц данных после обработки. Экспортируйте таблицу Count Data.
    17. Количественная оценка пространственного распределения иммунных клеток эндометрия
    18. При 200-кратном увеличении оцените L-функцию с помощью программы R для диапазона 0-20 мкм, считающегося максимальным расстоянием контакта клетки с клеткой14.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения L-функции использовался набор инструментов языка R 'spatstat'.
      1. Обозначают уровень кластеризации различных пар иммунных клеток на основе площади под кривой (AUC) их L-функции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общий схематический процесс выполнения 4-цветного мультиплексного анализа для выявления 4 типов иммунных клеток эндометрия показан на рисунке 1. Короче говоря, протокол для этого мультиплексного иммунофлуоресцентного окрашивания требовал 8 ключевых этапов: 1. Подготовка слайда, 2. Извлечение эпитопа, 3. Блокирование, 4. Первичное применение антител, 5. Применение вторичных антител, 6. Усиление сигнала, 7. Удаление антител и 8. Контрокрашивание и крепление. Затем рендеринг и анализ изображени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги в рамках протокола
Важно отметить, что мультиплексное окрашивание требует тщательной оптимизации. Извлечение антигена с использованием цитратного буфера и микроволновой технологии требует оптимизации для обеспечения полного удаления антител и поддержания жизнеспособности тканей. Поскольку реагенты TSA ковалентно связываются с сайтами, окружающими антиген, они могут потенциально ингибировать связывание последующего первичного антитела через стерическое препятствие (также известное как ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Гонконгским акушерско-гинекологическим трастовым фондом в 2018 году и Гонконгским фондом здравоохранения и медицинских исследований (06170186, 07180226).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Разбавитель амплификацииPerkin ElmerFP1498Буферный разбавитель флуорофора
Разбавитель антителPerkin ElmerARD1001EAРазведение антитела
CD3Spring BioscienceM3072Первичное антитело
CD20Biocare MedicalCM004BПервичное антитело
CD56LeicaNCL-CD56-504Первичное антитело
CD68Spring BioscienceM5510Первичный раствор
цитрата антител, pH 6,0 (10x)AbcamAB64214раствор для извлечения антигена
EMSURE Xylene (изомерная смесь)Merck108297депарафинизация
Этанол абсолютMerck107017этиловый спирт для регидратации
HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica МикротомLeicaRM2125RTSСекционирование ткани, залитой парафином
, в программном обеспечении для расширенного анализа изображенийPerkin ElmerinForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (версия 14.0)Программное обеспечение для анализа данных
Mantra® Рабочая станцияAkoya BiosciencesCLS140089Спектральная визуализация
Микроволновая печьИнверторPanasonicМикроволновая полоска
Опал 520Перкин ЭлмерFP1487AПодходящий флуоресцентный реактив на основе тирамида
Опал 620Перкин ЭлмерFP1495AПодходящий флуоресцентный реактив на основе тирамида
Опал 650Перкин ЭлмерFP1496AПодходящий флуоресцентный реактив на основе тирамида
Opal 690Perkin ElmerFP1497AПодходящий флуоресцентный реактив на основе тирамида
OvenMemmertU10Депарафинизирующий
раствор для блокирования пероксидазыDAKOS2023Удаление активности тканевой пероксидазы
Слайд с покрытием из поли-L-лизинаFISHER SCIENTIFIC120-550-15Слайд для рутинного гистологического использования
PolyHRP Broad SpectrumPerkin ElmerARH1001EAвторичное антитело
ProLong™ Золото Антивыцветающий МонтантThemoFisher ScientificP36930Монтажный
Spatstat/Версия 2.1-0Пространственный анализ точечных шаблонов
Спектральный DAPIPerkin ElmerFP1490AОкрашивание нуклеиновых кислот
Тканевый процессорThermo FischerExcelsior ESТканевая обработка для обезвоживания и парафинирования
Трис Буферный Физиологический Раствор (TBS), 10xCell Signaling Technology12498SМоющий раствор
Tween 20Sigma-AldrichP1370-1LНеионогенное моющее средство

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004(2018).
  2. Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
  3. Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
  4. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
  5. King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
  6. Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
  7. Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
  8. Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
  9. Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
  10. Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
  11. Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
  12. Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, Suppl 2 26-36 (1999).
  13. Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711(2019).
  14. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095(2017).
  15. Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи