Мы демонстрируем, как установить мышиную модель имплантации легочного корня в нисходящую аорту для имитации процедуры Росса. Данная модель позволяет проводить среднесрочную/долгосрочную оценку ремоделирования легочного аутотрансплантата в системном положении, представляя собой основу для разработки терапевтических стратегий содействия его адаптации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модель грызунов операции Росса: имплантация сингенного трансплантата легочной артерии в системном положении
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Операция Росса по поводу заболевания аортального клапана вновь обрела новый интерес благодаря своим выдающимся долгосрочным результатам. Тем не менее, при использовании в качестве автономной замены корня описывается возможное расширение легочного аутотрансплантата и последующая аортальная регургитация. Было предложено несколько моделей на животных. Однако они обычно ограничиваются моделями ex-vivo или экспериментами in vivo с относительно дорогими моделями крупных животных. В этом исследовании мы стремились установить грызунную модель имплантации трансплантата легочной артерии (PAG) в системном положении. В общей сложности было включено 39 взрослых крыс Льюиса. Сразу после эвтаназии легочный корень был собран у животного-донора (n=17). Сингенных реципиентов (n=17) и фиктивных (n=5) крыс седировали и вентилировали. В группе реципиентов ПАГ имплантировали со сквозным анастомозом в инфра-почечном абдоминальном положении аорты. Крысы с фиктивной операцией подвергались только трансекции и повторному анастомозу аорты. За животными наблюдали серийные ультразвуковые исследования в течение двух месяцев и посмертный гистологический анализ. Медианный диаметр PAG в исходном положении составил 3,20 мм (IQR=3,18-3,23). При последующем наблюдении медианный диаметр PAG составлял 4,03 мм (IQR = 3,74-4,13) через 1 неделю, 4,07 мм (IQR = 3,80-4,28) через 1 месяц и 4,27 мм (IQR = 3,90-4,35) через 2 месяца (p<0,01). Пиковая систолическая скорость составляла 220,07 мм/с (IQR=210,43-246,41) на 1 неделе, 430,88 мм/с (IQR=375,28-495,56) на 1 месяц и 373,68 мм/с (IQR=305,78-429,81) на 2 месяца (p=0,02) и не отличалась от фиктивной группы в конце эксперимента (p=0,5). Гистологический анализ не показал никаких признаков эндотелиального тромбоза. Это исследование показало, что модели грызунов могут позволить оценить долгосрочную адаптацию легочного корня к системе высокого давления. Системно размещенная сингенная имплантация ПАГ представляет собой простую и осуществимую платформу для разработки и оценки новых хирургических методов и медикаментозной терапии для дальнейшего улучшения результатов операции Росса.
Введение
Врожденный стеноз аортального клапана – это подгруппа врожденных пороков сердца, характеризующаяся обструкцией левого желудочкового тракта, в которой поражение расположено на клапанном уровне. Порок развития поражает примерно 0,04-0,38 на 1000 живорождений1.
Доступных вариантов коррекции много, каждый со своими преимуществами и недостатками. Для пациентов, подходящих для бивентрикулярной коррекции2, подход может быть направлен на восстановление клапана (чрескожная или хирургическая вальвулотомия) или его замену3. Последнее предпочтительно, когда аортальный клапан считается неспасительным; однако доступные варианты ограничены для педиатрических пациентов. Действительно, биопротезные клапаны не показаны для замены аорты у молодого населения из-за их ранней кальцификации4. С другой стороны, дегенерация в механических клапанах происходит значительно медленнее, но они требуют пожизненной антикоагулянтной терапии5. Кроме того, основным ограничением этих протезов является отсутствие потенциала роста, что предрасполагает пациентов к дополнительным реинтервенциям.
Интересным терапевтическим вариантом в педиатрической популяции является перевод легочного аутотрансплантата в положение аорты под названием «операция Росса». В этом случае легочный клапан затем заменяют гомотрансплантатом (рисунок 1)6. Эта процедура может представлять собой лучший хирургический выбор для детей, потому что легочный аутотрансплантат сохраняет свой потенциал роста и не несет рисков пожизненной антикоагулянтной терапии. Кроме того, процедура Росса может иметь большое значение также для молодых людей, чтобы избежать механического или биологического клапана, имея потенциал стать лучшим хирургическим решением.
Результаты после замены аортального клапана легочным аутотрансплантатом превосходны, с выживаемостью более 98% и хорошими долгосрочными результатами7. Литературные исследования сообщают о 93% и 90% свободе от замены легочного гомотрансплантата в 4 и 12 лет соответственно8.
Основным ограничением этой процедуры является тенденция аутотрансплантата расширяться в долгосрочной перспективе, особенно при использовании в качестве отдельно стоящей замены корня. Это может привести к некомпетентности клапанов, которая может потребовать повторного вмешательства. Действительно, самое длинное последующее исследование, проведенное до сих пор, сообщает о свободе от повторной операции для замены аутотрансплантата 88% через 10 лет и 75% через 20 лет9.
Возможность воссоздания операции Росса в экспериментальных условиях представляет собой фундаментальную предпосылку для исследования основного механизма адаптации легочного аутотрансплантата к системным давлениям. В прошлом было предложено несколько моделей. Однако они обычно ограничиваются экспериментами ex-vivo или моделями in vivo на животных с относительно дорогими крупными животными. В этом исследовании мы стремились установить грызунную модель имплантации трансплантата легочной артерии (PAG) в системном положении, как отдельно стоящий корень.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными Падуанского университета (OPBA, протокол No 55/2017) и одобрены Министерством здравоохранения Италии (разрешение No 700/2018-PR) в соответствии с Директивой Европейского союза 2010/63/UE и итальянским законом 26/2014 об уходе и использовании лабораторных животных.
1. Уход за животными и экспериментальная модель
- Убедитесь, что все крысы Льюиса получены от одной компании (Таблица материалов). Содержание крыс в обычных помещениях со свободным доступом к пище и воде.
- Убедитесь, что вес крыс колеблется в пределах 320-400 г для группы реципиентов и 200-250 г для донорской группы.
2. Предоперационный протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции должны выполняться в чистых условиях. Используйте самцов и самок взрослых крыс Льюиса в качестве реципиентов и доноров, а также для выполнения сингенной трансплантации.
- Выполните внутрибрюшинную инъекцию трамадола (5 мг/кг) за 15 мин до операции.
- Вводят однократную дозу внутримышечного гентамицина (5 мг/кг) непосредственно перед операцией.
- Для индукции анестезии подайте 4% севофлурана в 1 л/мин кислорода в полиметакрилатную камеру, где помещается животное. Для поддержания анестезии используйте 2,0-2,5% севофлурана в 1 л/мин кислорода на протяжении всей процедуры.
- Бритье животного по средней линии на 2 см шириной от грудины до 1 см над областью гениталий бритвой. Затем стерилизовать кожу раствором йода.
- Чтобы животное не намокло и предотвратить рассеивание тепла во время операции, накройте животное прозрачной пластиковой пленкой.
- Оцените уровень анестезии перед выполнением процедуры, оценив отсутствие ответа на вредный раздражитель.
3. Донорская операция
- Препарат для животных и сердца:
- Поместите обезболенное животное на пробковый лоток каудальной стороной лицом к хирургу. Выполните ксифо-лобковый разрез размером около 5-6 см и втяните два мышечно-кожных лоскута сбоку.
- Вводят объем 1 мл физиологического раствора при 4 °C, содержащего 500 МЕ гепарина, через полую брюшную вену.
- Через 1 мин разрезают диафрагму слева направо и выполняют переднюю торакотомию для обнажения сердца.
- Охладите бьющееся сердце, капая солевым раствором при 4 °C.
- Выполните перикардиэктомию и тимэктомию, чтобы получить полное представление о дуге аорты. Удалите оставшиеся жировые ткани, окружающие аорту.
- Разрезать у дуги, чуть выше начала безымянной артерии; отрежьте и последний.
- Разрезать полую грудную нижнюю вену (IVC) и вставить канюлю 22 Г, чтобы наполнить сердце 20-25 мл физиологического раствора при 4 °C, оказывая легкое давление. Прекратите перфузию, когда сердце перестанет биться и поток из аорты станет прозрачным.
- PAG explant:
ПРИМЕЧАНИЕ: Точный сбор урожая и деликатное обращение с PAG является обязательным для достижения оптимальной имплантации реципиенту. Не прикасайтесь к нему непосредственно инструментами, вместо этого используйте ватные палочки.- Выполните ультразвуковое исследование для оценки диаметра ПА в исходном положении.
- Вставьте микрощепку под заднюю стенку сосуда и разрежьте последний с помощью микроножек как можно ближе к его бифуркации, чтобы максимизировать длину PAG.
- Аккуратно удерживайте ПА с помощью микрощипцов с кольцевыми наконечниками и отделите его от правого желудочка ножницами микропрусор. Соберите PAG, включая некоторые мышцы правого желудочка.
- Подготовка ПАГ:
- Поместите ПАГ на марлю, смоченную холодным физиологическим раствором, на операционный стол и осмотрите сосуд под операционным микроскопом.
- Отрежьте любую обильную окружающую ткань, оставив только 1 мм желудочковой мышцы. Установите длину сосуда на уровне 5 мм.
4. Имплантация трансплантата легочной артерии (PAG)
- Подготовка животного-реципиента:
- Поместите обезболенное животное на пробковый лоток каудальной стороной лицом к хирургу.
- Выполните срединный продольный разрез и используйте два мини-ретрактора, чтобы держать живот открытым.
- Экстрагируйте кишечник двумя ватными тампонами и накройте их марлей, пропитанной физиологическим раствором 39 °C, что позволяет визуализировать забрюшинную область с экспозицией инфра-почечной брюшной аорты (АА).
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время операции важно время от времени увлажнять кишечник с помощью шприца, содержащего физиологический раствор 39 ° C, чтобы предотвратить гипотермию, критическое состояние, распространенное у грызунов. - Протрите заднюю теменную брюшину между двумя почечными артериями и подвздошной бифуркацией с помощью двух валопчатых тампонов и удалите жировую ткань вокруг инфраренальной АА. Оставьте только небольшую часть жира над АА, чтобы облегчить обработку на судне.
- Отделите AA от IVC. Чтобы выполнить эту процедуру, сначала пройдите изогнутые щипцы за задней стенкой аорты и используйте его, чтобы открыть проход между АА и IVC. Затем используйте шелковый шов 2-0, чтобы создать петлю вокруг АА, чтобы поднять сосуд и отделить АА от IVC. Обжигните любую поясничную артерию, возникающую из инфраренальной АА, шелковым швом 6/0 и разделите ее.
- Поверните животное на 90° против часовой стрелки, положив голову на левую сторону оператора. АА теперь лежал горизонтально в микроскопическом поле.
- Используйте два зажима Yasargil, чтобы зажать инфраренальную АА и разместить их на расстоянии 1,5 см друг от друга. Переведите AA в среднюю точку между двумя клипами.
- Орошайте два конца сосудов гепарином (1 UI/мл) в физиологическом растворе для удаления сгустков. Удалите любой случайный мусор с сосудов.
- Имплантация ПАГ:
- Поместите PAG между двумя концами, с желудочковым концом к черепной части животного.
- Используйте полипропиленовый шов 10-0 для выполнения двух знаковых одиночных стежков, соединяющих PG с AA. Выполните процедуру на обоих концах ПАГ, наложив шов на противоположные стороны окружности сосуда.
- Выполняйте сквозной анастомоз между ПАГ и АА, начиная с дистального конца. Используйте один из двух концов дистального шва для заднего анастомоза, используя последовательность реципиент-трансплантат out-in-in-out, чтобы выполнить бегущий шов из примерно шести швов.
- Как только шов достигнет проксимального ориентира, выполните двойную половинчатую сцепку, завершенную квадратным узлом, используя шов и один из двух концов проксимального ориентировочного шва. Нанесите резиновые москитные щипцы на швы, чтобы обеспечить сцепление.
- Выполняют тот же анастомоз на передней стенке. Проведите всю процедуру на проксимальном конце ПАГ. Обратите особое внимание при выполнении проксимального анастомоза, чтобы избежать включения любого листочка в линию шва.
- Сначала отпустите дистальный зажим, чтобы PAG был заполнен ретроградной кровью (поток низкого давления), чтобы проверить анастомоз. Устраните любую утечку крови одним швом. После того, как дистальный анастомоз оценен, выполните ту же процедуру на проксимальном конце.
- Заключительные этапы операции на реципиенте:
- Оцените проходимость ПАГ и нанесите две полоски желатиновой губки на шовные линии с обеих сторон ПАГ (при необходимости). Мягкое давление в течение нескольких секунд с помощью двух ватных тампонов, чтобы помочь гемостазу.
- Переместите кишечник в брюшную полость и закройте стенки 4/0 полипропиленовым шовом.
5. Фиктивная процедура
- Выполните идентичную подготовку животного, как это было ранее показано для крыс-реципиентов.
- Отрежьте инфра-почечную АА, промежуточную между почечной и подвздошной артериями.
- Повторное приближение двух концов АА с помощью сквозного анастомоза, как описано ранее. Удалите два зажима и выполните точную процедуру гемостаза.
- Репозиционировать кишечник и закрыть брюшную стенку слоями, как у животных-реципиентов.
6. Послеоперационный уход и последующее наблюдение
- Введите теплый физиологический раствор (5 мл) в подкожную клетчатку спины животного для гидратации. Поместите крысу под нагревательную лампу и визуально следите за ней до пробуждения, которое обычно занимает до 5 минут после прекращения анестезии. Поместите животное в клетку при комнатной температуре 22-24 °C, с немедленным и неограниченным доступом к пище и воде.
- Вводят внутримышечно трамадол (5 мг/кг) для послеоперационной анальгезии два раза в день в течение первых 48 ч после операции. После этого ежедневно контролируйте состояние здоровья и массу тела реципиента.
- Последующее наблюдение: Во время наблюдения выполняйте сериальные ультразвуковые исследования через одну неделю, один месяц и два месяца для оценки функции ПАГ. Во время этих исследований измерьте диаметр сосуда, пиковую систолическую скорость (PSV) и конечную диастолическую скорость. Измеряют эти параметры внутри ПАГ и на уровне проксимального и дистального АА.
- Усыпляют животных после двух месяцев наблюдения путем применения CO2 в течение нескольких минут, а затем эксплантируют PAG, который будет проходить гистопатологический анализ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В общей сложности 39 взрослых крыс Льюиса были включены в это исследование: 17 животных использовались в качестве доноров PAG, 17 животных в качестве реципиентов и 5 в качестве фиктивных (контрольная группа) (таблица 1). Самцов крыс было 22 (56%), а самок 17 (44%); последние использовались только в донорской группе.
Во время операции не произошло ни одного смертельного события со 100% выживаемостью. Во время наблюдения у двух животных группы трансплантации исход исходил через ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Замена аортального клапана аутологичным легочным корнем (операция Росса) представляет собой привлекательный вариант для восстановления врожденного стеноза аортального клапана благодаря благоприятному профилю и потенциальному росту аутотрансплантата10. Основным ограничением этой процедуры является потенциальная дилатация аортального неоклапана, что предрасполагает к развитию длительной регургитации. Возможность охарактеризовать модификации легочной артерии после воздействия системных давлений может...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Исследование финансировалось из интегрированного бюджета межведомственных исследований (BIRD) 2019.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,9% хлорида натрия | Monico SpA | AIC 030805105 | двух флаконах по 100 мл. Холодный (4° В) для промывания извлекаемого органа; теплый (39&d; C) для увлажнения и регидратации реципиента |
| 7,5% Povidone-Iodine | B Braun | AIC 032151211 | |
| Barraquer | Aesculap | FD 232R | Прямой микроиглодержатель для сосудистых анастомозов |
| Castroviejo иглодержатель | Отсутствует | J 4065 | Для закрытия животного |
| Зажим с применением щипцов | Rudolf Medical | RU 3994-05 | Для зажима |
| Ватные палочки | Johnson & Johnson Medical SpA | N/A | Продукт для супермаркета. Стерилизованные |
| изогнутые микро ювелирные щипцы | Rudolf Medical | RU 4240-06 | Используются для наложения швов под вазы. |
| Крем для депиляции | RB healthcare | Н/Д | Продукт из супермаркета |
| Электрокоагуляционная машина | LED SpA | Surton 200 | |
| Тонкие ножницы | Rudolf Medical | RU 2422-11 | Для вскрытия живота (реципиент) |
| Микроножницы Vannas с тонким наконечником | Aesculap | OC 497R | Только для подготовки легочного корня, разрежьте поясничные вазы и 10/0 Prolene |
| Fluovac Isoflurane/Halotane Scavanger unit | Harvard Apparatus Ltd | K 017041 | Полный комплект из наркозного аппарата, анестезиологической трубки, индукционной камеры и поглотителя с абсорбируемым фильтром |
| Gentamycin | MSD Italia Srl | AIC 020891014 | антибиотиком. Однократная доза, 5 мг/кг внутримышечно, вводится во время операции |
| Heparin | Pharmatex Italia Srl | AIC 034692044 | 500 МЕ в брюшную полую вену реципиента |
| I.V. Catheter | Smiths Medical Ltd | 4036 | 20G |
| Инсулиновый шприц, 1 мл | Fisher Scientific | 14-841-33 | Для введения гепарина животному-донору и для промывания разделенной аорты у реципиента |
| Биполярный щипец Jeweler | GIMA SpA | 30665 | наконечник 0,25 мм. Для электрокоагуляции очень маленьких ваз |
| Lewis rats (LEW/HanHsd) | Envigo RMS SRL, San Pietro al Natisone, Udine, Italy | 86104M | Самец или самка, весом 200-250 г (животные, собирающие легочные корни) и 320-400 г (реципиенты) |
| Micro-Mosquito | Rudolf Medical | RU 3121-10 | В количестве четырех, с наконечниками, покрытыми силиконовыми трубками. Для удержания проленового шва во время анастомоза |
| Операционный микроскоп | Leica Microsystems | M 400-E | Используется с 6-кратным, 10-кратным и 16-кратным сменными увеличениями в процедуре |
| Perma-Hand silk 2-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | C026D | Для поднятия аорты |
| Петролатум офтальмологическая мазь | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Prolene 10-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | W2790 | Очень тонкий нерассасывающийся шовный материал, с круглой иглой BV75-3, для сосудистых анастомозов |
| Ретракторы | Не любые | Н/Д | Два самодельных ретрактора |
| Микрощипцы с кольцевым наконечником | Rudolf Medical | RU 4079-14 | Для деликатных манипуляций |
| Севофлуран | AbbVie Srl | AIC 031841036 | Смешанный с кислородом, для ингаляционной анестезии |
| Микроножницы пружинного типа | Rudolf Medical | RU 2380-14 | Прямые; длина 14 см |
| Стандартные зажимы для аневризмы | Rudolf Medical | RU 3980-12 | Два зажима (7,5 мм; 180 г; 1,77 Н) для закрытия аорты |
| Стерильная марля из нетканого материала | Luigi Salvadori SpA | 26161V | 7,5x7,5 см, четыре слоя |
| Прямые ножницы Doyen | Rudolf Medical | RU/1428-16 | Для использования донору |
| Прямые микро ювелирные щипцы | Rudolf Medical | RU 4240-04 | длиной 10,5 см. Используется для всего анастомоза |
| шприцы | Artsana SpA | N/A | 20 мл (для животного-сборщика) и 5 мл (для реципиента). Для промывания и погружения солевым раствором |
| TiCron 4-0 | Covidien | CV-331 | Для сжатия мышц и кожи |
| Тканевые щипцы V. Mueller | McKesson | CH 6950-009 | Используется для кожи и мышц |
| Трамадол | SALF SpA | AIC 044718029 | Анальгетик. Разовая доза, 5 мг/кг внутримышечно |
| Virgin silk 8-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | W818 | Для лигирования артериальных ветвей |
Ссылки
- Botto, L. D., Correa, A., Erickson, J. D. Racial and temporal variations in the prevalence of heart defects. Pediatrics. 107 (3), 32(2001).
- Vergnat, M., et al. Aortic stenosis of the neonate: A single-center experience. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 157 (1), 318-326 (2019).
- Hraška, V., et al. The long-term outcome of open valvotomy for critical aortic stenosis in neonates. The Annals of Thoracic Surgery. 94 (5), 1519-1526 (2012).
- Kaza, A. K., Pigula, F. A. Are bioprosthetic valves appropriate for aortic valve replacement in young patients. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. 19 (1), 63-67 (2016).
- Myers, P. O., et al. Outcomes after mechanical aortic valve replacement in children and young adults with congenital heart disease. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 157 (1), 329-340 (2019).
- Donald, J. S., et al. Ross operation in children: 23-year experience from a single institution. The Annals of thoracic surgery. 109 (4), 1251-1259 (2020).
- Khwaja, S., Nigro, J. J., Starnes, V. A. The Ross procedure is an ideal aortic valve replacement operation for the teen patient. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. , 173-175 (2005).
- Elkins, R. C., Lane, M. M., McCue, C. Ross operation in children: late results. The Journal of Heart Valve Disease. 10 (6), 736-741 (2001).
- Chambers, J. C., Somerville, J., Stone, S., Ross, D. N. Pulmonary autograft procedure for aortic valve disease: long-term results of the pioneer series. Circulation. 96 (7), 2206-2214 (1997).
- Mazine, A., et al. Ross procedure in adults for cardiologists and cardiac surgeons: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (22), 2761-2777 (2018).
- Sengupta, P. The laboratory rat: Relating its age with humans. International Journal of Preventive Medicine. 4 (6), 624-630 (2013).
- Ashfaq, A., Leeds, H., Shen, I., Muralidaran, A. Reinforced ross operation and intermediate to long term follow up. Journal of Thoracic Disease. 12 (3), 1219-1223 (2020).
- Vida, V. L., et al. Age is a risk factor for maladaptive changes of the pulmonary root in rats exposed to increased pressure loading. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 21 (3), 199-205 (2012).
- Nappi, F., et al. An experimental model of the Ross operation: Development of resorbable reinforcements for pulmonary autografts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 149 (4), 1134-1142 (2015).
- Vanderveken, E., et al. Mechano-biological adaptation of the pulmonary artery exposed to systemic conditions. Scientific Reports. 10 (1), 2724(2020).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
