Модель грызунов операции Росса: имплантация сингенного трансплантата легочной артерии в системном положении

Врожденный стеноз аортального клапана – это подгруппа врожденных пороков сердца, характеризующаяся обструкцией левого желудочкового тракта, в которой поражение расположено на клапанном уровне. Порок развития поражает примерно 0,04-0,38 на 1000 живорождений1.

Доступных вариантов коррекции много, каждый со своими преимуществами и недостатками. Для пациентов, подходящих для бивентрикулярной ^{коррекции2}, подход может быть направлен на восстановление клапана (чрескожная или хирургическая вальвулотомия) или его ^{замену3}. Последнее предпочтительно, когда аортальный клапан считается неспасительным; однако доступные варианты ограничены для педиатрических пациентов. Действительно, биопротезные клапаны не показаны для замены аорты у молодого населения из-за их ранней ^{кальцификации4}. С другой стороны, дегенерация в механических клапанах происходит значительно медленнее, но они требуют пожизненной антикоагулянтной ^{терапии5}. Кроме того, основным ограничением этих протезов является отсутствие потенциала роста, что предрасполагает пациентов к дополнительным реинтервенциям.

Интересным терапевтическим вариантом в педиатрической популяции является перевод легочного аутотрансплантата в положение аорты под названием «операция Росса». В этом случае легочный клапан затем заменяют гомотрансплантатом (рисунок 1)⁶. Эта процедура может представлять собой лучший хирургический выбор для детей, потому что легочный аутотрансплантат сохраняет свой потенциал роста и не несет рисков пожизненной антикоагулянтной терапии. Кроме того, процедура Росса может иметь большое значение также для молодых людей, чтобы избежать механического или биологического клапана, имея потенциал стать лучшим хирургическим решением.

Результаты после замены аортального клапана легочным аутотрансплантатом превосходны, с выживаемостью более 98% и хорошими долгосрочными ^{результатами7}. Литературные исследования сообщают о 93% и 90% свободе от замены легочного гомотрансплантата в 4 и 12 лет ^{соответственно8}.

Основным ограничением этой процедуры является тенденция аутотрансплантата расширяться в долгосрочной перспективе, особенно при использовании в качестве отдельно стоящей замены корня. Это может привести к некомпетентности клапанов, которая может потребовать повторного вмешательства. Действительно, самое длинное последующее исследование, проведенное до сих пор, сообщает о свободе от повторной операции для замены аутотрансплантата 88% через 10 лет и 75% через 20 ^лет9.

Возможность воссоздания операции Росса в экспериментальных условиях представляет собой фундаментальную предпосылку для исследования основного механизма адаптации легочного аутотрансплантата к системным давлениям. В прошлом было предложено несколько моделей. Однако они обычно ограничиваются экспериментами ex-vivo или моделями in vivo на животных с относительно дорогими крупными животными. В этом исследовании мы стремились установить грызунную модель имплантации трансплантата легочной артерии (PAG) в системном положении, как отдельно стоящий корень.

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными Падуанского университета (OPBA, протокол No 55/2017) и одобрены Министерством здравоохранения Италии (разрешение No 700/2018-PR) в соответствии с Директивой Европейского союза 2010/63/UE и итальянским законом 26/2014 об уходе и использовании лабораторных животных.

1. Уход за животными и экспериментальная модель

1. Убедитесь, что все крысы Льюиса получены от одной компании (Таблица материалов). Содержание крыс в обычных помещениях со свободным доступом к пище и воде.
2. Убедитесь, что вес крыс колеблется в пределах 320-400 г для группы реципиентов и 200-250 г для донорской группы.

2. Предоперационный протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции должны выполняться в чистых условиях. Используйте самцов и самок взрослых крыс Льюиса в качестве реципиентов и доноров, а также для выполнения сингенной трансплантации.

1. Выполните внутрибрюшинную инъекцию трамадола (5 мг/кг) за 15 мин до операции.
2. Вводят однократную дозу внутримышечного гентамицина (5 мг/кг) непосредственно перед операцией.
3. Для индукции анестезии подайте 4% севофлурана в 1 л/мин кислорода в полиметакрилатную камеру, где помещается животное. Для поддержания анестезии используйте 2,0-2,5% севофлурана в 1 л/мин кислорода на протяжении всей процедуры.
4. Бритье животного по средней линии на 2 см шириной от грудины до 1 см над областью гениталий бритвой. Затем стерилизовать кожу раствором йода.
5. Чтобы животное не намокло и предотвратить рассеивание тепла во время операции, накройте животное прозрачной пластиковой пленкой.
6. Оцените уровень анестезии перед выполнением процедуры, оценив отсутствие ответа на вредный раздражитель.

3. Донорская операция

1. Препарат для животных и сердца:
   1. Поместите обезболенное животное на пробковый лоток каудальной стороной лицом к хирургу. Выполните ксифо-лобковый разрез размером около 5-6 см и втяните два мышечно-кожных лоскута сбоку.
   2. Вводят объем 1 мл физиологического раствора при 4 °C, содержащего 500 МЕ гепарина, через полую брюшную вену.
   3. Через 1 мин разрезают диафрагму слева направо и выполняют переднюю торакотомию для обнажения сердца.
   4. Охладите бьющееся сердце, капая солевым раствором при 4 °C.
   5. Выполните перикардиэктомию и тимэктомию, чтобы получить полное представление о дуге аорты. Удалите оставшиеся жировые ткани, окружающие аорту.
   6. Разрезать у дуги, чуть выше начала безымянной артерии; отрежьте и последний.
   7. Разрезать полую грудную нижнюю вену (IVC) и вставить канюлю 22 Г, чтобы наполнить сердце 20-25 мл физиологического раствора при 4 °C, оказывая легкое давление. Прекратите перфузию, когда сердце перестанет биться и поток из аорты станет прозрачным.
2. PAG explant:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точный сбор урожая и деликатное обращение с PAG является обязательным для достижения оптимальной имплантации реципиенту. Не прикасайтесь к нему непосредственно инструментами, вместо этого используйте ватные палочки.
   1. Выполните ультразвуковое исследование для оценки диаметра ПА в исходном положении.
   2. Вставьте микрощепку под заднюю стенку сосуда и разрежьте последний с помощью микроножек как можно ближе к его бифуркации, чтобы максимизировать длину PAG.
   3. Аккуратно удерживайте ПА с помощью микрощипцов с кольцевыми наконечниками и отделите его от правого желудочка ножницами микропрусор. Соберите PAG, включая некоторые мышцы правого желудочка.
3. Подготовка ПАГ:
   1. Поместите ПАГ на марлю, смоченную холодным физиологическим раствором, на операционный стол и осмотрите сосуд под операционным микроскопом.
   2. Отрежьте любую обильную окружающую ткань, оставив только 1 мм желудочковой мышцы. Установите длину сосуда на уровне 5 мм.

4. Имплантация трансплантата легочной артерии (PAG)

1. Подготовка животного-реципиента:
   1. Поместите обезболенное животное на пробковый лоток каудальной стороной лицом к хирургу.
   2. Выполните срединный продольный разрез и используйте два мини-ретрактора, чтобы держать живот открытым.
   3. Экстрагируйте кишечник двумя ватными тампонами и накройте их марлей, пропитанной физиологическим раствором 39 °C, что позволяет визуализировать забрюшинную область с экспозицией инфра-почечной брюшной аорты (АА).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время операции важно время от времени увлажнять кишечник с помощью шприца, содержащего физиологический раствор 39 ° C, чтобы предотвратить гипотермию, критическое состояние, распространенное у грызунов.
   4. Протрите заднюю теменную брюшину между двумя почечными артериями и подвздошной бифуркацией с помощью двух валопчатых тампонов и удалите жировую ткань вокруг инфраренальной АА. Оставьте только небольшую часть жира над АА, чтобы облегчить обработку на судне.
   5. Отделите AA от IVC. Чтобы выполнить эту процедуру, сначала пройдите изогнутые щипцы за задней стенкой аорты и используйте его, чтобы открыть проход между АА и IVC. Затем используйте шелковый шов 2-0, чтобы создать петлю вокруг АА, чтобы поднять сосуд и отделить АА от IVC. Обжигните любую поясничную артерию, возникающую из инфраренальной АА, шелковым швом 6/0 и разделите ее.
   6. Поверните животное на 90° против часовой стрелки, положив голову на левую сторону оператора. АА теперь лежал горизонтально в микроскопическом поле.
   7. Используйте два зажима Yasargil, чтобы зажать инфраренальную АА и разместить их на расстоянии 1,5 см друг от друга. Переведите AA в среднюю точку между двумя клипами.
   8. Орошайте два конца сосудов гепарином (1 UI/мл) в физиологическом растворе для удаления сгустков. Удалите любой случайный мусор с сосудов.
2. Имплантация ПАГ:
   1. Поместите PAG между двумя концами, с желудочковым концом к черепной части животного.
   2. Используйте полипропиленовый шов 10-0 для выполнения двух знаковых одиночных стежков, соединяющих PG с AA. Выполните процедуру на обоих концах ПАГ, наложив шов на противоположные стороны окружности сосуда.
   3. Выполняйте сквозной анастомоз между ПАГ и АА, начиная с дистального конца. Используйте один из двух концов дистального шва для заднего анастомоза, используя последовательность реципиент-трансплантат out-in-in-out, чтобы выполнить бегущий шов из примерно шести швов.
   4. Как только шов достигнет проксимального ориентира, выполните двойную половинчатую сцепку, завершенную квадратным узлом, используя шов и один из двух концов проксимального ориентировочного шва. Нанесите резиновые москитные щипцы на швы, чтобы обеспечить сцепление.
   5. Выполняют тот же анастомоз на передней стенке. Проведите всю процедуру на проксимальном конце ПАГ. Обратите особое внимание при выполнении проксимального анастомоза, чтобы избежать включения любого листочка в линию шва.
   6. Сначала отпустите дистальный зажим, чтобы PAG был заполнен ретроградной кровью (поток низкого давления), чтобы проверить анастомоз. Устраните любую утечку крови одним швом. После того, как дистальный анастомоз оценен, выполните ту же процедуру на проксимальном конце.
3. Заключительные этапы операции на реципиенте:
   1. Оцените проходимость ПАГ и нанесите две полоски желатиновой губки на шовные линии с обеих сторон ПАГ (при необходимости). Мягкое давление в течение нескольких секунд с помощью двух ватных тампонов, чтобы помочь гемостазу.
   2. Переместите кишечник в брюшную полость и закройте стенки 4/0 полипропиленовым шовом.

5. Фиктивная процедура

1. Выполните идентичную подготовку животного, как это было ранее показано для крыс-реципиентов.
2. Отрежьте инфра-почечную АА, промежуточную между почечной и подвздошной артериями.
3. Повторное приближение двух концов АА с помощью сквозного анастомоза, как описано ранее. Удалите два зажима и выполните точную процедуру гемостаза.
4. Репозиционировать кишечник и закрыть брюшную стенку слоями, как у животных-реципиентов.

6. Послеоперационный уход и последующее наблюдение

1. Введите теплый физиологический раствор (5 мл) в подкожную клетчатку спины животного для гидратации. Поместите крысу под нагревательную лампу и визуально следите за ней до пробуждения, которое обычно занимает до 5 минут после прекращения анестезии. Поместите животное в клетку при комнатной температуре 22-24 °C, с немедленным и неограниченным доступом к пище и воде.
2. Вводят внутримышечно трамадол (5 мг/кг) для послеоперационной анальгезии два раза в день в течение первых 48 ч после операции. После этого ежедневно контролируйте состояние здоровья и массу тела реципиента.
3. Последующее наблюдение: Во время наблюдения выполняйте сериальные ультразвуковые исследования через одну неделю, один месяц и два месяца для оценки функции ПАГ. Во время этих исследований измерьте диаметр сосуда, пиковую систолическую скорость (PSV) и конечную диастолическую скорость. Измеряют эти параметры внутри ПАГ и на уровне проксимального и дистального АА.
4. Усыпляют животных после двух месяцев наблюдения путем применения _CO2 в течение нескольких минут, а затем эксплантируют PAG, который будет проходить гистопатологический анализ.

В общей сложности 39 взрослых крыс Льюиса были включены в это исследование: 17 животных использовались в качестве доноров PAG, 17 животных в качестве реципиентов и 5 в качестве фиктивных (контрольная группа) (таблица 1). Самцов крыс было 22 (56%), а самок 17 (44%); последние использовались только в донорской группе.

Во время операции не произошло ни одного смертельного события со 100% выживаемостью. Во время наблюдения у двух животных группы трансплантации исход исходил через 12 и 51 день соответственно; выживаемость в конце исследования составила 91% (табл. 1).

Медианный вес крыс составил 387 г (межквартильный диапазон, IQR, 358-394 г) для группы реципиентов и 328 г (IQR=304-337 г) для донорской группы. Через неделю после операции медиана веса составила 363 г (IQR = 350-376 г) со снижением на 6% по сравнению с предоперационным весом. Животные восстановили свой вес в течение первого месяца наблюдения (медиана 387 г, IQR 369-392 г), с конечной массой через два месяца 397 г (IQR = 391-402 г) (рисунок 2).

Медиана времени наблюдения составила 62,5 дня (МКР=60-68 дней) в группе трансплантации и 62 дня (МКР=61-67 дней) в группе с фиктивной операцией (р=0,68).

Предоперационный медианный диаметр ПА в исходном положении составлял 3,20 мм (IQR=3,18-3,23 мм). Средний диаметр PAG составлял 4,03 мм (IQR= 3,74-4,13 мм) за одну неделю, 4,07 мм (IQR = 3,80-4,28 мм) за один месяц и 4,27 мм (IQR = 3,90-4,35 мм) за два месяца (рисунок 3A). Это на 25,9%, 27,2% и 33,5% больше по сравнению с диаметром в родном положении соответственно. Увеличение диаметра значительно отличалось при сравнении значения в исходном положении и значения за одну неделю (p = 0,003), в то время как в ходе следующих исследований не было обнаружено значительного увеличения. Диаметр аорты в фиктивной группе составлял 1,41 мм (IQR=1,35-1,62 мм) за одну неделю и 1,41 мм (IQR=1,29-1,70 мм) за два месяца. Медиана ПСВ на уровне PAG составила 220,07 мм/с (IQR=210,43-246,41 мм/с) за одну неделю, 430,88 мм/с (IQR=375,28-495,56 мм/с) за один месяц и 373,68 мм/с (IQR=305,78-429,81 мм/с) за два месяца. По сравнению с фиктивной группой существенная разница в ПСВ была обнаружена через одну неделю (медиана 419,12 мм/ с, IQR = 408,42-561,32 мм / с; p<0,001), в то время как в конце исследования не было обнаружено никакой разницы (392,92 мм / с, IQR = 305,89-514,27 мм / с; p = 0,5) (рисунок 3B).

В конце исследования гистологический анализ не показал признаков эндотелиального тромбоза и кальцификация стенок не была значимой в большинстве случаев (рисунок 4).

Рисунок 1: Репрезентативное изображение операции Росса. На фото показаны этапы операции Росса. а) аортальный клапан и корневой эксплант; (B) транспозиция ауттрансплантата легочной артерии в положении аорты; (C) Замена аутотрансплантата легочной артерии гомотрансплантатом. А: аортальный клапан и корень; H: гомотрансплантат; P: легочный клапан и корень. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Временной ход массы тела в группе трансплантации. График показывает ход за время веса крысы в группе трансплантации. Значения выражаются в виде медианного и межквартильного диапазона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Изменение диаметра и пиковой систолической скорости в трансплантате легочной артерии. Графики показывают изменение диаметра (A) и пиковой систолической скорости (B) внутри трансплантата легочной артерии во время сериальных ультрасонографических оценок. Значения выражаются в виде медианного и межквартильного диапазона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Микроскопическая оценка ПАГ. На изображении показан PAG после эксплантата (A). B) рентгенографическая оценка; (C) Гематоксилин и Эозин пятно, первоначальное увеличение 12,5x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Характеристики и результаты исследования. *Значения выражаются в виде медианного и межквартильного диапазона.

Авторам нечего раскрывать.