Методическая статья

Контролируемые светом ферментации для производства микробных химических веществ и белков

4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63269

⸱

22 марта 2022 г.

 ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Оптогенетический контроль микробного метаболизма обеспечивает гибкое динамическое управление процессами ферментации. Протокол здесь показывает, как настроить ферментации, регулируемые синим светом, для химического и белкового производства в разных объемных масштабах.

Аннотация

Заводы по производству микробных клеток предлагают устойчивую альтернативу для производства химических веществ и рекомбинантных белков из возобновляемого сырья. Однако перегрузка микроорганизма генетическими модификациями может снизить приспособленность и продуктивность хозяина. Эта проблема может быть преодолена с помощью динамического контроля: индуцируемой экспрессии ферментов и путей, обычно с использованием химических или питательных добавок, чтобы сбалансировать клеточный рост и производство. Оптогенетика предлагает неинвазивный, легко настраиваемый и обратимый метод динамической регуляции экспрессии генов. Здесь мы описываем, как настроить контролируемые светом ферментации инженерных Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae для производства химических веществ или рекомбинантных белков. Мы обсуждаем, как применять свет в выбранное время и дозировки для разъединения роста и производства микробов для улучшения контроля ферментации и производительности, а также ключевые соображения оптимизации для достижения наилучших результатов. Кроме того, мы описываем, как реализовать элементы управления светом для лабораторных экспериментов с биореакторами. Эти протоколы облегчают внедрение оптогенетического контроля в инженерных микроорганизмах для улучшения производительности ферментации.

Введение

Оптогенетика, контроль биологических процессов с помощью светочувствительных белков, предлагает новую стратегию динамического контроля микробных ферментаций для химического и белкового производства1,2. Бремя инженерных метаболических путей и токсичность некоторых промежуточных продуктов и продуктов часто ухудшают рост клеток3. Такие стрессы могут привести к плохому накоплению биомассы и снижению производительности3. Эта проблема может быть решена путем временного разделения ферментаций на фазу роста и производства, которые выделяют метаболические ресурсы для накопления биомассы или синтеза продукта соответственно4. Недавно мы показали, что переход от роста к производству в этой двухфазной ферментации может быть вызван изменением условий освещения5,6,7. Высокая настраиваемость, обратимость и ортогональность световых входов8 обеспечивают уникальные преимущества для контролируемых светом ферментаций, которые трудно или невозможно воспроизвести с помощью химических индукторов, используемых в динамическом управлении обычными двухфазными ферментациями4,9,10,11.

Чувствительный к синему свету белок EL222, полученный из Erythrobacter litoralis, был использован для разработки нескольких оптогенетических схем для метаболической инженерии в Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 содержит домен датчика напряжения света и кислорода (LOV), который претерпевает конформационный сдвиг при активации синего света (465 нм), что позволяет ему связываться с его родственной последовательностью ДНК (C120)13. Слияние EL222 с вирусным доменом активации VP16 (VP16-EL222) приводит к созданию фактора транскрипции, реагирующего на синий свет, который может обратимо активировать экспрессию генов у S. cerevisiae7 и других организмов14 из синтетического промотора PC120. Несколько схем на основе EL222 были разработаны и использованы для химического производства в S. cerevisiae, такие как базовая светоактивированная система OptoEXP7, в которой интересующий ген непосредственно экспрессируется из PC120 (рисунок 1A). Тем не менее, опасения по поводу проникновения света при высокой плотности клеток, обычно встречающиеся на производственной фазе ферментаций, побудили нас разработать перевернутые цепи, которые индуцируются в темноте, такие как схемы OptoINVRT и OptoQ-INVRT (рисунок 1B) 5,7,13. Эти системы используют регулоны галактозы (GAL) или хиновой кислоты (Q) из S. cerevisiae и N. crassa соответственно, контролируя их соответствующие репрессоры (GAL80 и QS) с помощью VP16-EL222, чтобы подавить экспрессию генов на свету и сильно индуцировать ее в темноте. Объединение схем OptoEXP и OptoINVRT приводит к двунаправленному контролю экспрессии генов, что позволяет проводить двухфазные ферментации, в которых фаза роста индуцируется синим светом, а фаза производства — темнотой (рисунок 2A)5,7.

Использование света вместо темноты для индуцирования экспрессии генов во время фазы производства значительно расширит возможности оптогенетического контроля, но также потребует преодоления ограничений проникновения света из-за высокой плотности клеток, обычно встречающихся в этой фазе ферментации. С этой целью мы разработали схемы, известные как OptoAMP и OptoQ-AMP, которые усиливают транскрипционный ответ на стимуляцию синего света. Эти схемы используют дикие или гиперчувствительные мутанты VP16-EL222 для контроля производства транскрипционных активаторов Gal4p или QF2 регулонов GAL или Q соответственно, достигая повышенной чувствительности и более сильной экспрессии генов с помощью light12,13 (рисунок 1C). Контуры OptoAMP могут достигать полной и однородной световой индукции в 5 л биореакторах при оптической плотности (измеренной при 600 нм; OD600) значения не менее 40 при освещении всего ~0,35% (5% дозы света только на ~7% объемной поверхности). Это демонстрирует более высокую степень чувствительности по сравнению с OptoEXP, который требует почти 100% освещения12. Способность эффективно индуцировать экспрессию генов светом при высокой плотности клеток открывает новые возможности для динамического контроля ферментаций. Это включает в себя рабочие ферментации в более чем двух временных фазах, таких как трехфазные ферментации, в которых фазы роста, индукции и производства устанавливаются с уникальными световыми графиками для оптимизации химического производства (рисунок 2B)12.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Оптогенетические схемы динамического управления S. cerevisiae. Схемы OptoEXP, OptoINVRT и OptoAMP основаны на светочувствительной системе VP16-EL222. (A) В цепи OptoEXP воздействие синего света вызывает конформационное изменение и димеризацию VP16-EL222, что обнажает ДНК-связывающий домен и позволяет транскрипцию из PC120. Рисунок был изменен по сравнению с Zhao et al.7. (B) Контуры OptoINVRT используют GAL (показаны) или Q регулоны для индуцирования экспрессии в темноте. В схемах на основе GAL ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНО выражены VP16-EL222 и GAL4 , в то время как PC120 управляет экспрессией репрессора GAL80 (в схемах на основе Q GAL4 и GAL80 заменяются QF2 и QS соответственно, а вместо промотора GAL используется синтетический ПРОМОТОР, содержащий QUAS). В свете Gal80p предотвращает активацию интересующего гена из PGAL1. В темноте GAL80 не выражается и быстро деградирует путем слияния его с конститутивным дегронным доменом (малый коричневый домен), что позволяет активировать PGAL1 Gal4p. Рисунок был изменен по сравнению с Чжао и др.5. (C) Схемы OptoAMP также используют VP16-EL222 для управления GAL (показаны) или Q-регулонами. В этих схемах репрессор GAL80 (или QS) конститутивно выражен и слит с фоточувствительным дегроном (малый синий домен), обеспечивающим жесткое подавление в темноте. PC120 и гиперчувствительная VP16-EL222 мутантная контрольная экспрессия GAL4 (или QF2) со светом, который сильно активирует PGAL1 (или QUAS-содержащий промотор) в свете. Схемы, полученные из GAL, могут использовать инженерные формы PGAL1, такие как PGAL1-M или PGAL1-S, которые имеют повышенную активность, а также промоторы дикого типа, контролируемые регулятором GAL (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). Рисунок был изменен из Zhao et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-introduction-2
Рисунок 2: Двух- и трехфазные ферментации во времени. (А) Двухфазные ферментации, работающие с перевернутыми контурами, состоят из фазы роста, управляемой светом, и темной фазы производства. В фазе роста биомасса накапливается по мере того, как производственный путь остается подавленным. По достижении желаемого OD600 клетки смещаются в темноту для метаболической корректировки, прежде чем быть повторно суспендированными в свежих средах для фазы производства. (B) В трехфазном процессе фазы роста, инкубации и производства определяются уникальными световыми графиками, которые могут состоять из темного периода роста, импульсной инкубации и полностью освещенной фазы производства. Рисунок, созданный с помощью Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Также были разработаны оптогенетические схемы для динамического контроля химического и белкового производства в кишечной палочке. Схемы OptoLAC управляют бактериальным репрессором LacI с помощью светочувствительной схемы pDawn, которая основана на двухкомпонентной системе YF1/FixJ6 (рисунок 3). Подобно OptoINVRT5, схемы OptoLAC предназначены для подавления экспрессии генов на свету и индуцирования ее в темноте. Уровни экспрессии с использованием схем OptoLAC могут совпадать или превышать уровни, достигнутые при стандартной индукции изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозида (IPTG), тем самым сохраняя силу химической индукции, обеспечивая при этом повышенную настраиваемость и обратимость6. Таким образом, схемы OptoLAC обеспечивают эффективный оптогенетический контроль метаболической инженерии в E. coli.

figure-introduction-3
Рисунок 3: Схемы OptoLAC для динамического управления кишечной палочкой. Схемы OptoLAC адаптируют систему pDawn и lac operon для достижения активации в темноте и подавления на свету. В темноте YF1 фосфорилирует FixJ, который затем активирует промотор PFixK2 для экспрессии cI-репрессора . CI-репрессор предотвращает экспрессию репрессора lacI от промотора PR , что позволяет транскрипцию интересующего гена от lacO-содержащего промотора. И наоборот, синий свет снижает активность чистой киназы YF1, обращая вспять фосфорилирование FixJ и, следовательно, экспрессию cI , что снижает экспрессию lacI и предотвращает экспрессию от lacO-содержащего промотора. Эта цифра была изменена по сравнению с Лалвани и др.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Здесь мы опишем основные протоколы для контролируемых светом ферментаций S. cerevisiae и E. coli для химического или белкового производства. Как для дрожжей, так и для бактерий мы сначала фокусируемся на ферментациях со световой фазой роста и фазой производства, вызванной темнотой, обеспечиваемой схемами OptoINVRT и OptoLAC. Далее мы описываем протокол для трехфазной (рост, индукция, производство) легко контролируемой ферментации, обеспечиваемой схемами OptoAMP. Кроме того, мы описываем, как масштабировать оптогенетически контролируемые ферментации от микропластин до лабораторных биореакторов. С помощью этого протокола мы стремимся предоставить полное и легко воспроизводимое руководство для выполнения контролируемых светом ферментаций для химического или белкового производства.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Легкое химическое производство с использованием схемы S. cerevisiae OptoINVRT7

  1. Конструкция деформации
    1. Получают штамм с его3 ауксотрофией, так как этот маркер необходим для большинства существующих плазмид OptoINVRT5. Если вы ищете оптогенетическую регуляцию гена, который является родным для S. cerevisiae, постройте штамм, в котором удаляется любая эндогенная копия гена.
    2. Линеаризировать плазмиду, содержащую схему OptoINVRT7, такую как EZ-L4395, и интегрировать ее в his3-локус ауксотрофной деформации с использованием стандартных методов трансформации ацетата лития15. При использовании плазмиды EZ-L439, которая содержит компоненты для подавления PGAL1 на свету и активации его в темноте, линеаризуйте в месте ограничения PmeI.
    3. После трансформации центрифугируют клетки при 150 х г в течение 1 мин и осторожно повторно суспендируют в 200 мкл свежей синтетической полной среды (SC-His).
    4. Нанесите весь клеточный объем на агаровые пластины SC-His и инкубируйте при 30 °C в течение 2-3 дней, пока не появятся колонии.
    5. Подготовьте компетентные клетки из этого штамма, используя стандартные протоколы трансформации ацетата лития, и преобразуйте их плазмидой, содержащей ген (гены), который будет контролироваться оптогенетически после PGAL1-M или PGAL1-S промотора5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование плазмиды, которая интегрируется на δ-сайтах (YARCdelta5) и выбирает с Zeocin, обеспечивает стабильную мультикопийную интеграцию7,16,17,18.
    6. После трансформации центрифугируют культуру при 150 х г в течение 1 мин и осторожно повторно суспендируют в 200 мкл свежей SC-выпадной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промоутер PGAL1-M является синтетической версией промоутера PGAL1 с удаленными сайтами подавления Mig1p, в то время как PGAL1-S является инженерной версией PGAL1-M, которая имеет дополнительные сайты связывания активатора Gal4p. Для управления выражением можно использовать обычный промоутер PGAL1 ; тем не менее, сила выражения будет ниже, чем у этих инженерных промоутеров.
    7. Нанесите весь клеточный объем на агаровую пластину из экстракта дрожжей пептон декстрозы (YPD) при интеграции в δ-сайты, или на пластину SC-dropout, если она трансформируется плазмидой, содержащей маркер выделения. Инкубируйте при 30 °C в течение 16 ч при постоянном синем свете, чтобы поддерживать оптогенетически контролируемый ген подавленным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для некоторых штаммов колонии могут расти быстрее при инкубации в импульсах синего света (например, 1 с вкл/79 с выключено, 5 с вкл/75 с выключено, 10 с вкл/70 с выключено и т.д.), а не при постоянном освещении, которое при необходимости должно быть определено экспериментально для каждого штамма.
    8. Используйте любой источник света 465 нм и поместите светодиодную панель ~ 40 см над пластиной таким образом, чтобы интенсивность света составляла ~ 80-110 мкмоль / м2 / с. Измерьте интенсивность с помощью квантового измерителя (см. Таблицу материалов).
    9. При интеграции в δ-сайты создайте реплику пластины на пластинах YPD, содержащую диапазон концентраций цеоцинов от 400 мкг/мл до 1 200 мкг/мл, чтобы выбрать для различных интеграционных копий номера5,7,12,16,17,18. Инкубируйте реплики пластин при 30 °C при постоянном или импульсном синем свете в течение 2-3 дней, пока не появятся колонии.
  2. Предварительный отбор на лучшие колонии
    1. Выберите восемь колоний из каждой пластины и используйте их для прививки 1 мл среды SC-His, дополненной 2% глюкозой, в отдельных лунках 24-луночной пластины. Растут в 24-луночных пластинах под ячейками в течение ночи (16-20 ч) при 30 °C с 200 об/мин (диаметр орбиты 19 мм) при постоянном освещении синим светом.
    2. На следующее утро разводят каждую культуру в 1 мл свежей среды SC-His со значениями 2% глюкозы до OD600 в диапазоне от 0,01-0,3 и растут в 24-луночных пластинах при постоянном или импульсном свете при 30 °C с встряхиванием 200 об/мин до тех пор, пока они не достигнут плотности клеток от 2 до 9 значений OD600 (рисунок 4A). Количество времени, необходимое для этой фазы роста, будет зависеть от штамма.
    3. Инкубируйте пластины в темноте в течение 4 ч при 30 °C с встряхиванием 200 об/мин, выключив светлую панель и обернув пластины в алюминиевую фольгу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап позволяет клеткам метаболически переходить в фазу производства перед повторной суспензией в производственной среде.
    4. Чтобы начать фазу добычи, центрифугируют культуры в 24-луночной пластине при 234 х г в течение 5 мин и повторно суспендируют клетки в 1 мл свежей SC-капельной среды с 2% глюкозой. Запечатайте пластины для предотвращения испарения нужного продукта с помощью стерильной уплотнительной ленты для микропластин.
    5. Ферментировать герметичные пластины в темноте в течение 48 ч при 30 °C с встряхиванием при 200 об/мин. Убедитесь, что пластины обернуты в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить воздействие света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обертывание пластин в фольгу не ограничивает доступность кислорода или газа при ферментации; однако стерильная уплотнительная лента ограничивает передачу газа. Небольшие отверстия можно проткнуть в ленте для введения кислорода, если это необходимо.
  3. Сбор урожая и анализ
    1. Для сбора ферментаций центрифугируют пластины в течение 5 мин при 234 х г и переносят 800 мкл супернатанта в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл.
    2. В зависимости от интересующего химического вещества, анализируйте с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), газовой хроматографии-масс-спектрометрии (GC-MS) или другого аналитического метода с использованием метода пробоподготовки, наиболее подходящего для используемого прибора.

2. Легко контролируемое производство белка с использованием системы E. coli OptoLAC

  1. Конструкция деформации
    1. Совместное преобразование электрокомпетентного BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3 с плазмидой, содержащей схему OptoLAC1B или OptoLAC2B6 и плазмидой, экспрессирующей интересующий рекомбинантный белок из промотора PT719.
    2. После трансформации восстанавливают клетки в течение 1 ч в 1 мл супероптимального бульона с вытеснением катаболита (SOC; 2% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкозы) при 37 °C с вращением или встряхиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида, содержащая интересующий белок, должна быть совместима с плазмидой OptoLAC (т.е. другим маркером резистентности и происхождения репликации) и не должна содержать копию lacI.
    3. Центрифугируют клетки при 4845 х г в течение 3 мин и концентрируют гранулы в 200 мкл среды лизогенного бульона (LB). Поместите все концентрированные клетки на агаровую пластину LB с соответствующими антибиотиками и растут при 37 ° C в течение ночи при постоянном синем свете, чтобы поддерживать экспрессию белка подавленной.
  2. Первоначальный скрининг для проверки экспрессии
    1. Возьмите три одиночные колонии и используйте их для прививки 1 мл среды LB соответствующими антибиотиками в отдельных лунках 24-луночной пластины. Расти в течение ночи (16-20 ч) при 37 °C с встряхиванием 200 об/мин при постоянном освещении синим светом (рисунок 4A).
    2. На следующий день используйте 1,5 мкл культуры для измерения OD600 в спектрофотометре с микрообъемным измерением. Разбавляют культуры в 1 мл свежего LB в 24-луночных пластинах до значений OD600 в диапазоне от 0,01-0,1.
    3. Выращивайте культуры при 37 °C с 200 оборотами в минуту под синим светом в течение 2-3 ч. Начиная со второго часа, проводите измерения OD600 каждые 15 минут, чтобы убедиться, что культуры не превышают диапазон OD600 0,1-1,5.
    4. Как только культуры достигнут желаемого OD600, выключите световую панель и оберните пластину в алюминиевую фольгу, чтобы начать фазу производства. Держите пластину в темноте в течение 8 ч (37 °C), 20 ч (30 °C) или 48 ч (18 °C) с встряхиванием 200 об/мин.
    5. Измерьте и запишите окончательное значение OD600 для каждого языка и региональных параметров.
  3. Сбор урожая и анализ
    1. Переложите 800 мкл каждой культуры в микроцентрифужную трубку и центрифугу объемом 1,5 мл в течение 5 мин при 17 000 х г.
    2. Повторное суспендирование клеточной гранулы в 200 мкл буфера повторного суспензии (Tris 50 мМ, рН 8,0, NaCl 300 мМ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация NaCl может быть скорректирована на основе анализируемого рекомбинантного белка.
    3. Добавьте 50 мкл 6-кратного буфера образца додецилсульфата натрия (SDS) (Tris 375 мМ, pH 6,8, SDS 9%, глицерин 50%, бромфеноловый синий 0,03%, DTT 9%). Инкубировать при 100 °C в течение 10 мин с встряхиванием при 700 об/мин в термомиксоре.
    4. Загрузите ~3-20 мкл культуры в 12% гель SDS-PAGE. Используя окончательное измерение OD600 в качестве ориентира, загрузите примерно одинаковое количество белка для каждого образца (эквивалентно 10 мкл образца, соответствующего конечному значению OD600 , равному 1). Используйте блок питания для запуска электрофореза при 100 В до тех пор, пока гель не будет полностью разрешен.
    5. Окрашивают гель раствором Coomassie brilliant blue G-250 нагреванием в течение 30-40 с в микроволновой печи, а затем инкубируют на платформенный ротатор не менее 15 мин.
    6. Дважды смойте деионизированной водой и разложите на ротаторе платформы не менее 30 минут (или на ночь), добавив две очищающие салфетки, завязанные в узел, чтобы помочь впитать пятно. Кипятите гель в достаточном количестве воды в микроволновой печи в течение 15 минут, чтобы ускорить процесс очистки.

3. Трехфазная ферментация с использованием системы S. cerevisiae OptoAMP

  1. Конструкция деформации
    1. Получают штамм с ауксотрофным маркером his3, так как этот маркер необходим для того, чтобы использовать существующие плазмиды OptoAMP5. Если вы ищете оптогенетическую регуляцию гена, который является родным для S. cerevisiae, постройте штамм, в котором эндогенная копия этого гена удаляется.
    2. Линеаризировать плазмиду, содержащую схему OptoAMP4, такую как EZ-L58012, и интегрировать ее в локус his3 ауксотрофного штамма с использованием стандартных методов преобразования лития-ацетата15. При использовании EZ-L580 линеаризуйте плазмиду в месте рестрикции PmeI.
    3. После трансформации центрифугируют клетки при 150 х г в течение 1 мин и осторожно повторно суспендируют в 200 мкл свежей среды SC-His.
    4. Разложите весь клеточный объем на селективных средах (SC-His-agar) и инкубируйте при 30 °C в течение 2-3 дней до появления колоний.
    5. Подготовьте компетентные клетки из этого штамма и трансформируйте их с помощью плазмиды, содержащей ген (гены), который будет контролироваться оптогенетически ниже по течению промотора PGAL1-S12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование плазмиды, которая интегрируется на δ-сайтах и выбирает с Zeocin, обеспечивает стабильную мультикопийную интеграцию и выбор.
    6. После трансформации центрифугируют культуру при 150 х г в течение 1 мин и осторожно повторно суспендируют в 200 мкл свежей SC-выпадающей среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промоутер PGAL1-S представляет собой синтетическую версию промоутера PGAL1, в которой сайты подавления Mig1p удаляются, а дополнительные сайты связывания активатора Gal4p добавляются. Можно использовать обычный промоутер PGAL1 ; однако сила выражения будет ниже, чем у этого инженерного промоутера.
    7. Нанесите весь объем ячейки на агаровую пластину YPD или SC-dropout и инкубируйте при 30 °C в течение 16 ч в темноте (завернутой в алюминиевую фольгу). Инкубация в темноте подавляет оптогенетически контролируемый ген, что позволяет клеткам направлять свои метаболические ресурсы на рост клеток, а не на химическое производство.
    8. При интеграции в δ-сайтах реплицируют пластины на пластины YPD, содержащие диапазон концентраций цеоцинов, для выбора различных номеров интеграционных копий. Инкубировать пластины при 30 °C в темноте (завернутые в алюминиевую фольгу) в течение 2-3 дней до появления колоний.
  2. Предварительный отбор на лучшие колонии
    1. Выберите восемь колоний из каждой пластины и используйте их для прививки 1 мл среды SC-His 2% глюкозой в отдельных лунках 24-луночной пластины. Выращивайте клетки в течение ночи (16-20 ч) в темноте при 30 °C с встряхиванием 200 об/мин.
    2. На следующее утро разводят каждую культуру в 1 мл свежей среды SC-His с 2% глюкозы до 0,1 OD600 и растут в темноте при 30 °C с 200 оборотами в минуту, пока они не достигнут OD600 3. Оберните пластины в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить воздействие света. Количество времени, необходимое для этой фазы роста, будет зависеть от штамма.
    3. Чтобы начать фазу индукции, инкубируйте пластины под импульсным светом (например, 5 с вкл/95 с выключено) в течение 12 ч при 30 °C с встряхиванием 200 об/мин. Используйте любой источник света 465 нм и поместите светодиодную панель над пластиной таким образом, чтобы интенсивность света составляла ~80-110 мкмоль/м2/с для достижения оптимальных результатов (рисунок 4A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная продолжительность светового импульса для этой инкубации будет варьироваться в зависимости от производимого химического вещества. Рекомендуется отсеивать диапазон световых графиков от 0,1% (например, 1 с на выключении 999 с) до 100% (полный свет).
    4. Чтобы начать фазу производства, центрифугируют культуры при 234 х г в течение 5 мин и повторно суспендируют в свежей среде SC-His с 2% глюкозой. Запечатайте пластины для предотвращения испарения нужного продукта с помощью стерильной уплотнительной ленты для микропластин.
    5. Ферментировать герметичные пластины в свете в течение 48 ч при 30 °C с встряхиванием при 200 об/мин. Оптимизируйте график освещения на этом этапе, так как некоторые химические вещества выигрывают от импульсной фазы производства, а не от полного света.
  3. Сбор урожая и анализ
    1. Собирают ферментации путем центрифугирования пластин в течение 5 мин при 234 х г и переноса 800 мкл супернатанта в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
    2. В зависимости от интересующего химического вещества, анализируйте с использованием ВЭЖХ, GC-MS или другого аналитического метода с использованием метода пробоподготовки, наиболее подходящего для используемого инструмента.

4. Химическое (мевалонатное) производство из кишечной палочки в биореакторе с контролируемым светом

  1. Начальная инокуляция и настройка биореактора
    1. Инокулировать колонию штамма E. coli, спроектированного с помощью контролируемого светом химического производства, в 5 мл минимальных солей M9 (3,37 мМ Na2HPO4, 2,2 мМ KH2PO4, 0,855 мМ NaCl, 0,935 мМ NH4Cl), дополненных 0,2% мас./v казаминокислот, 5% мас./об глюкозы и смеси следовых металлов20 (0,0084 г/л ЭДТА, 0,0025 г/л CoCl2, 0,015 г/л MnCl2, 0,0015 г/л CuCl2, 0,003 г/л H3BO3, 0,0025 г/л Na2MoO4, 0,008 г/л ZnCl2, 0,06 г/л Fe (III) цитрата, 0,0045 г/л тиамина, 1,3 г/л MgSO4) в конической пробирке объемом 50 мл.
    2. Выращивайте культуру в течение ночи при 30 °C с встряхиванием 200 об/мин при освещении синим светом.
    3. Установите пластину головки сосуда биореактора, убедившись, что установлены следующие порты: вставка для термозонда; зонд растворенного кислорода (DO); газовый разборчик - подключение к источнику воздуха через фильтр 0,2 мкм; рабочее колесо; газовый конденсатор - подключение к фильтру 0,2 мкм; линия охлаждения (x2); линии подачи (x2) - одна для добавления среды, одна для контроля pH; линия отбора проб - убедитесь, что она достигает дна судна; пустой порт; pH зонд - откалибруйте зонд со стандартами pH = 4 и pH = 7 перед установкой, либо автоклав с остальной частью сосуда, либо стерилизуйте 95% этанолом и асептически вставьте перед установкой.
    4. Наполните сосуд 1 л фильтрованной воды, прикрепите головную пластину и затяните, убедившись, что уплотнительное кольцо плотно прилегает и уплотняется.
    5. Закройте любые отверстия в реакторе алюминиевой фольгой.
    6. Подготовьте три полоски трубки: одну для удаления воды, одну для введения корма и одну для контроля pH. Накройте концы алюминиевой фольгой и оберните все трубки в алюминиевую фольгу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: NH4OH, который используется для регулировки pH, не протекает плавно в силиконовых трубках, что может привести к неточным скоростям потока и чрезмерному базированию культуры. Чтобы избежать этой проблемы, используйте биосовместимые насосные трубки (BPT) для подачи NH4OH.
    7. Автоклав биореактора и трубки, используя 30-минутный жидкостный цикл.
    8. Извлеките материалы из автоклава. Как только остынет достаточно, подключите рабочее колесо, датчики pH и DO, источник воздуха, входное и выходное отверстие конденсатора, а также входное и выходное отверстие охлаждения к станции управления.
    9. Вставьте термозонд и накройте сосуд нагревательной рубашкой. Закрепите куртку к верхней части сосуда, чтобы избежать блокировки культуры от воздействия света.
    10. Подключите одну из стерильных трубок к линии отбора проб и закрепите ее через насос для отбора проб. Поместите другой конец так, чтобы он стекал в пустой контейнер, который может вместить не менее 1 л. Слейте воду внутрь сосуда.
    11. Подключите еще одну стерильную трубку к одной из линий подачи и закрепите через один из питательных насосов. Подключите другой конец трубки к бутылке носителя M9. Подайте среду в реактор.
    12. Подключите еще одну стерильную трубку к одной из линий подачи и закрепите через один из питательных насосов. Подключите другой конец трубки к флакону, содержащему 28%-30% NH4OH.
      ВНИМАНИЕ: NH4OH является коррозионным. Работайте в вытяжном шкафу при переносе в бутылочку для корма и убедитесь, что кормовая бутылка помещена во вторичную защитную оболочку.
    13. Поместите три световые панели в треугольную формацию ~20 см от реактора, проверив, что интенсивность света на поверхности сосуда достигает ~80-110 мкмоль/м2/с с каждой стороны (рисунок 4B).
    14. На следующий день включите систему биореактора и чиллер. Установите заданное значение температуры реактора на 37 °C, заданное значение pH на 7,0, а перемешивание на 200 об/мин. Нагревательная рубашка должна включиться.
    15. Откалибруйте зонд DO, сначала дождавшись, пока температура и измерения DO не станут постоянными (это будет 100% заданное значение). Затем отключите зонд от системы (это будет заданное значение 0%). Повторяйте до тех пор, пока измерение DO не стабилизируется на 100% при подключении зонда, а затем установите заданное значение DO равным 20%.
  2. Химическое производство с легким контролем
    1. Инокулируют биореактор к исходному OD600 0,001-0,1. Включите световые панели, чтобы начать рост.
    2. Через 3 ч начните брать образцы с линии отбора проб для проведения измерений OD600 , чтобы избежать зарастания оптимальной плотности индукции ячеек (ρs). Как только будет достигнут оптимальный ρs (оптимальное значение для производства мевалоната составляет 0,17), выключите световые панели, накройте реактор алюминиевой фольгой и оберните установку в черную ткань, чтобы начать темную фазу производства.
    3. Добавляют 50 мкл пенопласта через 8 ч после перехода в темноту. Открутите пустое отверстие и пипетку антипены непосредственно в реактор.
    4. Используйте порт для отбора проб для периодического отбора проб для анализа ВЭЖХ или ГК.
  3. Разборка и анализ
    1. После завершения эксперимента выключите систему. Осторожно открутите датчики DO и pH и вымойте их водой с мылом. Открутите головную пластину и вымойте ее с мылом и водой с помощью щетки.
    2. Переложите культуру в пустую емкость и добавьте отбеливатель до конечной концентрации 10% v/v. Поместите в вытяжку и утилизируйте через 30 мин.
    3. Промыть корпус реактора водой с мылом с помощью щетки.
    4. Подготовьте образцы к анализу на основе интересующего продукта. Для получения мевалоната смешайте 560 мкл культуры со 140 мкл 0,5 М HCl и вихрь с высокой скоростью в течение 1 мин. Это превращает мевалонат в (±)-мевалонолактон.
      ВНИМАНИЕ: HCl представляет опасность для здоровья. Используйте надлежащие СИЗ и убедитесь, что пробоотборники правильно закрыты перед вихрем.
    5. Центрифуга при 17 000 х г в течение 45 мин при 4 °C. Перенесите 250 мкл супернатанта во флакон ВЭЖХ.
    6. Для мевалоната проанализируйте образцы с использованием ионообменной колонны органических кислот. Количественная оценка производства с помощью детектора показателя преломления (RID), сравнивая пиковые области со стандартом (±)-мевалонолактона.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оптогенетическая регуляция микробного метаболизма была успешно реализована для производства различных продуктов, включая биотопливо, сыпучие химические вещества, белки и натуральные продукты5,6,7,12,13. Большинство из этих процессов предназначены для роста клеток на свету (когда низкая плотность клеток создает минимальные проблемы с проникновением света) и для...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Динамический контроль уже давно применяется для повышения урожайности для метаболической инженерии и производства рекомбинантного белка4. Сдвиги в ферментативной экспрессии чаще всего реализуются с использованием химических индукторов, таких как IPTG21, галактоза22 и тетрациклин23, но также были опосредованы с использованием условий процесса, таких как температура и рН. Оптогенетический контроль экспрессии генов устраняет необ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы подали заявки на несколько патентов на оптогенетические схемы и способы, описанные в данной статье.

Благодарности

Это исследование было поддержано Министерством энергетики США, Управлением науки, Управлением биологических и экологических исследований под номером DE-SC0019363, премией NSF CAREER CBET-1751840, благотворительными фондами Pew Charitable Trusts и премией Камиля Дрейфуса для учителей-ученых.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Светоуправляемое химическое производство с использованием S. cerevisiae
24-луночный культуральный планшетСША ScientificCC7672-7524
Порошок агараThermo Fisher Scientific303991049
Алюминиевая фольгаReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer с μ кюветаEppendorf6135000923
Синяя светодиодная панельHQRP884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 Плазмидан/д/дСм. ссылку 1
ГлюкозаThermo Fisher Scientific501879892 (G8270-5KG)
МикроцентрифугаThermo Fisher Scientific75002403
Микроцентрифуга пробиркиСША Scientific1615-5510
Орбитальный шейкерYamato Scientific AmericaSOU-300
Чашка ПетриCelltreat229656
PmeINew England BiolabsR0560L
Квантовый метрApogee InstrumentsMQ-510
Репликационное устройствоThomas ScientificF37848-0000
Репликация гальванических прокладокSunrise Science Products3005-012
SC-His powderSunrise Science Products1303-030
SC Complete powderSunrise Science Products1459-100
Стерильная герметизирующая пленкаExcel ScientificSTR-SEAL-PLT
YPD агаровые пластиныVWR100217-054
ZeocinThermo Fisher ScientificR25005
Контролируемое светом производство белка с использованием E. coli
6X SDS Буфер для образцовCepham Life Sciences10502
12% акриламидные белковые гелиThermo Fisher ScientificNP0341BOX
24-луночный культуральный планшетСША Scientific Scientific ScientificCC7672-7524
РейнольдсаB004NG90YOалюминиевой фольги
с μ кюветаEppendorf6135000923
Синяя светодиодная панельHQRP884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250Thermo Fisher Scientific20279
Электрофорезная ячейкаBio-Rad1658004
Электрофорез Источник питанияBio-Rad1645050
LB (Miller)Fisher Scientific
МикроцентрифугаThermo Fisher Scientific75002403
Микроцентрифужные пробиркиСША Scientific1615-5510
NaClThomas ScientificSX0425-1
OptoLAC плазмидын/д н/дСм. ссылку 2
Орбитальный шейкерYamato Scientific AmericaSOU-300
Чашка ПетриCelltreat229656
Квантовый метрApogee InstrumentsMQ-510
SOC среднийThermo Fisher Scientific15544034
ТермомиксерEppendorf5382000015
Трис основаFisher ScientificBP1521
Трехфазная ферментация с использованием S. cerevisiaeТе
что и в протоколе "Светоуправляемое химическое производство с использованием S. cerevisiae", а также следующее:
EZ-L580 OptoAMP4 PlasmidN/AN/AСм. Ссылку 10
Химическое производство в биореакторе с регулируемым светом
Алюминиевая фольгаБиореактор ReynoldsB004NG90YO
AntifoamSigma-AldrichA8311
со станцией управленияEppendorfB120110001
Биоспектрометр с μ кюветаEppendorf6135000923
отбеливательVWR Scientific89501-620 (CS)
Синяя светодиодная панельHQRP884667106091218
трубка BPTFisherScientific 14-170-15
ГлюкозаThermo Fisher Scientific501879892 (G8270-5KG)
Соляная кислота (HCl)Fisher Scientific7647-01-0
M9 Минимальное количество солейThermo Fisher ScientificA1374401
микроцентрифугаThermo Fisher Scientific75002403
микроцентрифужные пробиркиСША Scientific1615-5510
NH4OH РастворSigma-AldrichI0503-1VL
Орбитальный шейкерYamato Scientific AmericaSOU-300
Квантовый метрApogee InstrumentsMQ-510
SC Complete powderSunrise Science Products1459-100
нБиоспектрометр BP97235 же материалы,

Ссылки

  1. Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. The rise and shine of yeast optogenetics. Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).
  2. Pouzet, S., et al. The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151(2020).
  3. Venayak, N., Anesiadis, N., Cluett, W. R., Mahadevan, R. Engineering metabolism through dynamic control. Current Opinion in Biotechnology. 34, 142-152 (2015).
  4. Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Avalos, J. L. Current and future modalities of dynamic control in metabolic engineering. Current Opinion in Biotechnology. 52, 56-65 (2018).
  5. Zhao, E. M., et al. Design and characterization of rapid optogenetic circuits for dynamic control in yeast metabolic engineering. ACS Synthetic Biology. 9 (12), 3254-3266 (2020).
  6. Lalwani, M. A., et al. Optogenetic control of the lac operon for bacterial chemical and protein production. Nature Chemical Biology. 17 (1), 71-79 (2021).
  7. Zhao, E. M., et al. Optogenetic regulation of engineered cellular metabolism for microbial chemical production. Nature. 555 (7698), 683-687 (2018).
  8. Baumschlager, A., Khammash, M. Synthetic biological approaches for optogenetics and tools for transcriptional light-control in bacteria. Advanced Biology. 5 (5), 2000256(2021).
  9. Dvorak, P., et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) carrying a synthetic metabolic pathway. Microbial Cell Factories. 14, 201(2015).
  10. Hartline, C. J., Schmitz, A. C., Han, Y., Zhang, F. Dynamic control in metabolic engineering: Theories, tools, and applications. Metabolic Engineering. 63, 126-140 (2021).
  11. Ni, C., Dinh, C. V., Prather, K. L. J. Dynamic control of metabolism. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 12, 519-560 (2021).
  12. Zhao, E. M., et al. Optogenetic amplification circuits for light-induced metabolic control. ACS Synthetic Biology. 10 (5), 1143-1154 (2021).
  13. Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Wegner, S. A., Avalos, J. L. The Neurospora crassa Inducible Q System Enables Simultaneous Optogenetic Amplification and Inversion in Saccharomyces cerevisiae for Bidirectional Control of Gene Expression. ACS Synthetic Biology. 10 (8), 2060-2075 (2021).
  14. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  16. Marx, H., Mecklenbräuker, A., Gasser, B., Sauer, M., Mattanovich, D. Directed gene copy number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus. FEMS Yeast Research. 9 (8), 1260-1270 (2009).
  17. Nordén, K., et al. Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris. BMC Biotechnology. 11, 47(2011).
  18. Zhao, E. M., et al. Light-based control of metabolic flux through assembly of synthetic organelles. Nature Chemical Biology. 15 (6), 589-597 (2019).
  19. Dowee, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
  20. Zhou, K., Edgar, S., Stephanopoulos, G. Engineering microbes to synthesize plant isoprenoids. Methods in Enzymology. 575, 225-245 (2016).
  21. Arfman, N., Worrell, V., Ingram, L. O. Use of the tac promoter and lacI(q) for the controlled expression of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis. Journal of Bacteriology. 174 (22), 7370-7378 (1992).
  22. Steen, E. J., et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial Cell Factories. 7 (1), 1-8 (2008).
  23. Tan, S. Z., Manchester, S., Prather, K. L. J. Controlling central carbon metabolism for improved pathway yields in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 116-124 (2015).
  24. Jayaraman, P., et al. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6994(2016).
  25. Fernandez-Rodriguez, J., Moser, F., Song, M., Voigt, C. A. Engineering RGB color vision into Escherichia coli. Nature Chemical Biology. 13 (7), 706-708 (2017).
  26. Ding, Q., et al. Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production. Nature Communications. 11 (1), 1-14 (2020).
  27. Senoo, S., Tandar, S. T., Kitamura, S., Toya, Y., Shimizu, H. Light-inducible flux control of triosephosphate isomerase on glycolysis in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 116 (12), 3292-3300 (2019).
  28. Ramakrishnan, P., Tabor, J. J. Repurposing synechocystis PCC6803 UirS-UirR as a UV-violet/green photoreversible transcriptional regulatory tool in E. Coli. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 733-740 (2016).
  29. Tabor, J. J., Levskaya, A., Voigt, C. A. Multichromatic control of gene expression in escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 405 (2), 315-324 (2011).
  30. Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (120), e54894(2017).
  31. Grødem, E. O. S., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
  32. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, (2016).
  33. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  34. Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biology. 18 (7), (2020).
  35. Carrasco-López, C., García-Echauri, S. A., Kichuk, T., Avalos, J. L. Optogenetics and biosensors set the stage for metabolic cybergenetics. Current Opinion in Biotechnology. 65, 296-309 (2020).
  36. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (1), 1-11 (2016).
  37. Melendez, J., et al. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology: Quantitative Biosciences From Nano to Macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  38. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  39. Castillo-Hair, S. M., Baerman, E. A., Fujita, M., Igoshin, O. A., Tabor, J. J. Optogenetic control of Bacillus subtilis gene expression. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  40. Xia, A., et al. Optogenetic modification of pseudomonas aeruginosa enables controllable twitching motility and host infection. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 531-541 (2021).
  41. Pu, L., Yang, S., Xia, A., Jin, F. Optogenetics manipulation enables prevention of biofilm formation of engineered pseudomonas aeruginosa on surfaces. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 200-208 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Escherichia coliSaccharomyces cerevisiae

Похожие статьи