Method Article

Протокол на основе лазерной микродиссекции для анализа протеомного профиля гранул нейромеланина LC-MS/MS

DOI:

10.3791/63289

⸱

December 16th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medizinisches Proteom-Center, Medical Faculty, Ruhr-University Bochum, 2Medical Proteome Analysis, Center for Proteindiagnostics (PRODI), Ruhr-University Bochum, 3Center of Mental Health; Clinic and Policlinic for Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital Wuerzburg, 4Psychiatry Department of Clinical Research, University of Southern Denmark Odense University Hospital, 5Center of Mental Health, Department of Child and Adolescent Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital of Wuerzburg, University of Wuerzburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен надежный протокол для выделения гранул нейромеланина из посмертной субстанции nigra pars compacta человека с помощью лазерной микродиссекции. Этот пересмотренный и оптимизированный протокол значительно минимизирует необходимое время для сбора образцов, уменьшает требуемое количество образца и улучшает идентификацию и количественную оценку белков с помощью анализа LC-MS / MS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейромеланин представляет собой черно-коричневатый пигмент, присутствующий в так называемых гранулах нейромеланина (НМГ) в дофаминергических нейронах черной субстанции pars compacta. Помимо нейромеланина, НМГ содержат различные белки, липиды и металлы. Хотя NMG-содержащие дофаминергические нейроны преимущественно теряются при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона и деменция с тельцами Леви, о механизме образования НМГ и роли НМГ в здоровье и болезни известно лишь немного. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования молекулярной характеристики НМГ. К сожалению, стандартные протоколы выделения белков основаны на ультрацентрифугировании градиента плотности и поэтому требуют большого количества тканей человека. Таким образом, здесь установлен автоматизированный протокол на основе лазерной микродиссекции (LMD), который позволяет собирать NMG и окружающую ткань черной субстанции (SN) с использованием минимального количества ткани непредвзятым, автоматизированным способом. Иссеченные образцы впоследствии анализируются масс-спектрометрией для расшифровки их протеомного состава. С помощью этого рабочего процесса было идентифицировано 2079 белков, из которых 514 белков были идентифицированы исключительно в NMG и 181 в SN. Настоящие результаты были сопоставлены с предыдущим исследованием с использованием аналогичного подхода, основанного на LMD, достигшего перекрытия 87,6% для обоих протеомов, что подтверждает применимость пересмотренного и оптимизированного протокола, представленного здесь. Чтобы подтвердить текущие результаты, интересующие белки были проанализированы с помощью целевой масс-спектрометрии, например, параллельных экспериментов по мониторингу реакций (PRM).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Каждая ткань состоит из гетерогенной смеси различных типов клеток, но специфическое выделение одного типа клеток часто необходимо для более точной характеристики. Лазерная микродиссекция (LMD), соединяющая микроскоп с лазерным применением, является мощным инструментом для специфического выделения областей тканей, отдельных клеток или клеточных подструктур из сложного композита. Применение LMD в сочетании с масс-спектрометрией (LMD-MS) уже успешно реализовано для нескольких исследовательских вопросов, включая выделение ДНК1, РНК2 и белков 3,4,5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование мозговой ткани человека было одобрено комитетом по этике Рурского университета в Бохуме, Германия (номер файла 4760-13), в соответствии с немецкими правилами и руководящими принципами. Этот протокол был применен к коммерчески полученным срезам ткани substantia nigra pars compacta . Графический обзор представленного протокола показан на рисунке 1.

1. Сечение тканей

  1. Предварительно охладите криостатную камеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая ткань требует различных температур криостата, которые можно найти в соответствующем протоколе поставщика.
  2. Очистите нож из нер....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Специфическая изоляция NMG и ткани SN является наиболее важным шагом для успешного применения этого протокола. Используя функцию анализа поля зрения в программном обеспечении LMD, предоставляемом поставщиком, NMG могут быть автоматически выбраны в зависимости от цвета. Поэтому необходимо идентифицировать участки тканей, содержащие НМГ (рисунок 2А), и провести анализ поля зрения с скорректированными пороговыми значениями цвета, что приведет к маркировке НМГ (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LMD является широко применимым методом выделения определенных областей тканей, отдельных клеток или субклеточных структур. В пересмотренном и автоматизированном протоколе, представленном здесь, этот метод применяется для специфической изоляции гранул нейромеланина (NMG) и NMG-окружающих тканей (SN). До сих пор были опубликованы и широко использовались два различных подхода к выделению НМГ из посмертной ткани головного мозга человека:

а) Прерывистый градиент сахарозы, потребляющий 1 г .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана de. NBI, проект Федерального министерства образования и исследований Германии (BMBF) (номер гранта FKZ 031 A 534A) и P.U.R.E. (Исследовательский отдел белка в Руре в Европе) и Центр белковой диагностики (ProDi), гранты, оба от Министерства инноваций, науки и исследований Северного Рейна-Вестфалии, Германия.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-дитиотреитолAppliChemA1101
АцетонитрилMerck1.00029.2500
Бикарбонат аммонияSigma-AldrichA6141
Муравьиная кислотаSigma-Aldrich56302
ЙодоацетамидAppliChemA1666,0100
Micro Tube 500Carl Zeiss415190-9221-000
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid масс-спектрометрThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeamZeiss494800-0014-000
PEN мембранный слайдCarl Zeiss415190-9041-000
substantia nigra pars compacta срезы тканиNavarrabiomed Biobank (Памплона, Испания)
Трифторуксусная кислотаMerck91707
Трипсин секвенирование классаServa37283.01
Ultimate 3000 RSLC nano LC системаThermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
Название программного обеспеченияWeblink/CompanyВерсия
FreeStyleThermo Fisher Scientific1.6
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/1.6.17.0
PALMRoboZeiss4.6 pro
Perseushttps://www.maxquant.org/perseus/1.6.15.0
Skylinehttps://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view20.2.0.343
XCaliburThermo Fisher Scientific4.3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316(2011).
  2. Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser MicrodissectionNeuromelanin GranulesProteomic AnalysisMass SpectrometrySubstantia NigraProtein QuantificationLabel Free QuantificationTryptic DigestionParallel Reaction MonitoringDopaminergic Neurons

Related Articles