Методическая статья

Микрофлюидный акустофорез для сквозного разделения грамотрицательных бактерий с использованием аффинных шариков Аптамера

DOI:

10.3791/63300

⸱

17 октября 2022 г.

 ,  ,  , 
1Department of Digital Anti-Aging Health Care, Inje University, 2Micro device Lab Co., Ltd, 3Biohealth Products Research Center (BPRC), Inje University, 4Department of Biomedical Engineering, Inje University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе описывается изготовление и эксплуатация микрофлюидных акустофоретических чипов с использованием метода микрофлюидного акустофореза и модифицированных аптамерами микрошариков, которые могут быть использованы для быстрого и эффективного выделения грамотрицательных бактерий из среды.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается изготовление и эксплуатация микрофлюидных акустофоретических чипов с использованием метода микрофлюидного акустофореза и модифицированных аптамерами микрошариков, которые могут быть использованы для быстрого и эффективного выделения грамотрицательных бактерий из среды. Этот метод повышает эффективность разделения с помощью смеси длинных квадратных микроканалов. В этой системе образец и буфер вводятся во входной порт через контроллер потока. Для центрирования шариков и разделения образцов питание переменного тока подается на пьезоэлектрический преобразователь через функциональный генератор с усилителем мощности для создания силы акустического излучения в микроканале. Существует раздвоенный канал как на входе, так и на выходе, что обеспечивает одновременное разделение, очистку и концентрацию. Устройство имеет скорость восстановления >98% и чистоту от 97,8% до 10-кратной концентрации дозы. Это исследование продемонстрировало скорость восстановления и чистоту выше, чем существующие методы разделения бактерий, предполагая, что устройство может эффективно разделять бактерии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разрабатываются микрофлюидные платформы для выделения бактерий из медицинских и экологических образцов, в дополнение к методам, основанным на диэлектрическом переносе, магнитофорезе, извлечении шариков, фильтрации, центробежной микрофлюидике и инерциальных эффектах, а также поверхностных акустическихволнах 1,2. Обнаружение патогенных бактерий продолжают с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), но обычно она трудоемкая, сложная и трудоемкая 3,4. Системы микрофлюидного акустофореза являются альтернативой для решения этой проблемы за счет разумной пропускной способности и бесконтактной изоляции клеток 5,6,7. Акустофорез — это технология, которая отделяет или концентрирует шарики, используя явление движения материала через звуковую волну. Когда звуковые волны попадают в микроканал, они сортируются по размеру, плотности и т. д. шариков, а клетки могут быть разделены в соответствии с биохимическими и электрическими свойствами суспензионной среды 7,8. Соответственно, активно проводилось много акустофоретических исследований 9,10,11, а в последнее время было введено 3D-численное моделирование акустофоретического движения, индуцированного граничным акустическим потоком в микрофлюидике акустических волн стоячей поверхности12.

Исследования в различных областях изучают, как заменить антитела 2,3. Аптамер является целевым материалом, обладающим высокой селективностью и специфичностью, и многие исследования проводятся 2,9,10,13. Аптамеры имеют преимущества небольшого размера, отличной биологической стабильности, низкой стоимости и высокой воспроизводимости по сравнению с антителами и изучаются в диагностических и терапевтических приложениях 2,3,14.

Здесь в этой статье описывается протокол технологии микрофлюидного акустофореза, который может быть использован для быстрого и эффективного отделения грамотрицательных (GN) бактерий из среды с использованием модифицированных аптамерами микрошариков. Эта система генерирует двумерную (2D) акустическую стоячую волну через одиночное пьезоэлектрическое срабатывание путем одновременной стимуляции двух ортогональных резонансов в длинном прямоугольном микроканале для выравнивания и фокусировки прикрепленных к аптамеру микрошариков в узле и точках антиузла для эффективности разделения 2,11,15,16 . Существует раздвоенный канал как на входе, так и на выходе, что обеспечивает одновременное разделение, очистку и концентрацию.

Этот протокол может быть полезен в области ранней диагностики бактериальных инфекционных заболеваний, а также быстрого, селективного и чувствительного ответа на патогенные бактериальные инфекции посредством мониторинга воды в режиме реального времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Микрофлюидный дизайн чипа акустофореза

ПРИМЕЧАНИЕ: На фиг.1 показана схема разделения и сбора микрошариков-мишеней из микроканалов методом акустофореза. Микрофлюидный чип акустофореза разработан с помощью программы САПР.

  1. Разработайте микрофлюидный чип акустофореза, который использует смесь модифицированных аптамером бусин и полистирольных шариков со стрептавидиновым покрытием (PS), соответствующих размеру бактерий, для изучения производительности разделения устройства.
  2. Спроектируйте микрофлюидный чип акустофореза, который собирает ШАРИКИ PS на целевом выходе и отбрасывает остальное через выходное отверстие после введения смеси образца PS во входное отверстие образца (см. Рисунок 2 и Таблицу 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой цели акустофлюидный чип состоит из двух входов для впрыска образцов и буфера, основного канала с прикрепленным пьезоэлектрическим преобразователем (PZT), позволяющего выровнять микрошарики по центру, и двух выходов, через которые собираются образцы и выбрасываются отходы (рисунок 3A).
  3. Спроектируйте микрофлюидный чип акустофореза, в котором микрошарики, буфер, бактерии и аптамеры проходят через основной канал, причем микрогранулы выровнены по центру с помощью акустофореза в чипе, индуцированного PZT (рисунок 3B, C)

2. Изготовление микрофлюидного акустофореза

ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите четыре слоя в следующем порядке: боросиликатный стекло-кремниевый слой, кремниевый слой, боросиликатный стеклянный слой и слой PZT, как показано на рисунке 3A, B.

  1. Подготовьте боросиликатное стекло (самый верхний слой) с отверстиями диаметром 2 мм с помощью пескоструйнойобработки 17 на входе и выходе для соединения трубок из полиэфирэфиркетона (PEEK). Боросиликатное стекло имеет размеры 20 × 80 × 0,5 мм3.
  2. Готовят слой кремниевого канала толщиной 200 мкм с микроканалом с площадью поперечного сечения 0,2 × 0,2мм2, сформированный с помощью фоторезиста и кремниевого рисунка, полученного методом глубокого реакционноспособного ионного травления (RIE)18. Просверлите отверстия диаметром 1 мм для входных каналов образца и буфера, а также каналов сбора и выпуска отходов во время реакционно-ионного травления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь ионное травление использует процесс RIE для формирования микроканалов. Фоторезист был нанесен в форме канала на кремниевую пластину для слоя кремниевого канала. Кремниевую пластину с PR-покрытием травили плазмой, генерируемой путем нанесения 13,56 МГц на фтор18.
  3. Подготовьте стружку со слоями выше и ниже слоя кремния (20 × 80 × 0,5 мм3), приготовленными на стадии 2,2 (20 × 80 × 0,5 мм3), прикрепленной к боросиликатному стеклу на стадии 2.1 и третьему боросиликатному стеклянному слою с использованием анодирования при 1000 В и 400 °C19.
  4. Прикрепите PZT (20 × 40мм2) к боросиликатному стеклянному слою вдоль микрофлюидного канала с помощью цианоакрилатного клея (10 мкл или менее).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесите клей в виде очень тонкого слоя в канал с помощью ватного тампона, чтобы свести к минимуму любое изменение высоты. На рисунке 3C показано изображение устройства.

3. Бактериальные штаммы и культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к таблице 2 для отбора и инкубации GN и грамположительных (GP) бактерий для экспериментов. Для метода культуры обратитесь к шагам 3.1-3.4. Все бактерии следует инкубировать в аэробных условиях до получения абсорбции 0,4 при600 нм (OD 600).

  1. Для бактерий GN, таких как Escherichia coli DH5α, Escherichia coli KCTC2571, Sphingomonas insulae и Pseudomonas pictorum и бактерий GP, таких как Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus pasteuri, инкубируют в среде Luria-Bertani при 37 °C и 220 об/мин в течение 16 ч.
  2. Для энтеробактеров (GN) и Bacillus megaterium (GP; KCTC 1021), инкубируют в питательной среде бульона при 37 °C и 220 об/мин в течение 16 ч.
  3. Для Enterococcus thailandicus (GP) инкубируют в среде de Man, Rogosa и Sharpe (MRS) при 37 °C и 220 об/мин в течение 16 ч.
  4. Для Listeria grayi (GP) инкубируют в инфузионной среде сердца мозга при 37 °C и 220 об/мин в течение 16 ч.
  5. Центрифугу (9056 х г) культивируемые бактерии в течение 1 мин при комнатной температуре (RT), затем дважды промыть 1x фосфат-буферным солевым (PBS) буфером.
  6. Подготовьте выбранные бактерии GN и GP к анализу путем повторного использования в буфере PBS.

4. Микрошарики и иммобилизация аптамера на микрошарики

  1. Перед использованием повторно суспендируйте смесь микрогранул со стрептавидиновым покрытием (10 мкм) (Таблица материалов) (перемешайте с помощью вихрей в течение 20 с).
  2. Готовят аптамер путем денатурации при 95 °C в течение 3 мин, а затем повторного складывания при 0 °C в течение 2 мин.
  3. Переложить 250 мкл суспендированной смесью микрогранул, покрытой стрептавидином, в пробирку объемом 1,5 мл и промыть буфером Tris-HCl (50 мМ Tris, рН 7,4, 1 мМ MgCl2, 5 мМ KCL, 100 мМ NaCl) на RT. Затем добавьте в трубку 100 мкл биотинилированного ДНК-аптамера.
  4. Инкубировать смесь на RT в течение 30 мин при вращении (25 об/мин).
  5. После центрифугирования (9056 х г) дважды промыть трубку 200 мкл буфера Tris-HCl на RT.
  6. Добавьте 10 мкл BSA (100 мг/мл) в промытую пробирку и инкубируйте в течение 30 мин на RT с вращением (25 об/мин).
  7. Наконец, дважды промыть модифицированные аптамером микрогранулы центрифугированием (9056 х г) в буфере Tris-HCl при RT.

5. Настройка и эксплуатация акустофореза

  1. Соедините трубки PEEK с двумя входными отверстиями для впрыска двух образцов и буфера и двумя выходами для сбора и сброса отходов (рисунок 4).
  2. Вручную заполните канал микрофлюидного акустофореза безпузырьковой деминерализованной водой с помощью шприца объемом 10 мл.
  3. Подготовьте прецизионный регулятор давления с двумя или более выходными каналами для управления потоком жидкости. Затем наполовину заполните флаконы образцом и буфером с двумя отверстиями в их колпачках, соответственно, и подключите к входу чипа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прецизионный контроллер давления с двумя или более выходными каналами может быть заменен несколькими прецизионными регуляторами давления. На входе буфера буфер, способный генерировать ламинарный поток, который предотвращает перемещение образца в центр во время впрыска образца, вводится через контроллер потока.
  4. После подготовки устройства вводят образец и буфер, применяя давление 2 кПа на вход образца и 4 кПа на буферное входное отверстие с помощью прецизионного устройства контроля давления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В это время для плавного ламинарного потока давление впрыска буфера должно быть выше, чем давление впрыска образца. Поток управляется контроллером потока, закрепленным на аспираторе, подключенном к входному каналу.
  5. Сосредоточьтесь на шарике, чтобы переместить его в центр микрофлюидного канала с помощью PZT во время проверки через микроскоп.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чем больше шарик, тем больше влияние на форму сигнала, поэтому его легче выровнять с точкой узла. Функциональный генератор с усилителем подает мощность на PZT для генерации синусоиды в микроканале. Поскольку верхняя и нижняя части микроканала сделаны из стекла, генерируемая синусоида отражается и создает точку узла7.
  6. Генерируйте резонансную частоту 3,66 МГц с помощью генератора одноканальной функции и усиливайте типичный сигнал на 16 дБ (примерно в девять раз) с помощью усилителя мощности (рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Резонансная частота привода должна соответствовать размеру канала; поскольку канал квадратный, PZT работает на точной частоте, чтобы создать один узел.
  7. Наблюдайте за процессами разделения и обогащения на акустофлюидном чипе с помощью флуоресцентного микроскопа и высокоскоростной камеры, работающей со скоростью 1 200 кадров в секунду.
  8. Количественная оценка и анализ присутствия или отсутствия бактерий GN и бактерий GP путем проверки изображений, сделанных с помощью камеры флуоресцентного микроскопа связанных с бактериями шариков и бактерий, выделяемых через образцы сбора и выхода отходов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микрошарики с буфером, бактериями и аптамерами проходят через основной канал, а микрогранулы выравниваются по центру с помощью внутричипового акустофореза, индуцированного PZT. Наконец, микрошарики, которые имеют связанные бактерии GN, собираются на выходе сбора, а несобранные бактерии сбрасываются через выход отходов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 5 показано изображение потока шарика в зависимости от напряжения PZT (OFF, 0,1 В, 0,5 В, 5 В). В случае акустофоретического чипа, представленного в этом исследовании, было подтверждено, что по мере увеличения напряжения PZT центральная концентрация шариков размером 10 мкм увеличивалась. Большинство бусин размером 10 мкм были сосредоточены в центре при напряжении PZT 5 В. Благодаря этому результату резонансная частота 3,66 МГц была сгенерирована в генераторе одноканальной функции, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали микрофлюидное устройство звуковой левитации для захвата и передачи бактерий GN из образцов культуры на высокой скорости на основе метода непрерывного хода в соответствии с их размером и типом, а также модифицированных аптамерами микрошариков. Длинный квадратный микроканал обеспечивает более простую конструкцию и большую экономическую эффективность для 2D-акустофореза, чем сообщалось ранее 20,21,22,23,24,25,26...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым корейским правительством (Министерство науки и ИКТ). (Нет. НРФ-2021R1A2C1011380)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 & микро; m Микрогранулы из полистиролаBang LaboratoriesPS04001Размер клеток
10 & микро; m Микрошарики со стрептавидиновым покрытиемBang LaboratoriesCP01007Аффинные бусины Aptamer
4-дюймовые Кремниевая пластина/форма SU-84science29-03573-01Компоненты чипа
AptamerIntegrated DNA TechnologiesGN3-6'RNAдля конъюгации бактерий
Боросиликатное стеклоSchottBOROFLOAT 33Компоненты чипа
CentrifugeDaihanCF-10Расходующиеся частицы
Цианоакрилатный клей3MAD100Прикрепите PZT к микрочипу
Escherichia coli DH5&альфа;KCTCKCTC2571Целевые бактерии
Функциональный генераторGW InstekAFG-2225Генератор частоты
Высокоскоростная камераPhotronFASTCAM MiniНаблюдение за разделением
Горячая плитакак однаHI-1000Нагревательная пластина для отверждения жидкости PDMS
KOVAX-ШПРИЦ 10 мл ШприцКореявакцина22G-10MLЗаполните канал микрофлюидного акустофореза деминерализованной водой без пузырьков.
Жидкий полидиметилсилоксан, PDMSDow Corning Inc.Sylgard 184Компоненты чипса
LB Бульон MillerBD Difco244620Клеточная культура (среда Лурия-Бертани)
МикроскопOlympus Corp.IX-81Наблюдение за разделением
буфера PBSCapricorn scientificPBS-1AWasing bacteria
PEEK TubesSaint-Gobain Ppl Corp.AAD04103Впрыск или сбор частиц
Пьезоэлектрический преобразовательFuji CeramicsC-213Генерация удельной волны в
канале Усилитель мощностиУсилитель Research75A250AУсиление частоты
Регулятор давления/μ fluconAMEDAMED-μ fluconУправление регулятором давления/расхода воздуха
Tris-HCl буферныйинвитроген15567027Расходующиеся частицы
Трубчатый ротаторSeouLin BioscienceSLRM-3Модификация аптамера и шариков

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
  2. Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770(2019).
  3. Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
  4. Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
  5. Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
  6. Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802(2018).
  7. Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
  8. Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
  9. Klussmann, S. The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , John Wiley & Sons. Hoboken, New Jersey. (2006).
  10. Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  11. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  12. Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326(2021).
  13. Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
  14. Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941(2019).
  15. Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  16. Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
  17. Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51(2016).
  18. Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14(1996).
  19. Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139(1991).
  20. Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
  21. Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
  22. Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
  23. Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  24. Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
  25. Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
  26. Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи