Оценка качества культур молочнокислых бактерий (LAB) была подтверждена как эффективный способ повышения жизнеспособности и функциональности штаммов LAB для процедур ферментации. Чтобы подкрепить это утверждение, мы разработали протокол, который разъясняет, как LAB-культуры активируются и культивируются для ферментации и биообработки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Культивирование, рост и жизнеспособность молочнокислых бактерий: перспектива контроля качества
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Молочнокислые бактерии (LAB) являются важными молочными заквасочными культурами, которые в значительной степени используются для производства ферментированных молочных продуктов, таких как йогурт и сыр. LAB преимущественно производят молочную кислоту в качестве основного конечного продукта ферментации, и они синтезируют важные метаболиты, которые придают органолептические характеристики ферментированных пищевых продуктов. LAB - это привередливые бактерии, которые процветают во многих средах, когда удовлетворяются адекватные потребности в питании. Спрос на превосходные молочные заквасочные культуры LAB для ферментации в пищевой и молочной промышленности привел к необходимости обеспечения жизнеспособных и активных культур для всех операций по биообработке. Таким образом, разработка стандартного протокола для обеспечения жизнеспособности и расширенной функциональности лабораторных культур в лабораторных условиях, а также в средах переработки молочных продуктов имеет очень важное значение. При решении проблем, связанных с реанимационными слабыми, напряженными и травмированными клетками культуры LAB, протокол, который ярко описывает основные шаги по восстановлению, усилению регенерации клеток и улучшению метаболической функциональности штаммов LAB, имеет первостепенное значение. Поддержание чистоты, функциональности и жизнеспособности культур для заквасок LAB также имеет решающее значение. Таким образом, соблюдение уникального руководства по протоколу приведет к повышению производительности ферментации для многих штаммов LAB, предназначенных для процессов ферментации и биотехнологии. В результате Лаборатория пищевой микробиологии и биотехнологии в Сельскохозяйственном и техническом государственном университете Северной Каролины разработала стандартный протокол для активации и контроля качества отдельных штаммов LAB, что привело к созданию высокофункциональных и жизнеспособных штаммов культуры LAB, используемых для исследований ферментации. Адаптация и рекомендация такого протокола для использования в молочной и пищевой промышленности поможет обеспечить жизнеспособность и функциональность LAB для многих применений.
Введение
Молочнокислые бактерии (LAB) представляют собой группу уникально разнообразных бактерий, обладающих промышленным потенциалом. Штаммы, принадлежащие Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus, в основном используются в качестве молочных заквасок для ферментированных молочных пищевых продуктов, таких как йогурт1. Выбранные штаммы LAB также классифицируются как пробиотики, поскольку они приносят пользу для здоровья людей при адекватном введении доз2. Молочнокислые бактерии также являются грамположительными, неспорообразующими, недыхающимися, но аэротолерантными микроорганизмами, которые обычно характеризуются производством молочной кислоты в качестве ключевого продукта ферментации. LAB также синтезирует эссенциальные метаболиты, например, органические кислоты, бактериоцины и другие антимикробные соединения3, которые могут ингибировать широкий спектр патогенов пищевого происхождения4. Молочная кислота, основной конечный продукт углеводного катаболизма и побочный продукт ферментации LAB, является органическим метаболитом, который обладает антимикробными свойствами и потенциально полезен для применения в биоконсервации пищевых продуктов 3,5,6. Кроме того, органические кислоты, производимые LAB, придают вкус, текстуру и аромат пищевых продуктов, тем самым усиливая их общие органолептические свойства 5,6. Различные потребности в питании LAB в сочетании с их вездесущей природой в конечном итоге позволяют бактериям легко процветать в различных средах, таких как молочные продукты, ферментированные продукты, овощи, а также в кишечнике человека7.
Существует растущий спрос на заквасочные культуры из LAB для производства йогурта и многих разнообразных молочных применений 8,9, поэтому следует придерживаться критического внимания и установленных научных методов при выращивании штаммов LAB, а также при активации как лиофилизированных, так и изолированных штаммов, поскольку эта активность жизненно важна для повышения производительности ферментации. Поэтому лаборатория пищевой микробиологии и биотехнологии активно участвует в разработке подходящей технологии, ориентированной на активацию, превосходный рост и ферментацию, характерные для штаммов LAB, выделенных из ферментированных молочных продуктов, а также из промышленных заквасок, используемых для производства йогурта. Кроме того, следует отметить, что промышленно произведенные штаммы культуры LAB подвергаются консервирующим действиям, таким как сублимационная сушка и замороженное хранение, вызывая клеточный стресс и травмы, в результате процесса холодного шока они подвергаются10. При ограничении проблем жизнеспособности и улучшении функциональности штаммов LAB, полученных либо из изолированных пищевых продуктов, либо из сублимированных продуктов, важно правильно активировать эти культуры в качестве формы контроля качества для улучшения их ферментативной характеристики8. В этом исследовании цель состояла в том, чтобы разработать собственный протокол контроля качества для активации и роста штаммов культуры L. delbrueckii subsp. bulgaricus, который в конечном итоге способствовал жизнеспособному росту LAB, а также улучшал эффективность ферментации и метаболическую функциональность штаммов LAB. Этот протокол в конечном итоге может быть адаптирован (с использованием оптимальных питательных сред и соответствующих условий культивирования) для выращивания других штаммов LAB для исследований ферментации, а также для промышленных целей или операций биообработки. Таким образом, этот протокол активации LAB и контроля качества обеспечит получение и потенциальное функционирование высококачественных молочных заквасочных культур для различных применений в мировой молочной и пищевой промышленности.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Общие материалы и методы
- Источник Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
- Получить штаммы L. bulgaricus из надежных источников.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании в исследовании контроля качества было использовано в общей сложности пять (5) штаммов L. bulgaricus (таблица 1). Два штамма сублимированного L. bulgaricus для промышленного производства кисломолочных продуктов были предоставлены доктором Альбертом Крастановым, кафедрой биотехнологии Университета пищевых технологий, Пловдив, Болгария. Два штамма, выделенные из коммерческих йогуртовых продуктов, доступных на рынке США, были получены из запаса -80 ° C лаборатории пищевой микробиологии и биотехнологии в Университете штата Северная Каролина A & T, а один лиофилизированный штамм был поставлен поставщиком C. Все штаммы LAB выдерживали при -80 °C до дальнейшего использования. Другой бактериальный штамм (Limosilactobacillus reuteri) был получен из запаса -80 ° C лаборатории пищевой микробиологии и биотехнологии в Государственном университете Северной Каролины A & T.
- Получить штаммы L. bulgaricus из надежных источников.
- Стандарт L. MRS среда ферментационного бульона
- Готовят среду deMan, Rogosa Sharpe (MRS), полностью растворив 55 г MRS и 0,5 г L-цистеина в 1 л деионизированной воды (DW).
- Дозировать 7 мл и 2 мл приготовленного раствора МРС в пробирки соответственно автоклав при 121 °С в течение 15 мин, а затем охладить при комнатной температуре (РТ).
- MRS агар средний
- Готовят МРС агаровую среду, полностью растворив 55 г МРС и 0,5 г L-цистеина в 1 л DW. Добавить порошок агара (15 г), стерилизовать агаровую среду при 121 °C в течение 15 мин, а затем охладить на водяной бане.
- Вылейте все свежеприготовленные среды в стерильные чашки Петри и храните их при 4 °C до дальнейшей необходимости.
- Модифицированный армированный клостридиальный средо-пируват (mRCM-PYR)
- Оптимизировать усиленную клостридиальную среду согласно Oyeniran et al.13 и Nwamaioha и Ibrahim18, для селективности и точного перечисления L. bulgaricus путем растворения 10 г пептона No3, 10 г экстракта говядины, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлорида натрия, 3 г ацетата натрия, 2 г двухосновного фосфата калия, 0,1 г урацила, 0,25 г хлорида кальция, 5 г декстрозы, 5 г фруктозы, 10 г мальтозы, 2 г пирувата натрия, 0,2% Tween 80 и 0,5 г L-цистеина в 1 л DW.
- Отрегулируйте конечный рН (6,0 ± 0,2) раствора, используя 6 N HCl перед добавлением 0,008% анилинового синего и 15 г агара. Автоклав среды при 121 °C в течение 15 мин, остудить на водяной бане и вылить в стерильные чашки Петри. Храните все свежеприготовленные среды в стерильных чашках Петри при температуре 4 °C до тех пор, пока это не понадобится.
- Глицериновый запас LAB культур
- Готовят глицериновые запасы (50% глицерина) путем разбавления 100% глицерина в том же объеме DW и стерилизуют при 100 °C в течение 30 мин с использованием сухого цикла стерилизации. Охладите запасы глицерина до RT и асептически храните их для дальнейшего использования.
- Используют бактериальный рост (единичную колонию L. bulgaricus , полученную с помощью разработанного протокола КК) из ночных культур.
- Пипетка 500 мкл ночных культур в 50% глицерин в 2 мл центрифужной трубки и осторожно смешивают их вместе. Заморозьте и храните глицериновый запас, содержащий культуры LAB, при сверхнизкой температуре -80 °C до тех пор, пока это не понадобится.
ПРИМЕЧАНИЕ: Графическая схема протокола контроля качества и активации LAB культур показана на рисунке 1.
| Нет | Код продукта | Образец | Источник | Бактериальная композиция с маркировкой1 |
| 1 | С9 | Чистый промышленный штамм | Болгария | Lb. bulgaricus |
| 2 | ЛБ6 | Чистый промышленный штамм | Болгария | Lb. bulgaricus, |
| 3 | АТХК 11842 | Чистый промышленный штамм | АТХК | Lb. bulgaricus |
| 4 | ГАЛКА | Йогурт | США | Lb. bulgaricus, другая живая культура |
| 5 | Е22 | Йогурт | США | Lb. bulgaricus, другая живая культура |
| 6 | Реутери | Йогурт | США | Limosilactobacillus reuteri |
| 1фунт = Лактобациллы | ||||
Таблица 1: Пробиотические штаммы. В таблице перечислены пробиотические штаммы, используемые в этом исследовании.
2. Протокол активации и контроля качества LAB культур
- Возьмите подготовленный глицериновый запас штаммов LAB (в 2 мл центрифужных пробирок) из морозильной камеры со сверхнизким содержанием -80 °C и не дайте им оттаять перед использованием.
- Очистите и продезинфицируйте отверстие трубок центрифуги 70% спиртом и осторожно вихрь перед использованием.
- Пипетка около 250 мкл (0,25 мл) запасной культуры LAB из центрифужных пробирок в свежие пробирки MRS объемом 2 мл.
- Осторожно вихрь, парафильмируют пробирки и анаэробно инкубируют их в течение ночи при 42 °C в течение 12-16 ч.
- Возьмите около 500 мкл (0,5 мл) из выращенных на ночь культур из пробирок 2 мл MRS в свежие пробирки 7 мл MRS, вихрь и анаэробно инкубируйте их в течение ночи при 42 °C в течение 12-16 ч.
- Оцените рост микробов путем измерения оптической плотности (OD) или роста культур при 610 нм с помощью УФ-видимого спектрофотометра и запишите приемлемые результаты между 0,7 и 0,9.
- Проведите ночные культуры из 7 мл пробирок MRS на агаровые пластины MRS и MRCM-PYR и инкубируйте их анаэробно в течение 72 ч при 42 °C.
- Соберите изолированные колонии из агаровых пластин, переложите их в свежие пробирки MRS объемом 7 мл, осторожно вихрь и анаэробно инкубируйте их в течение ночи при 42 °C в течение 12-16 ч.
- Храните агаровые пластины, содержащие изолированные штаммы при 4 °C, в холодильнике в течение недели.
- Измерьте и подтвердите OD (от 0,7 до 0,9) из 7 мл пробирок MRS культур LAB, выделенных из полосатых пластин при 610 нм, и используйте их в качестве рабочих культур для всех связанных экспериментов.
- Выполняют десятикратное разведение (последовательное разбавление) выращенных культур LAB из конечных 7 мл пробирок MRS с использованием 9 мл пептонной воды (физиологический буфер) для получения соотношения 1:10.
- Наконец, возьмите около 250 мкл (0,25 мл) из соответствующих последовательных разведений для всех экспериментов по ферментации.
- Активируют бульон, содержащий штаммы (250 мкл) со стадии 2.12 путем переноса их в свежий бульон МРС 7 мл и инкубации их анаэробно при 42 °С в течение 16 ч.
- Продолжайте повторять шаги 2.6-2.12, чтобы обеспечить жизнеспособный и превосходный рост клеток из культур LAB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все штаммы L. bulgaricus активировали в свежеприготовленном бульоне MRS и затем инкубировали анаэробно при 42 °C в течение 16 ч, чтобы достичь оптической плотности (OD610 нм) роста бактерий между 0,7 и 0,9. Рост бактерий измеряли с помощью УФ-видимого спектрофотометра при 610 нм. Значения рН ночных культур находились в диапазоне от 3,5 до 5,3 в результате производства молочной кислоты, органического конечного продукта ферментации LAB. Соблюдались и соблюдались процедуры безопасности, такие как правильная циркуляция воздушного потока в вытяжке биобезопасности и предотвращение ожогов во время использования горелки Бунзена.
Рисунок 1: Графическая схема протокола активации культур молочнокислых бактерий (LAB). Схема содержит подробную информацию и основные инструменты, необходимые для обработки и активации штаммов культуры LAB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рост клеток оцениваемых штаммов LAB, культивируемых с помощью протокола контроля качества, значительно отличался (P < 0,05), чем у штаммов, культивируемых без этого стандартного протокола. Протокол QC как для L. bulgaricus , так и для L. reuteri использовал многосубкультурный подход (субкультурирование три раза перед растяжкой на агаровых пластинах), тогда как процедура контроля имела субкультурную обработку, выполненную только один раз со всеми другими условиями, сохраненными постоянными. Рост колон...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Результаты всех штаммов, оцененных с помощью протокола контроля качества и без использования протокола, были одинаковыми, и поэтому были представлены результаты, связанные только с штаммами (S9 и LB6). Активированные штаммы LAB имели превосходный рост клеток, который характеризовался высокой интенсивностью клеточной биомассы, что вызывало мутное появление ферментативного бульона MRS в пробирке11. Наблюдаемый рост клеток после активации культуры был очевиден между 12 ч и 16 ч при анаэробной фермент...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта публикация стала возможной благодаря грантовому номеру NC. X-267-5-12-170-1 от Национального института продовольствия и сельского хозяйства (NIFA) и частично от NIZO Food Research BV, Нидерланды, Jarrow Formulas, США, а также Департамента семейных и потребительских наук и Сельскохозяйственной исследовательской станции в Сельскохозяйственном и техническом государственном университете Северной Каролины (Гринсборо, Северная Каролина, США 27411). Эта работа также была поддержана, в частности, грантом Программы по наращиванию потенциала 1890 года No (2020-38821-31113 /присоединение к проекту No 021765). Эта работа также была частично поддержана Министерством образования и науки Болгарии в рамках Национальной исследовательской программы «Здоровое питание для сильной биоэкономики и качества жизни», утвержденной DCM # 577 / 17.08.2018.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Анилиновый синий | Thermo Scientific | R21526 | 25 г |
| Экстракт говядины | Research Products International | 50-197-7509 | 500 г |
| Экстракт дрожжей | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 г |
| Дигидрат хлорида кальция | Fisher Scientific | C79-500 | 500 г |
| Декстроза безводная | Fisher Scientific | BP350500 | 500 г |
| D-фруктоза | ACROS Organics | AC161355000 | 500 г |
| порошок агара Difco | Difco | DF0812-07-1 | 2 кг |
| агара TPY | Difco | 211921 | 500 г |
| микроцентрифужная пробирка Eppendorf (микроцентрифуга Snap-Cap Safe-Lock) | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 мл |
| глицерина | Thermo Scientific | PI17904 | 500 мл |
| Инфракрасный CO2-инкубатор | Forma Scientific | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria S9 | ||
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Bulgaria | LB6 | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Лаборатория пищевой микробиологии и биотехнологии (NCATSU) | DAW | |
| Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus | Лаборатория пищевой микробиологии и биотехнологии (NCATSU) | E22 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Biogai, Raleigh / Лаборатория пищевой микробиологии и биотехнологии (NCATSU) | RD2 | |
| L-цистеина гидрохлорида моногидрат | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 г |
| Мальтозы моногидрат | Fisher Scientific | M75-100 | 100 г |
| MRS бульон | Неоген | 50-201-5691 | 5 кг |
| Пептон No 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 г |
| Двухосновной фосфат калия (K2HPO4) | Research Products International | 50-712-761 | 500 г |
| Тригидрат ацетата натрия тригидрат | Fisher Scientific | S220-1 | 1 кг |
| Хлорид натрия | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 кг |
| пирувата натрия | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 г |
| Пробирки с резиновой футеровкой | Винтовые крышки Fisher Scientific | FB70125150 | 25 x 150 мм |
| Подросток 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 мл |
| Ультранизкая морозильная камера | So-Low | ||
| Uracil | ACROS Organics | AC157301000 | 100 г |
| спектрофотометр в УФ-видимом диапазоне | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Экстракт | ||
| BP1422-500 | 500 г | ||
| этанола | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 л |
| соляной кислоты (6N (сертифицированная), Fisher Chemical) | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 мл |
Ссылки
- Karakas-Sen, A., Karakas, E. Isolation, identification and technological properties of lactic acid bacteria from raw cow milk. Bioscience Journal. 34 (2), 385-399 (2018).
- Martin, R., Langella, P. Emerging health concepts in the probiotics field: Streamlining the definitions. Frontiers in Microbiology. 10, 1047(2019).
- Sadishkumar, V., Jeevaratnam, K. In vitro probiotic evaluation of potential antioxidant lactic acid bacteria isolated from idli batter fermented with Piper betle leaves. International Journal of Food Science & Technology. 52 (2), 329-340 (2017).
- Ayivi, R. D., et al. Lactic acid bacteria: Food safety and human health applications. Dairy. 1 (3), 202-232 (2020).
- Quinto, E. J., et al. Probiotic lactic acid bacteria: A review. Food and Nutrition Sciences. 5 (18), 1765-1775 (2014).
- Hayek, S. A., Gyawali, R., Aljaloud, S. O., Krastanov, A., Ibrahim, S. A. Cultivation media for lactic acid bacteria used in dairy products. Journal of Dairy Research. 86 (4), 490-502 (2019).
- Bintsis, T. Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics. Aims Microbiology. 4, 665-684 (2018).
- Shao, Y., Gao, S., Guo, H., Zhang, H. Influence of culture conditions and preconditioning on survival of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ND02 during lyophilization. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1270-1280 (2014).
- Aryana, K. J., Olson, D. W. A 100-year review: Yogurt and other cultured dairy products. Journal of Dairy Science. 100 (12), 9987-10013 (2017).
- Kandil, S., El Soda, M. Influence of freezing and freeze-drying on intracellular enzymatic activity and autolytic properties of some lactic acid bacterial strains. Advances in Microbiology. 5 (6), 371-382 (2015).
- Malairuang, K., Krajang, M., Sukna, J., Rattanapradit, K., Chamsart, S. High cell density cultivation of Saccharomyces cerevisiae with intensive multiple sequential batches together with a novel technique of fed-batch at cell level (FBC). Processes. 8 (10), 1321(2020).
- Jeanson, S., Floury, J., Gagnaire, V., Lortal, S., Thierry, A. Bacterial colonies in solid media and foods: A review on their growth and interactions with the micro-environment. Frontiers in Microbiology. 6, 1284(2015).
- Oyeniran, A., et al. A modified reinforced clostridial medium for the isolation and enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in a mixed culture. Journal of Dairy Science. 103, 5030-5042 (2020).
- Iguchi, A., et al. Effects of repeated subculturing and prolonged storage at room temperature of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 on pulsed-field gel electrophoresis profiles. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 3079-3081 (2002).
- Hayek, S. A., Ibrahim, S. A. Current limitations and challenges with lactic acid bacteria: a review. Food and Nutrition Sciences. 4 (11), 73-87 (2013).
- Ahmed, S. A., Ibrahim, S. A., Kim, C., Shahbazi, A. Significance of bile salt tolerant Lactobacillus reuteri. Proceedings of the 2007 National Conference on Environmental Science and Technology. , Springr, NY. 17-23 (2009).
- Gyawali, R., et al. A comparative study of extraction techniques for maximum recovery of β-galactosidase from the yogurt bacterium Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Research. 87 (1), 123-126 (2020).
- Nwamaioha, N. O., Ibrahim, S. A. A selective medium for the enumeration and differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Science. 101 (6), 4953-4961 (2018).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
