Методическая статья

Количественная оценка распределения субклеточного гликогена в волокнах скелетных мышц с помощью просвечивающей электронной микроскопии

DOI:

10.3791/63347

⸱

7 февраля 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Research center for applied health science, University College South Denmark, 2Department of Sports Science and Clinical Biomechanics, University of Southern Denmark, 3Department of Biomedical Sciences, Core Facility for Integrated Microscopy, University of Copenhagen

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модифицированная процедура постфиксации увеличивает контраст частиц гликогена в ткани. В этой статье представлен пошаговый протокол, описывающий, как обращаться с тканью, проводить визуализацию и использовать стереологические методы для получения объективных и количественных данных о распределении субклеточного гликогена в скелетных мышцах.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью просвечивающей электронной микроскопии можно получить изображения с высоким разрешением неподвижных образцов, содержащих отдельные мышечные волокна. Это позволяет количественно оценивать ультраструктурные аспекты, такие как объемные фракции, отношение площади поверхности к объему, морфометрия и физические контакты различных субклеточных структур. В 1970-х годах был разработан протокол усиленного окрашивания гликогена в клетках, который проложил путь для серии исследований субклеточной локализации гликогена и размера частиц гликогена с использованием просвечивающей электронной микроскопии. В то время как большинство анализов интерпретируют гликоген так, как если бы он равномерно распределялся внутри мышечных волокон, обеспечивая только одно значение (например, среднюю концентрацию), просвечивающая электронная микроскопия показала, что гликоген хранится в виде дискретных частиц гликогена, расположенных в отдельных субклеточных компартментах. Здесь описан пошаговый протокол от сбора тканей до количественного определения объемной фракции и диаметра частиц гликогена в отдельных субклеточных компартментах отдельных волокон скелетных мышц. Включены соображения о том, как 1) собирать и окрашивать образцы тканей, 2) выполнять анализ изображений и обработку данных, 3) оценивать точность оценок, 4) различать типы мышечных волокон и 5) методологические подводные камни и ограничения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Частицы гликогена состоят из разветвленных полимеров глюкозы и различных связанных с ней белков1 и являются важным топливом во время высоких метаболических потребностей2. Хотя частицы гликогена не получили широкого признания, они также представляют собой местное топливо, где некоторые субклеточные процессы преимущественно используют гликоген, несмотря на наличие других и более долговечных видов топлива, таких как глюкоза плазмы и жирные кислоты3,4.

Важность хранения гликогена в качестве субклеточного специфического локализованного топл....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол с использованием образцов скелетных мышц человека с биопсией был одобрен Региональными комитетами по этике исследований в области здравоохранения для Южной Дании (S-20170198). Биопсию мышц получали через разрез в коже из мышцы vastus lateralis с использованием иглы Bergström с отсасыванием после подкожного введения местной анестезии (1-3 мл лидокаина 2% на разрез). Если использовались изолированные целые мышцы крысы, животных приносили в жертву при вывихе шейки матки до получения биопсии мышц в соответствии с руководящими принципами комитета по этике животных в университетской больнице Оденсе, Дания.

1. Пер....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя этот протокол, частицы гликогена выглядят черными и отчетливыми (рисунки 1 и 2). Нормальные значения гликогена изображены на рисунке 3. Эти данные основаны в общей сложности на 362 волокнах от 41 здорового молодого человека, собранных в различных предыдущих исследованиях19,24,29,30,31........

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критическим этапом метода является использование восстановленного осмия ферроцианидом калия во время постфиксации. Селективность этого модифицированного фиксатора для обнаружения гликогена не может быть полностью объяснена химией, но также включает экспериментальные результаты, демонстрирующие отсутствие обнаружения таких частиц в тканях, которые, как известно, свободны от гликогена, или во внеклеточном пространстве11.

Критическими параметрами являются точность оценок и.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Шведским олимпийским комитетом.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,2-Оксид пропиленаMerck75-56-9
Встраивание 812 смола средний наборTaabT031
Раствор глутаральдегида 25%Merck1.04239.0250
ITEMOlympusПрограммное обеспечение для визуализации
Leica EM AC20LeicaАвтоматическая контрастная система
OSIS Veleta цифровая камераOlympus
Тетраоксид осмия 4% растворPolysciences0972A
Philips CM 100 Transmission EMPhilips
Гексацианоферрат калия (II) тригидратSigma-Aldrich455989-245G
Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7,4Ampliqon.comAMPQ40989.0500
Ultra-microtome Leica UC7Leica
Ultrostain цитрат свинца 3%, стабилизированный растворLeica16707235
дигидрат уранилацетатаPolysciences6159-44-0

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
  2. Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in hum....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи