Измерение потребления кислорода в острых полосатостных срезах взрослых мышей

Митохондриальная дисфункция была вовлечена в несколько неврологических заболеваний, включая болезнь Паркинсона (БП), болезнь Хантингтона и болезнь Альцгеймера ^1,2,3. Модели PD, такие как нокаутные мыши PINK1 (KO) и крысы, демонстрируют нарушение митохондриальной функции 4,5,6,7,8,9,10,11. Митохондрии, выделенные из полосатого тела (STR) или всего мозга стареющей мыши PINK1 KO, демонстрируют дефекты в комплексе I 7,10,12,13. Непосредственное измерение скорости потребления кислорода (OCR) является одним из наиболее распространенных методов оценки митохондриальной функции, поскольку OCR связан с продукцией АТФ, основной функцией митохондрий¹⁴. Таким образом, измерение OCR в моделях заболеваний или образцах / тканях, полученных от пациента, может помочь исследовать, как митохондриальная дисфункция приводит к заболеванию.

В настоящее время существует несколько способов измерения митохондриального OCR, включая электрод Кларка и другие электроды O₂, флуоресцентный краситель O₂ и внеклеточный анализатор потока 15,16,17,18,19. В качестве преимущества методы на основе электродов O₂ позволяют легко добавлять различные подложки. Однако их недостаточно для одновременного измерения нескольких образцов. По сравнению с традиционными методами на основе электродов_O2, внеклеточный анализатор потока, широко используемый инструмент для OCR в клеточных культурах или очищенных митохондриях, предлагает улучшенную пропускную способность 15,18,20. Тем не менее, все эти методы обычно применяются для измерения OCR в изолированных митохондриях или клеточных культурах 6,16,17,19,20,21. Выделение митохондрий вызывает непреднамеренное повреждение, а извлеченные митохондрии или клеточные культуры менее физиологически значимы, чем интактные срезы мозга²². Даже когда микроэлектроды используются в срезах, они менее чувствительны и более сложны в эксплуатации, чем в культивируемых клетках²³.

Для решения этих задач мы разработали метод с использованием анализатора внеклеточного потока XF24, который позволяет анализировать множественные метаболические параметры острых полосатых срезов мозга мышей²⁴. Этот метод обеспечивает непрерывную прямую количественную оценку митохондриального дыхания через OCR. Короче говоря, небольшие участки стриатальных срезов мозга помещаются в лунки островковой пластинки, а анализатор использует биосенсоры на основе кислорода и протонов на основе флуоресценций для измерения скорости OCR и внеклеточного подкисления соответственно 17,21,25.

Одной из уникальных особенностей анализатора являются четыре нагнетательные скважины, которые позволяют непрерывно измерять OCR при последовательной закачке до четырех соединений или реагентов; это позволяет измерять несколько параметров клеточного дыхания, таких как базальный митохондриальный OCR, ATP-связанный OCR и максимальный митохондриальный OCR. Соединения, введенные в ходе измерений по протоколу, показанному здесь, представляли собой рабочие концентрации пирувата 10 мМ в первой скважине раствора (порт А), 20 мкМ олигомицина во второй скважине раствора (порт В), 10 мкМ карбонилцианида 4-(трифторметокси) фенилгидразона (FCCP) в третьей скважине (порт С) и 20 мкМ антимицина А в четвертой скважине (порт D), на основе Фрида и ^др.25. Следует отметить, что эти концентрации были рабочими концентрациями, и исходные растворы 10x, 11x, 12x и 13x вводились в порты раствора A-D соответственно. Цель использования каждого решения заключалась в следующем: 1) Пируват был необходим, поскольку без него добавление FCCP имело бы сниженную реакцию OCR, вызванную ограничением доступных субстратов; 2) Олигомицин ингибирует АТФ-синтазу и позволяет измерять АТФ-связанное дыхание; 3) FCCP отделяет окисление от фосфорилирования и позволяет измерять максимальную митохондриальную емкость; 4) Антимицин А ингибирует комплекс III в цепи переноса электронов и, следовательно, позволяет измерять OCR, не связанный с митохондриями.

Концентрацию используемого олигомицина определяли исходя из следующих причин: 1) Рекомендуемая доза олигомицина для большинства типов клеток (изолированных митохондрий или клеточных культур) составляет 1,5 мкМ. По опыту, обычно для экспериментов с срезом используется доза диссоциированных клеток 3х-10х, так как может быть градиент, а проникновение раствора в срезы требует времени. Поэтому концентрация должна быть в диапазоне от 5 мкМ до 25 мкМ. 2) Концентрация 20 мкМ была выбрана на основе Fried et ^al.25. Более высокие концентрации не были опробованы из-за неспецифической токсичности олигомицина. 3) В отчете Underwood et ^al.26 авторы провели эксперимент по титрованию олигомицина и обнаружили, что дозы в 6,25, 12,5, 25 и 50 мкг / мл приводили к аналогичному ингибированию. Более высокая концентрация олигомицина (50 мкг/мл) не ингибировала больше, но имела большую дисперсию. 4) По нашим наблюдениям, определяющим фактором, по-видимому, является проникающая способность олигомицина. Олигомицину трудно проникнуть в ткани, и именно поэтому требуется не менее 7 - 8 циклов, чтобы достичь плато, максимального ответа. До тех пор, пока он достигает плато, торможение считается максимальным.

Ключевой технической проблемой адаптации внеклеточного анализатора флюса для измерения OCR в стриатальных срезах является предотвращение гипоксии тканей. Поскольку буфер не насыщался кислородом в течение всей продолжительности измерений (около 4 ч), гипоксия была центральной проблемой. Это особенно верно для более толстых образцов тканей, где кислород не может диффундировать по всем образцам. Чтобы преодолеть эту проблему, срезы были разделены на толщину 150 мкм, чтобы окружающий кислород мог проникать в середину срезов мозга. Кроме того, 4 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) добавляли в буфер предварительно оксигенированной искусственной спинномозговой жидкости (ACSF), что облегчало определение максимального OCR, как предлагалось ранее²³. Мы исследовали, живы ли клетки. Во-первых, Hoechst 33258 (10 мкМ) и йодид пропидия (10 мкМ) были использованы для изучения того, являются ли клетки здоровыми в этих условиях. Затем мы изучили, являются ли средние колючие нейроны функционально здоровыми, используя запись зажимов. Мы также оценили, были ли терминалы дофамина (DA) в стриатальных срезах функционально здоровыми, измеряя высвобождение DA с помощью вольтамметрии быстрого сканирования. Результаты показали, что стриатальные срезы, которые не были насыщены кислородом (группа ACSF / BSA), были такими же здоровыми, как и контрольная группа²⁴ с кислородом.

Затем мы протестировали различные комбинации толщины среза и размера перфоратора, чтобы определить оптимальные условия стриатального среза для анализа дыхания флюсом. Для анализа OCR с использованием анализатора использовались дорсальные стриатальные срезы различной толщины (150 мкм и 200 мкм) и размеров перфоратора (1,0 мм, 1,5 мм и 2,0 мм в диаметре). Стриатальные срезы толщиной 150 мкм с диаметром перфоратора 1,5 мм имели наивысшую эффективность соединения и OCR в оптимальном для анализатора²⁴ диапазоне.

Все процедуры, включая работу с животными, проводились в соответствии с национальными и международными руководящими принципами и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Томаса Джефферсона. Использовались самцы мышей FVB/NTac в возрасте от 3 до 14 месяцев. Следующие шаги были выполнены в нестерильных условиях, но следует соблюдать осторожность, чтобы все было как можно более чистым.

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод, представленный здесь, был установлен и использован в исследовании, о котором сообщили Zhi et ^al.24. В экспериментах, описанных здесь, использовался внеклеточный анализатор потока Seahorse XF24 (см. Таблицу материалов). Эти методы могут быть адаптированы для анализатора XFe24, и некоторые результаты были подтверждены с помощью этого анализатора.

1. Датчики гидрата картриджа (за 1 день до анализа)

1. Откройте комплект для анализа внеклеточного флюса (см. Таблицу материалов) и извлеките картридж датчика (зеленый) и полезную пластину (очистить; Рисунок 1А). Отложите картридж датчика в сторону (датчики вверх) и не прикасайтесь к датчикам.
2. Добавьте 600 мкл калибрантного раствора (рН 7,4) в каждую лунку полезной пластины. Поместите картридж датчика поверх вспомогательной пластины и погрузите датчики в калибрирующий раствор. Убедитесь, что треугольная выемка картриджной пластины утилиты и датчика правильно выровнена (рисунок 1B).
3. Запечатайте набор для анализа внеклеточного флюса герметизирующей пленкой, чтобы предотвратить испарение раствора калибранта, а затем поместите его в инкубатор при температуре 37 °C, не дополненный CO₂ или кислородом на ночь.

2. Подготовьте тканевую пластинку (в день анализа)

1. Откройте микропластину захвата островка и выньте островковую пластинку для сидения тканей.
2. Нагреть соответствующий объем (625 мкл на скважину) предварительно насыщенной кислородом модифицированной искусственной спинномозговой жидкости (ACSF, состав 140 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 2,4 мМ CaCl₂, 1,3 мМ MgSO₄, 0,3 мМ KH₂PO₄, 25 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, рН 7,2) буфера до 37 °C в трубке 50 мл. Затем добавляют BSA к конечной концентрации 4 мг/мл для подготовки буфера дыхания. В целом на одну пластину достаточно 50 мл.
3. Добавьте 625 мкл буфера дыхания (предварительно оксигенированный буфер ACSF с 25 мМ глюкозы и 4 мг / мл BSA) в каждую лунку островковой пластинки осторожно и избегайте встряхивания пластины. Убедитесь, что на верхней части картриджа датчика нет остаточных капель и в буфере каждой скважины нет пузырьков воздуха.

3. Приготовление острых стриатальных ломтиков и размещение иссеченных ломтиков

1. Обезглавить мышь после вывиха шейки матки и немедленно рассечь мозг в 10 мл ледяного предварительно насыщенного кислородом режущего раствора (125 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 26 мМ NaHCO₃, 3,7 мМ MgSO₄, 0,3 мМ KH₂PO₄, 10 мМ глюкозы, рН 7,4).
2. Сечение корональных стриатальных срезов с вибратомом в соответствии с инструкцией производителя (см. Таблицу материалов) толщиной 150 мкм в ледяном, предварительно насыщенном кислородом режущем растворе.
3. Восстановить ломтики в 50 мл насыщенного кислородом ACSF (125 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 26 мМ NaHCO₃, 2,4 мМ CaCl₂, 1,3 мМ MgSO₄, 0,3 мМ KH₂PO₄, 10 мМ глюкозы, 2 мМ HEPES, рН 7,4) и хранить в растворе до 30 мин при комнатной температуре (RT).
4. После восстановления переложите ломтики на чашку Петри размером 35 мм х 10 мм с буфером дыхания объемом 5 мл.
5. Используйте биопсийный перфоратор из нержавеющей стали (например, диаметром 1,5 мм) для создания круглого куска ткани в желаемой области разрезанного мозга. Держите срез в буфере, осторожно нажимая пуансоном. Убедитесь, что перфоратор нажат достаточно сильно, чтобы разрезать ткань. Удалите остальную часть ткани, поднимите перфоратор и удалите круглый кусок ткани в буфер.
6. Вырежьте самый конец наконечника пипетки объемом 1 мл, чтобы сделать отверстие диаметром 1,5-2,0 мм, и используйте его для удержания и переноса перфорированного среза в верхнюю часть экрана захвата. Отсосите один кусок перфорированной мозговой ткани и аккуратно поместите ткань на сетчатую сторону экрана захвата (рисунок 2А). Экран захвата будет представлять собой круглый кусок пластика с сеткой, прикрепленной к одной стороне.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экраны захвата включены в пакет микропластин (см. Таблицу материалов) и аналогичны тем, которые используются в Schuh et ^al.23.
7. Осторожно используйте бумажную салфетку, чтобы ненадолго высушить экран захвата. При удалении влаги ткань становится липкой, что позволяет срезу прикрепляться к центру сетки. Не сушите ломтик слишком сильно, так как, в противном случае, он будет поврежден.
8. Удерживайте пинцетом срез экрана захвата стороной вниз и поместите его в один из колодцев инкубационной островковой пластины (рисунок 2B). Будьте осторожны, чтобы не уронить кусочек; если это так, выньте экран и поместите на него новый фрагмент.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не помещайте срезы мозга в два фоновых коррекционных колодца (A1 и D6) в островковой пластинке.
9. Инкубируйте островковую пластинку при 37 °C в инкубаторе в течение не менее 30 минут, чтобы обеспечить выравнивание температуры и рН перед запуском анализа.

4. Загрузка патронов нужными составами

1. Разбавляют желаемые соединения в модифицированных ACSF (37°C) до конечной концентрации запаса 10x, 11x, 12x и 13x рабочей концентрации для портов A-D, соответственно, и доводят до pH 7,4. Тест будет вводить соединения в порядке от порта A до D. Для этого эксперимента использовались следующие растворы с их соответствующей рабочей концентрацией, упомянутой до них: пируват 10 мМ (порт А), 20 мкМ олигомицина (порт B), 10 мкМ или других концентраций FCCP (порт C) и 20 мкМ антимицина A (порт D).
2. Осторожно предварительно загрузите 75 мкл разбавленных соединений в соответствующие отверстия для впрыска картриджа датчика. Поместите наконечники наполовину в инжекционные отверстия под углом 45°, прижав наконечник к стенке инжекционного отверстия. Наконечники не должны быть вставлены полностью в нижнюю часть инжекционных отверстий, так как это может привести к утечке соединения через порт.
3. Осторожно извлеките наконечники из портов, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Не прикасайтесь к какой-либо части картриджа, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
4. Визуально осмотрите порты впрыска на предмет равномерной загрузки. Убедитесь, что вся жидкость находится в порту и на верхней части картриджа нет остаточных капель.
5. Поместите картридж датчика на пластину полезности и поместите его в инкубатор (без CO₂) на 30 минут, чтобы он снова нагрелся до 37 °C. Обращайтесь осторожно, держась только за опорную пластину. Двигайтесь как можно меньше.

5. Калибровка и выполнение анализа

1. Загрузите шаблон анализа в программное обеспечение. Нажмите зеленую кнопку START .
2. Убедитесь, что загружен правильный протокол. Протокол содержит комбинацию последовательностей измерения 3 минут, 3 минут ожидания и 2 минут (эти три шага образуют одно измерение). Изменяйте расстояние между головками зонда с 26 600 до 27 800 в аппаратных настройках под настройками прибора²⁵. Нет необходимости менять головку зонда для анализатора XFe24. Нажмите кнопку СТАРТ.
3. Загрузите картридж датчика на вспомогательной пластине в лоток для приборов. Выемка уходит в передний, левый угол. Убедитесь, что пластина сидит правильно и плоская. Загрузите заполненный лекарственным средством картридж датчика в анализатор для калибровки.
4. Следуйте инструкциям на экране, чтобы откалибровать и уравновесить датчики. Это займет около 30 минут.
5. После завершения этапа калибровки извлеките калибровочную пластину и замените ее островковой пластиной (содержащей срезы сетки и ткани).
6. Измерьте потребление кислорода в каждой лунке пластины, используя протоколы анализа. Протокол содержит комбинацию 3-минутной смеси, 3-минутной последовательности измерения и 2-минутной последовательности измерения (эти три шага образуют одно измерение), после чего вычисляется OCR.
7. Для всего эксперимента включите 4-кратные измерения OCR для создания базовой линии, за которыми следует инъекция порта A (пируват) с 4-кратными измерениями, затем инъекция порта B (олигомицин) с 8-кратными измерениями, затем инъекция порта C (FCCP) с 5-кратными измерениями и, наконец, инъекция порта D (антимицин A) с 6-кратными измерениями.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это количество измерений после каждой инъекции соединения определяется в зависимости от того, когда измерение достигает плато.
8. Анализ данных измерений OCR и данных об эффективности связи.

Первым шагом этого исследования была оптимизация толщины среза и размера перфоратора, используемого для вырезания участка полосатого тела из среза (рисунок 3A). Срез толщиной 150 мкм и размером перфоратора 1,5 мм давал наилучшие результаты, определяемые эффективностью соединения (рисунок 3B-C). Как показано на рисунке 3B, OCR относительно стабилен в течение 5 ч при снижении менее 10%. Кроме того, использовались функциональные измерения, а также запись корковых нейронов и средних колючих нейронов в полосатом теле и измерение высвобождения DA с быстрым сканированием циклической вольтамметрии (FSCV), чтобы продемонстрировать, что нейроны и терминали были полностью функциональны в этом препарате, как показано в Zhi et al.24. В комплекте с этим мы затем протестировали различные концентрации FCCP, чтобы обнаружить, какой из них даст лучший ответ; 10 мкМ FCCP дали наилучшее считывание (рисунок 3D1,D2), определяемое запасной дыхательной способностью:

Запасная дыхательная способность = максимальное дыхание - базальное дыхание

Эти условия среза использовались для измерения различий в OCR полосатых срезов у мышей PINK1 KO и однопометников дикого типа (WT). Для результатов мышей PINK1 KO и WT использовали 3-4 мыши и использовали 4-6 реплик на мышь и усредняли для получения одной точки данных. Поскольку PINK1 является ключевым регулятором митохондриальной функции, ожидалось, что митохондриальная дисфункция будет обнаружена у мышей KO, измеренная снижением митохондриальной OCR. Действительно, возрастное снижение OCR было очевидно у мышей KO по сравнению с их контрольной группой WT (рисунок 4A, D). Базальный OCR был аналогичен как в группах KO, так и WT для молодых мышей (3-4 месяца); однако базальный OCR снизился у мышей KO в старой группе (10-14 месяцев; Рисунок 4B,E). Эффективность соединения, определяемая следующим образом,

Эффективность соединения = [скорость производства АТФ] / [базальная частота дыхания] × 100

однако уменьшился у мышей KO как для молодой, так и для старой групп (рисунок 4C,F). Эти данные демонстрируют, что участки стриатальной ткани у мышей PINK1 KO имели митохондриальную дисфункцию. Эта дисфункция у мышей KO также началась с раннего возраста, о чем свидетельствует снижение эффективности связи, хотя базальный OCR был снижен только в старой группе. Это возрастное снижение, вероятно, было результатом накопления митохондриальных дефектов, вызванных нокаутом PINK1.

Рисунок 1: Изображения, показывающие внеклеточный анализатор потока гидратных картриджных датчиков и пластины. (A) Картридж датчика, расположенный поверх калибровочной пластины (вспомогательной пластины). (B) Вид сбоку на пластину утилиты и пластину картриджа датчика. Треугольная выемка картриджной пластины утилиты и датчика должна быть правильно выровнена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Прикрепление и размещение перфорированного среза. (A) Перфорированный срез прикрепляется к сетчатой вставке экрана захвата, а затем (B) помещается в один из колодцев инкубационной островковой пластины осторожно, чтобы срез не отсоединялся и не двигался во время измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Оптимальное состояние стриатального среза для анализа флюсового дыхания. (A) Диаграмма размеров тканевого перфоратора (1,0 мм, 1,5 мм и 2,0 мм в диаметре) для полосатого тела (STR) с красными кругами, представляющими области, которые были получены для анализа. (В1) O2 Нормы расхода (OCR) для различных толщин и размеров перфораторов срезов в контрольной группе показали стабильное базальное дыхание в течение всего измерения (4 ч), а OCR был пропорционален объему среза. OCR измеряли в срезах толщиной 150 мкм и 200 мкм, пробитых перфорацией 1,0 мм, 1,5 мм и 2,0 мм. Используемые комбинации упоминаются в легендах как толщина * размер перфоратора (например, 150 мкм * 1 мм). (В2) Усредненные OCR, измеренные в срезах толщиной 150 мкм, пробитых перфорацией 1,5 мм; n = 7. (С1) Репрезентативные ответы OCR срезов различной толщины и диаметра с пируватом 10 мМ (P), 20 мкМ олигомицина (O), 10 мкМ FCCP (F) и 20 мкМ антимицина A (A), вводимого последовательно. Стрелки указывают временную точку инъекции этих соединений. (С2) Эффективность митохондриальной связи сравнивалась между различными группами. Срезы размером 150 мкм* 1,5 мм имели высокую эффективность соединения, но наименьшую дисперсию; n = 4. (Д1) Был проведен эксперимент по титрованию для FCCP, и 10 мкМ FCCP дали наибольшую резервную мощность; n = 4 для каждой группы. (Д2) Эксперименты по титрованию для FCCP проводились с помощью анализатора, и 10 мкМ FCCP давали наибольшую резервную мощность; n = 4 для каждой группы. Значения, приведенные на рисунках, являются средними ± стандартной погрешности среднего значения (SEM). Этот рисунок был изменен по сравнению с Zhi et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Срезы PINK1 KO из старой группы, показывающие значительно более низкий OCR. OCR острых срезов STR (150 мкм * 1,5 мм) у мышей в молодой (A, B и C) и старой группах (D, E и F), подвергшихся последовательному добавлению респираторных модуляторов (показано с помощью стрелок). OCR молодой группы существенно не отличался между различными генотипами (B), в то время как эффективность связи (определяемая как процентное значение с использованием формулы, упомянутой выше%) была снижена в срезах PINK1 KO (C). В старой группе PINK1 KOslices показали значительное снижение уровня базального дыхания (E) и эффективности связи (F). Следующий раствор, пируват 10 мМ (P), 20 мкМ олигомицина (O), 10 мкМ FCCP (F) и 20 мкМ антимицина A (A), вводили последовательно. n = 4 для каждого генотипа и возраста. Значения, приведенные на рисунках, являются средними ± SEM. Разница считалась существенной, когда p < 0,05 (*). Эта цифра была изменена с Zhi et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторам нечего раскрывать.