Методическая статья

Надежный метод крупномасштабного производства сфероидов для скрининга и анализа с высоким содержанием

DOI:

10.3791/63436

⸱

28 декабря 2021 г.

 ,  , 
1Cell Screening Laboratory, UCD School of Biology and Environmental Science, University College Dublin

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол детализирует метод производства трех различных типов сфероидов таким образом, чтобы сделать их пригодными для крупномасштабного скрининга и анализа с высоким содержанием. Кроме того, представлены примеры, показывающие, как их можно анализировать на сфероидном и индивидуальном клеточном уровнях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Скрининг с высоким содержанием (HCS) и анализ высокого содержания (HCA) - это технологии, которые предоставляют исследователям возможность извлекать крупномасштабные количественные фенотипические измерения из клеток. Этот подход оказался мощным для углубления нашего понимания широкого спектра как фундаментальных, так и прикладных событий в клеточной биологии. На сегодняшний день большинство приложений для этой технологии полагаются на использование клеток, выращенных в монослоях, хотя все чаще осознается, что такие модели не повторяют многие взаимодействия и процессы, которые происходят в тканях. Таким образом, произошло появление в разработке и использовании 3-мерных (3D) клеточных сборок, таких как сфероиды и органоиды. Хотя эти 3D-модели особенно эффективны в контексте биологии рака и исследований доставки лекарств, их производство и анализ воспроизводимым способом, подходящим для HCS и HCA, представляют собой ряд проблем. Протокол, подробно описанный здесь, описывает метод генерации многоклеточных сфероидов опухоли (MCTS) и демонстрирует, что он может быть применен к трем различным клеточным линиям способом, совместимым с HCS и HCA. Метод облегчает добычу нескольких сотен сфероидов на скважину, обеспечивая конкретное преимущество в том, что при использовании в режиме скрининга данные могут быть получены из нескольких сотен структур на скважину, все обработаны одинаковым образом. Также приведены примеры, в которых подробно описывается, как обрабатывать сфероиды для флуоресцентной визуализации с высоким разрешением и как HCA может извлекать количественные признаки как на уровне сфероида, так и из отдельных клеток внутри каждого сфероида. Этот протокол может быть легко применен для ответа на широкий круг важных вопросов в клеточной биологии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционно клеточные анализы проводились в монослоях, растущих на твердой подложке, которую фактически можно рассматривать как двумерную (2D) среду. Тем не менее, все чаще признается, что 2D-модели клеточных культур не имеют физиологической значимости в некоторых контекстах и не могут воспроизвести многие сложные взаимодействия, которые происходят между клетками1. Трехмерные (3D) методы культивирования клеток быстро становятся популярными среди исследователей, а 3D-модели клеток показывают высокий потенциал для лучшего подражания физиологическим условиям, с которыми сталкиваются клетки в тканевой среде2. Существует несколько различных типов 3D-клеточных сборок, которые были использованы, но двумя наиболее распространенными типами являются сфероиды и органоиды. Сфероиды могут быть выращены из множества различных клеточных линий, и они могут принимать различные формы и размеры в зависимости от используемого типа клеток и их метода сборки3. Кроме того, сфероиды также могут называться многоклеточными сфероидами опухолей (MCTS), когда они выращиваются из линий раковых клеток, и эти модели нашли особое применение для доклинической доставки лекарств in vitro и исследований токсичности4,5. Органоиды, с другой стороны, стремятся лучше имитировать ткани и органы в нашем теле и могут принимать более сложные морфологические структуры. Производство органоидов включает в себя использование взрослых стволовых клеток или плюрипотентных стволовых клеток, которые могут быть перепрограммированы в соответствующие клетки, чтобы напоминать ткань или орган, представляющий интерес. Они в основном используются для исследования развития органов и моделирования заболеваний и взаимодействий хозяина и патогена6.

Существует ряд различных методов, используемых для создания 3D-сборок ячеек. Методы на основе каркаса обеспечивают субстрат или опору, к которой клетки могут либо прикрепляться, либо расти внутри. Эти леса могут иметь различные формы и могут быть изготовлены из множества различных материалов. Наиболее распространенными являются компоненты внеклеточного матрикса (ECM) и гидрогели, и они предназначены для того, чтобы напоминать естественную внеклеточную среду клеток и тем самым облегчать физиологические взаимодействия4,7. Материал фундамента ECM был извлечен из опухоли саркомы мыши Engelbreth-Holm-Swarm и, как было показано, содержит богатую смесь компонентов ECM, включая ламинин, коллаген IV типа и перлекан8. Однако, несмотря на его выгодный состав, есть две основные проблемы с его использованием, а именно его изменчивость от партии к партии и то, что он имеет два различных агрегатных состояния ниже и выше 10 ° C8,9. Напротив, гидрогели имеют преимущество в том, что они гибкие по отношению к их компонентам и жесткости, и они могут быть настроены в соответствии с конкретной желаемой сборкой 3D-ячеек7,10. Методы на основе каркаса необходимы для роста органоидов, но также широко используются для сфероидов. Методы без каркаса, которые работают, предотвращая прикрепление клеток к поверхности, на которой они растут, обычно совместимы только со сфероидной сборкой. Примеры включают пластины со сверхнизким прикреплением (ULA) с плоским дном или U-образным дном, которые позволяют агрегировать ячейки в сфероиды, или использование непрерывного перемешивания ячеек в колбах спиннера/вращения10.

Использование 3D клеточных сборок для изучения широкого спектра биологических событий стремительно набирает популярность; однако важно, чтобы метод, выбранный для их культуры, был подходящим и совместимым с планами их последующего анализа. Например, использование пластин ULA генерирует сфероиды высокой консистенции; однако этот метод ограничен добычей одного сфероида на скважину, тем самым ограничивая пропускную способность. Особое внимание необходимо учитывать при планировании флуоресцентной визуализации 3D-структуры. Подложка или пластина, на которой выращивается сборка, должна быть оптически совместимой, и необходимо соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму последствия рассеяния света, вызванного любыми каркасами, которые могли быть использованы11. Эта конкретная проблема становится все более острой по мере увеличения числовой диафрагмы объективов микроскопа.

Возможно, одной из основных причин выбора работы с 3D-моделью клеток является извлечение объемных данных визуализации не только обо всей сборке, но и об отдельных клетках в ней. Модели MCTS, в частности, начинают оказываться очень мощными для углубления нашего понимания того, как терапевтические средства передаются извне в центральные клетки (как это необходимо в опухоли)12, и поэтому получение знаний от отдельных клеток в разных слоях имеет важное значение. Технология визуализации, которая извлекает количественную информацию из отдельных клеток, называется анализом высокого содержания (HCA) и является мощным подходом в контексте скрининга13. На сегодняшний день HCA почти исключительно применяется к однослойным культурам, но растет понимание того, что этот подход может быть применен к 3D-культурам, позволяющим изучать широкий спектр клеточных функций и процессов14. Это будет иметь явное преимущество в том, что большое количество 3D-сборок может быть проанализировано, потенциально предоставляя данные на уровне ячеек из каждой структуры. Однако необходимо преодолеть проблемы, связанные с визуализацией потенциально толстых клеточных сборок, а также больших наборов данных.

В данной статье представлен надежный каркасный метод крупномасштабной добычи MCTS в формате 96 скважин. Метод облегчает производство нескольких сотен 3D-клеточных сборок в каждой скважине. Примеры показаны для трех различных типов клеток, представляющих солидные опухолевые модели печени, легких и толстой кишки. Сфероиды, которые образуются, могут быть различных размеров, и поэтому HCA используется для выбора структур определенного размера и / или морфологии. Эта особенность обеспечивает дополнительное преимущество, что любые наблюдаемые фенотипы могут быть сопоставлены между сфероидами разных размеров, но все они обрабатываются одинаково в одной и той же колодце. Этот подход совместим с визуализацией с высоким разрешением, что важно, обеспечивая количественные данные как на клеточном, так и на субклеточном уровне из одних и тех же клеточных сборок. Этот метод производства сфероидов имеет дополнительное преимущество перед методами, которые генерируют один сфероид на скважину, что большое количество сфероидов, полученных в каждой скважине, потенциально обеспечивает достаточную биомассу для других последующих анализов, таких как транскриптом и протеомное профилирование.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Клеточная культура

  1. Подготовка носителей
    1. Подготовьте конкретную среду клеточной культуры в зависимости от типа клеточной линии. Убедитесь, что все среды для поддержания клеток содержат 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разные клеточные линии используют разные носители. Клетки рака толстой кишки HT-29 (ATCC HTB-38) выращиваются в McCoys 5A + 10% FBS. Клетки гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 (ATCC HB-8065) выращиваются в минимально необходимой среде + 1% L-глутамина + 10% FBS. Клетки бронхоальвеолярной карциномы H358 (ATCC CRL-5807) выращивают в среде RPMI 1640 + 1% L-глутамина + 10% FBS. Все среды, содержащие L-глютамин и FBS, называются полными средами. При окрашивании клеток для роста в виде сфероидов требуется фенольная среда без красного цвета с 10% FBS, чтобы избежать окрашивания материала фундамента ECM, что, в свою очередь, может вызвать артефакты во время процесса визуализации.
  2. Субкультурные клетки
    1. Когда клетки составляют приблизительно 80% слива, кратковременно промыть 2 мл трипсина-ЭДТА (0,25% (мас./об.) трипсина/0,53 мМ ЭДТА). Аспирировать трипсин-ЭДТА, добавить 3 мл свежего трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение 3-5 мин при 37 °С.
    2. Когда клетки отделяются от чашки для культивирования клеток, добавляют 7 мл свежей полной среды.
    3. Пипетка 1 мл клеточной суспензии в новую чашку для культивирования клеток 10 см и добавление 9 мл свежей полной среды для получения разведения клеток 1:10.
    4. Культивируйте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2.
    5. Субкультура клеток каждые 3-5 дней, в зависимости от клеточной линии.

2. Генерация сфероидов

  1. Покрытие плит из 96 скважин материалом фундамента ECM
    1. Оттаивание материала подвала ECM на льду в течение ночи.
    2. Разбавляйте материал фундамента ECM в холодной фенольной среде, не содержащей красных сывороток, используя предварительно охлажденные наконечники, выдержанные при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация материала фундамента ECM зависит от используемой клеточной линии. Для клеток HT-29 и H358 используйте 4 мг·мл-1 из материала фундамента ECM. Для клеток HepG2 используют 4 мг·мл-1 из материала основания ECM с пониженным фактором роста.
    3. Пипетка 15 мкл раствора фундамента/среды ECM в 96-луночную визуализирующую пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для крупномасштабного производства сфероидов этот этап может быть выполнен как с 8-канальной пипеткой, так и с 96-канальной пипеткой, при условии, что наконечники и резервуар, содержащие материал фундамента ECM, охлаждены.
    4. Центрифугировать пластину в течение 20 мин при 91 х г при 4 °C.
    5. Инкубировать пластину не дольше 30 мин при 37 °C.
  2. Субкультура и подсчет клеток
    1. Во время инкубационного периода пластинок инкубируют клетки с трипсином-ЭДТА и повторно суспендируют их в полной среде, содержащей 10% FBS.
    2. Пипетка 10 мкл клеточной суспензии в счетную камеру гемоцитометра. Подсчитайте количество ячеек в 4 квадрантах камеры.
    3. Рассчитайте количество ячеек в суспензии ячейки, определив среднее число ячеек в 4 квадрантах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки также могут быть подсчитаны с помощью автоматизированных устройств подсчета ячеек.
    4. Центрифугирование ячеек при 135 х г в течение 4 мин при комнатной температуре (RT).
    5. После того, как клетки гранулированы, аспирируйте супернатант и повторно суспендируйте клетки в фенольной полной среде без красного цвета, чтобы получить концентрацию 1 х 106 клеток на мл.
  3. Семенные ячейки в пластины с покрытием материала фундамента ECM
    1. Разбавьте клетки в фенольной полной среде, свободной от красного цвета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность засеянных клеток зависит от используемой клеточной линии. Для клеток HT-29 и HepG2 на лунку засевается 3 х 104 клетки; для клеток H358 засевают 4 x 104 клетки на лунку.
    2. Засейте клетки в общем объеме 35 мкл на лунку. Убедитесь, что вы добавляете их по каплям круговыми движениями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для крупномасштабного производства сфероидов этот этап может быть выполнен с помощью 8-канальной пипетки, если может быть достигнуто круговое движение пипетки.
    3. Инкубируют клетки в течение 1 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2.
    4. Готовят раствор материала фундамента ECM в фенольной полной среде без красного цвета, в результате чего получается конечная концентрация 2% материала основания ECM в скважине. Для достижения этой цели добавьте 1,2 мкл материала фундамента ECM к 23,8 мкл фенольной полной среды без красного цвета на скважину, в результате чего конечный объем составит 60 мкл на скважину.
    5. Инкубировать клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2.
    6. На следующий день замените среду 100 мкл свежей фенольной полной среды без красного цвета.
    7. Заменяйте среду каждый второй день 100 мкл свежей фенольной полной среды без красного цвета.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из Nürnberg et al., 202015. Эти адаптации в первую очередь основаны на том факте, что сфероиды, описанные в этом протоколе, меньше, чем те, которые используются в работе Nürnberg et al.15, и, как таковые, способствуют сокращению времени инкубации. Например, время блокировки сокращается с 2 ч до 1 ч. Кроме того, поскольку протокол предназначен для высокопроизводительного производства сфероидов, все этапы обработки осуществляются в скважине, в которой культивируются сфероиды, а это означает, что перенос отдельных сфероидов в трубки не требуется.

  1. Подготовьте все растворы и буферы, необходимые для фиксации и окрашивания
    1. Приготовьте фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS), добавив 1 таблетку PBS на 200 мл воды. Автоклав PBS.
    2. Приготовьте параформальдегид (PFA), следуя шагам 3.1.3-3.1.4.
    3. Используйте нагретую мешалку для нагрева 400 мл PBS до 60-70 °C в вытяжном шкафу. Добавьте 15 г PFA при перемешивании. Как только PFA растворится, добавьте 50 мкл 1 M CaCl2 и 50 мкл 1 M MgCl2.
    4. Добавьте 100 мл PBS, чтобы получить окончательный объем 500 мл. Используйте NaOH для уравновешивания PFA до pH 7,4. Фильтруйте PFA через стерильные вакуумные фильтры (размер пор 0,22 мкм), аликвоту и храните при -20 °C.
    5. Приготовьте 1 М раствора глицина, добавив 3,75 г г глицина к 50 мл PBS. Хранить при температуре 4 °C.
    6. Готовят 5 мл буфера пермеабилизации, добавляя 100 мкл тритона Х-100, 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и 1,5 мл 1 Мглицина к 2,4 мл PBS. Хранить при температуре 4 °C не более 2 недель.
    7. Готовят 5 мл блокирующего буфера, добавляя 100 мкл Triton X-100, 0,5 мл DMSO и 0,05 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) к 4,9 мл PBS. Аликвотируют блокирующий буфер в трубки по 1,5 мл и хранят при -20 °C.
    8. Готовят 5 мл инкубационного буфера антител, добавляя 10 мкл полисорбата 20, 0,05 г BSA и 250 мкл DMSO к 4,74 мл PBS. Аликвотирует инкубационный буфер антител в пробирки объемом 1,5 мл и хранит его при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе, описанном здесь, сфероиды собираются только во внутренних 60 скважинах плиты из 96 скважин, хотя они могут быть приготовлены во всех 96 скважинах плиты. Причина подготовки сфероидов только во внутренних 60 скважинах заключается в том, что некоторые объективы с высокой числовой апертурой физически не способны физически отображать весь колодец наружных скважин из-за «юбки» на некоторых типах пластин. Вышеуказанных объемов достаточно для подготовки 60 скважин, содержащих сфероиды.
  2. Фиксация и пермеабилизация сфероидов
    1. Осторожно удалите среду из сфероидов, следя за тем, чтобы слой материала фундамента ECM не был нарушен.
    2. Дважды промывайте сфероиды 70 мкл PBS в течение 3 мин каждый раз.
    3. Зафиксируйте сфероиды с 70 мкл 3% PFA в течение 1 ч при 37 °C.
    4. Дважды промывайте сфероиды 70 мкл PBS в течение 3 мин каждый раз.
    5. Закалка 70 мкл 0,5 М раствора глицина в течение 30 мин при 37 °С.
    6. Пермеабилизируйте сфероиды, используя 70 мкл буфера пермеабилизации в течение 30 мин при РТ.
    7. Дважды промывайте сфероиды 70 мкл PBS в течение 3 мин каждый раз.
    8. Инкубируют сфероиды в 70 мкл блокирующего буфера в течение 1 ч при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как сфероиды были зафиксированы, все последующие этапы обработки могут быть выполнены с использованием 8-канальной пипетки или 96-луночной пипеточной головки, если таковая имеется. Это увеличивает скорость приготовления сфероидов перед визуализацией.
  3. Иммуностерины сфероидов с использованием первичных и вторичных антител
    1. Развести первичное антитело до соответствующего разведения в инкубационном буфере антител и добавить 70 мкл в каждую лунку. Инкубируют сфероиды с первичным антителом в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разведение зависит от специфического используемого антитела. В примере, показанном здесь, лизосомы иммуно загрязнены мышиными антителами против LAMP1 с использованием разведения 1:500.
    2. На следующий день промывайте сфероиды 5 раз 70 мкл PBS в течение 3 минут каждый раз.
    3. Разводят вторичное антитело в разведении 1:500, флуоресцентно-конъюгированный фаллоидин в 1:500 и Hoechst 33342 (из запаса 1 мг мл-1 ) в 1:5000 в буфер инкубации антител и добавляют 70 мкл в каждую лунку. Инкубировать на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разведение антител зависит от специфического используемого антитела. Рекомендуется сильно перекрестно адсорбированные вторичные антитела, которые показывают высокую фотостабильность и высокую яркость.
    4. На следующий день промывайте сфероиды 5 раз 70 мкл PBS в течение 3 минут каждый раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины могут храниться до двух недель в RT до получения изображения, пока сфероиды остаются покрытыми PBS.

4. Получение изображений и анализ сфероидов

  1. Получение изображений
    1. Вставьте 96-луночную пластину, содержащую сфероиды, в конфокальный скрининговый микроскоп с высоким содержанием.
    2. Выберите подходящие лазеры для возбуждения используемых флуорофоров.
    3. Приобретайте каналы последовательно, чтобы избежать перекрестных помех.
    4. Изобразите сфероиды, используя соответствующие цели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать цели погружения в воду, если таковые имеются. Например, объектив 20x/1.0 NA может отображать всю скважину в ~77 полях зрения. Объектив 63x/1.15 NA может отображать всю скважину примерно в 826 полях зрения.
    5. Изображение ~30-40 срезов, в зависимости от глубины сфероида, причем каждый срез взят с интервалом 1,5 мкм от предыдущего.
  2. Анализ изображений
    1. Для морфологического анализа сфероидов выполните шаги 4.2.2-4.2.6.
    2. Сегментация сфероидов на основе флуоресцентно-конъюгированного окрашивания фаллоидином.
    3. Сегментация ядер на основе окрашивания Hoechst 33342.
    4. Сегментация цитоплазмы каждой клетки остаточным пятном Hoechst 33342, которое присутствует в цитоплазме клетки.
    5. Рассчитайте различные морфологические свойства сфероидов, включая объем, площадь поверхности, сферичность и количество ядер на сфероид.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта информация извлекается с использованием различных алгоритмов, встроенных в программное обеспечение для анализа изображений по выбору.
    6. Дальнейшая обработка изображений для удаления сфероидов размером менее 75 000 мкм3 и размером более 900 000 мкм3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения являются предложениями, позволяющими удалять очень маленькие ячейки и большие сборки, которые могли возникнуть в результате слияния нескольких сфероидов. Сфероиды также могут быть классифицированы в классы различных размеров на этом этапе.
    7. Чтобы проанализировать отдельные клетки в сфероидах, выполните шаги 4.2.8-4.2.12.
    8. Сегментация сфероидов на основе флуоресцентно-конъюгированного окрашивания фаллоидином.
    9. Сегментация ядер на основе окрашивания Hoechst 33342.
    10. Сегментация цитоплазмы каждой клетки остаточным пятном Hoechst 33342, которое присутствует в цитоплазме клетки.
    11. Сегментация лизосом на основе вторичного окрашивания антителом.
    12. Рассчитайте различные морфологические свойства клеток внутри каждого сфероида, включая количество лизосом на клетку, объем клетки и площадь поверхности клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта информация извлекается с использованием различных алгоритмов, встроенных в программное обеспечение для анализа изображений по выбору.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описан надежный метод получения 3D-сборок клеточных культур в виде сфероидов, использующих различные типы клеток для представления различных опухолевых тканей. Этот метод позволяет генерировать сотни сфероидов на скважину, что позволяет проводить клеточные анализы с высоким содержанием (рисунок 1). Этот подход ранее использовался для изучения поглощения наночастиц в сфероидах HT-2916 и токсичности, вызванной наночастицами, в сфероидах HepG217...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь подход детализирует платформу для генерации нескольких сотен сфероидов на скважину способом, подходящим для HCS и HCA. По сравнению с другими популярными методами, такими как использование плоскодонных и круглодонных пластин ULA, которые позволяют образовывать только один сфероид на скважину18,19, этот метод дает возможность извлекать информацию высокого разрешения из большого количества сфероидов в формате скрининга. Примечательно, что этот метод...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что с этой работой нет конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают поддержку гранта на инфраструктурные исследования от Научного фонда Ирландии (SFI) (16/RI/3745) JCS. Работа в лаборатории скрининга клеток UCD поддерживается Научным колледжем UCD. ASC финансируется Стипендией для аспирантов правительства Ирландии Ирландского исследовательского совета (IRC) (GOIPG/2019/68). Авторы также благодарят всех членов лаборатории за их вклад и полезные обсуждения. Иллюстрация на рисунке 1 была сгенерирована в BioRender.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% Трипсин-ЭДТА (1x), феноловый красныйGibco25300054
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma AldrichA6003
Хлорид кальцияFisher Scientific10050070
CellCarrier-96 Ultra Microplates, обработанная культура тканей, черная, 96-луночная с крышкойPerkin Elmer6055302Эти пластины были переименованы в Phenoplates
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma AldrichD2650
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS), квалифицированная, одобренная в ЕС, происхождение из Южной Америки, инактивированная при нагреванииGibco10500064
глицин FisherScientificBP381-1
козья антимышиная IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции вторичного антитела, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11029
L-глутамина раствор, 200 мМGibco25030024
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
Хлорид магнияМатрица базальной мембраны Fisher Scientific10647032
Matrigel, без фенола красного, без LDEV, 10 млCorning356237Эту формулу Matrigel также можно найти с тем же каталожным номером в BD Biosciences
Matrigel Growth Factor Reduced MatrigelBD Biosciences356231Эту формулу Matrigel также можно найти с тем же каталожным номером в
Gibco5A от Corning McCoy26600023
среде 5A от McCoy с L-глутамином и бикарбонатом натрия, без фенолового красногогиклона10358633
минимальной незаменимой среды (MEM)Gibco21090022
Минимально необходимая среда (MEM), без глутамина, без фенолового красногоGibco51200046
мышиного моноклонального антитела против LAMP1 (концентрат)Developmental Studies Hybridoma BankH4A3-a
Neubauer счетная камераHirschmann8100203
Nunclon тканевая культура с крышкой, полистирол, 92 мм x 17 ммThermoFisher Scientific150350
Opera Phenix HCS System и программное обеспечение Harmony HCAPerkin ElmerHCSHH14000000
параформальдегида (PFA)Sigma AldrichP6148
Phalloidin Alexa Fluor 568InvitrogenA12380
Фосфатный буферный раствор (PBS) таблеткиSigma AldrichP4417
Polysorbate 20Sigma AldrichP5927
RPMI 1640 Medium, добавка GlutaMAXGibco61870010
RPMI 1640 Medium, без глютамина, без фенола красныйGibco11835063
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Stericup стерильные вакуумные фильтрующие установкиMilliporeSCGVU05RE
среде

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  2. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  3. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  4. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  5. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  6. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  7. Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
  8. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
  9. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  10. Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784(2020).
  11. Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
  12. Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362(2020).
  13. Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy-based high-content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
  14. Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
  15. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
  16. Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033(2019).
  17. Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
  18. Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
  19. Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
  20. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  21. Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043(2020).
  22. Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
  23. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
  24. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904(2020).
  25. Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
  26. Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
  27. Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Spheroid ProductionMulticellular Tumor Spheroids3D Cell CultureConfocal MicroscopyFluorescence ImagingMorphological AnalysisCell SegmentationDrug Delivery StudiesProteomic Analysis

Похожие статьи