Method Article

Многоразовая одиночная клетка для итеративного эпигеномного анализа

DOI:

10.3791/63456

⸱

February 11th, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол описывает одноклеточный метод итеративного эпигеномного анализа с использованием многоразовой одиночной клетки. Многоразовая одиночная клетка позволяет анализировать несколько эпигенетических меток в одной и той же отдельной клетке и статистически проверять результаты.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Современные анализы одноклеточного эпигенома предназначены для одноразового использования. Клетка выбрасывается после однократного использования, предотвращая анализ нескольких эпигенетических меток в одной клетке и требуя данных от других клеток, чтобы отличить сигнал от экспериментального фонового шума в одной клетке. В этой статье описывается метод повторного использования одной и той же отдельной клетки для итеративного эпигеномного анализа.

В этом экспериментальном методе клеточные белки сначала прикрепляются к полиакриламидному полимеру вместо того, чтобы сшивать их с белком и ДНК, смягчая структурное смещение. Этот критический шаг позволяет проводить повторные эксперименты с одной и той же клеткой. Затем случайный праймер с последовательностью каркаса для бесконтактного лигирования отжигают на геномную ДНК, и геномная последовательность добавляется к праймеру путем расширения с использованием ДНК-полимеразы. Впоследствии антитело против эпигенетического маркера и контрольный IgG, каждый из которых помечен различными ДНК-зондами, связываются с соответствующими мишенями в одной и той же отдельной клетке.

Бесконтактное лигирование индуцируется между случайным праймером и антителом путем добавления соединительной ДНК с комплементарными последовательностями к каркасной последовательности случайного праймера и зонда антитело-ДНК. Этот подход объединяет информацию об антителах и близлежащие последовательности генома в один продукт ДНК непрямого лигирования. Позволяя проводить повторные эксперименты с одной и той же отдельной клеткой, этот метод позволяет увеличить плотность данных из редкой клетки и статистического анализа с использованием только данных IgG и антител из той же клетки. Многоразовые одиночные клетки, полученные с помощью этого метода, могут храниться в течение, по крайней мере, нескольких месяцев, а затем повторно использоваться для расширения эпигенетической характеристики и увеличения плотности данных. Этот метод обеспечивает гибкость исследователям и их проектам.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одноклеточная технология вступает в эру одноклеточной мультиомики, которая объединяет отдельные одноклеточные омические технологии1. В последнее время одноклеточная транскриптомика была объединена с методами определения доступности хроматина (scNMT-seq2 и SHARE-seq3) или модификаций гистонов (Paired-seq4 и Paired-Tag5). Совсем недавно одноклеточная транскриптомика и протеомика были интегрированы с доступностью хроматина (DOGMA-seq6). Эти методы используют мечение на основе транспозазы для обнаружения доступности хроматина или модификаций гистонов.

Подходы, основанные на транспозазе, расщепляют геномную ДНК и добавляют штрих-код ДНК в конце фрагмента геномной ДНК. Каждый расщепленный фрагмент генома может принимать только до двух штрих-кодов ДНК (= одна эпигенетическая метка на сайт расщепления), и геномная ДНК в месте расщепления теряется. Таким образом, подходы, основанные на расщеплении, имеют компромисс между количеством протестированных эпигенетических меток и плотностью сигнала. Это затрудняет анализ нескольких эпигенетических меток в одной и той же клетке. Для решения этой проблемы был разработан одноклеточный эпигеномный метод, который не расщепляет геномную ДНК 7,8.

В дополнение к упомянутой выше проблеме, связанной с расщеплением, подходы, основанные на транспозазе, имеют и другие ограничения. При анализе одноклеточного эпигенома очень важно знать расположение гистонов и ДНК-ассоциированных белков в геноме. В современных подходах это достигается за счет использования нефиксированных одиночных клеток и сохранения белок-ДНК и белок-белковых взаимодействий. Однако это приводит к сильному смещению в отношении доступных областей хроматина даже при анализе модификаций гистонов 9. Расположение гистонов и геном-ассоциированных белков на геноме может быть сохранено без сшивания белок-ДНК и белок-белок, используя полиакриламидный каркас 7,8. Этот подход уменьшает структурное смещение, наблюдаемое в современных подходах, которые зависят от белок-ДНК и белок-белковых взаимодействий.

Подходы, основанные на транспозазе, могут получать сигналы только один раз от одной клетки. Поэтому трудно очертить полный эпигеном одной клетки из-за падения сигналов. Многоразовые одиночные клетки были разработаны для преодоления текущих ограничений, позволяя проводить итеративный эпигеномный анализ в одной и той же отдельной клетке.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое изображение метода показано на рисунке 1.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схематическое изображение рабочего процесса протокола. Этапы 7.2-13 объясняются с помощью схематических изображений. Каждая строка указывает шаг в протоколе. Клеточный белок, окрашенный в зеленый цвет, представляет собой нуклеосому человека, созданную на основе кристаллической структуры (PDB: 6M4G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Уравновешивание обессоливающих колонн

ПРИМЕЧАНИЕ: Обессоливание спиновых колонн уравновешивается, как описано в следующих шагах. Уравновешенные обессоливающие колонны используются на этапах 2.1, 3.4 и 4.6.

  1. Снимите нижнюю крышку обессоливающей колонны (отсечка 7 кДа, объем шарика смолы 0,5 мл, см. Таблицу материалов) и ослабьте крышку в верхней части обессоливающей колонны.
  2. Поместите колонку в пробирку с низким связыванием белка объемом 1,5 мл (пробирку для сбора, см. Таблицу материалов) и центрифугу при 1,500 × г в течение 1 мин при комнатной температуре, чтобы удалить раствор для хранения в колонке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте центрифугу с поворотным ротором, чтобы сгладить верхнюю часть слоя борта.
  3. Удалите проточный фильтр в пробирке объемом 1,5 мл и добавьте 300 мкл 150 мМ фосфатного буфера NaCl/100 мМ с pH 8,0 (см. Таблицу 1) поверх слоя смолы.
  4. Центрифугу при 1 500 × г в течение 1 мин при комнатной температуре и удаляют проточные отверстия в сборную трубку.
  5. Повторите шаги 1.3-1.4 еще три раза.
  6. Избавьтесь от буфера из сборной трубки и поместите колонку в новую сборную трубку.
  7. Используйте уравновешенную колонну обессоливания на шагах 2.1, 3.4 и 4.4.

2. Буферный обмен антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите глицерин, аргинин и азид натрия из анти-H3K27ac 10, анти-H3K27me3 10, анти-Med111 и анти-Pol II10 (см. Буферную композицию, показанную в таблице 1). Все последующие процедуры выполняются под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 1 час

  1. Наносят раствор антитела (100 мкл, см. Таблицу 2) на уравновешенную обессоливающую колонну, приготовленную после шага 1.
  2. Центрифугу при 1 500 × г в течение 2 мин при 4 °C и перенос потока из сборной пробирки в пробирку с низким связыванием белка объемом 1,5 мл.
  3. Измерьте концентрацию IgG с помощью абсорбции на длине волны280 нм 12 (используйте микрообъемный спектрофотометр).
  4. Переносят раствор антитела в ультрафильтрационную кассету (отсечка молекулярной массы 100 кДа, 0,5 мл, см. Таблицу материалов) и центрифугу при 12 000 × г в течение 5 мин при 4 °C.
  5. Измерьте концентрацию IgG, используя коэффициент поглощения на длине волны 280 нм.
  6. Повторяйте шаги 2,4-2,5 до тех пор, пока концентрация IgG не достигнет 1 мг / мл.

3. Активация антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 2,5 часа

  1. Растворите 1 мг сукцинимидил-6-гидразиноникотината ацетонгидразона гидразона (S-HyNic, см. Таблицу материалов) 100 мкл безводного N,N-диметилформамида (ДМФ, см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДМФА является легковоспламеняющимся органическим растворителем и мощным токсином печени, всасывающимся через кожу. Наденьте перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Следуйте инструкциям по безопасности в учреждении. Утилизируйте использованную лабораторную посуду в соответствии с руководящими принципами учреждения.
  2. Добавьте 0,6 мкл S-HyNic / DMF к 100 мкл раствора антитела (1 мг / мл в 150 мМ NaCl / 100 мМ фосфата натрия, pH8,0. В таблице 2 приведены используемые антитела и контрольный IgG.
  3. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 ч (беречь от света).
  4. Нанесите 100 мкл антитела, реагирующего на S-HyNic, в верхнюю часть уравновешенной обессоливающей колонны (см. шаг 1) и центрифугу при 1,500 × г в течение 2 мин при 4 °C для сбора образца.
  5. Выбросьте обессоливающую колонну после использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильность групп HyNic на белках и других биомолекулах варьируется. Рекомендуется немедленно конъюгировать биомолекулы, модифицированные HyNic.

4. Активация ДНК-зонда

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 2,5 часа

  1. Растворите гранулу модифицированного амином ДНК-зонда для антител или контрольного IgG (зонд антител, таблица 3) 20 мкл 150 мМ NaCl / 100 мМ буфера фосфата натрия, pH 8,0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ищите тонкие прозрачные гранулы / пленку на дне тюбика. Нанесите буфер непосредственно на гранулы. Если гранула не видна, возможно, гранула отсоединилась и прилипла к стене или крышке. В этом случае центрифугируйте пробирку и ищите гранулы на дне пробирки.
  2. Растворите 1 мг сукцинимидил-4-формилбензоата (S-4FB, см. Таблицу материалов) 50 мкл безводного ДМФА и добавьте 10 мкл ДМФА к растворенному зонду антител.
  3. Добавьте 4 мкл S-4FB/DMF, приготовленного на этапе 4.2, перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 ч (защищая от света).
  4. Нанесите 34 мкл зонда антител, реагирующего на S-4FB, в верхнюю часть уравновешенной обессоливающей колонны (см. шаг 1).
  5. Нанесите 15 мкл 150 мМ NaCl/100 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 8,0, на верхнюю часть слоя геля после того, как образец полностью впитается, и центрифугу при 1,500 × г в течение 2 мин при 4 ° C для сбора модифицированного S-4FB зонда антител.
  6. Используйте проточный канал для последующего спряжения; измерить коэффициент поглощения на длине волны 260 нм; и рассчитайте скорость восстановления зонда антител.

5. Конъюгация S-HyNic-модифицированного антитела и S-4FB-модифицированного зонда антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 2 часа

  1. Смешайте антитело, модифицированное S-HyNic, и зонд антитела, модифицированное S-4FB, и нанесите раствор пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать.
  2. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре (беречь от света).
  3. Чтобы погасить реакцию, добавьте 478,8 мкл раствора для тушения и хранения (см. Таблицу 1).
  4. Перенесите раствор антитела, конъюгированного с зондом антитела, в ультрафильтрационную кассету (отсечка молекулярной массы 100 кДа).
  5. Центрифуга в течение 5 мин при 12 000 × г, 4 °C.
  6. Проверьте объем раствора внутри кассеты пипеткой.
  7. Повторяйте шаги 5,5-5,6 до тех пор, пока объем не достигнет 100 мкл, и храните при температуре -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация IgG измеряется с помощью сэндвич-ИФА13,14,15 с использованием стандарта IgG.

6. Подготовка магнитных шариков сердечника

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом методе одна ячейка встроена в двухслойный акриламидный шарик (см. рис. 2). Ядро представляет собой магнитную полиакриламидную бусину. Внешний слой состоит только из полиакриламида. В этом разделе генерируются магнитные шарики с сердечником. Этот раздел не является обязательным для эксперимента. Время: 3 часа

figure-protocol-2
Рисунок 2: Структура двухслойного полиакриламидного шарика для видимости и простоты обращения в экспериментах REpi-seq . (A) Магнитные наночастицы со стадии 6.6 после центрифугирования. Магнитные наночастицы модифицированы мономерным акриламидом и интегрированы в полиакриламидный магнитный шарик, показанный на B. (B) Схематическое изображение многоразовой одиночной ячейки с полиакриламидным магнитным шариком. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Смешайте 50 мкл 1 М буфера бикарбоната натрия с pH 8,5 и 450 мкл 40% раствора акриламида.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Акриламид является нейротоксином. Наденьте перчатки, защиту глаз и лабораторный халат. Следуйте инструкциям по безопасности в учреждении. Утилизируйте использованную лабораторную посуду в соответствии с руководящими принципами учреждения.
  2. Суспендировать 1 г 30 нм порошка оксида железа, функционализированного эфиром NHS (см. Таблицу материалов), в буфере из акриламида/бикарбоната натрия и инкубировать при 4 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку акриламидные шарики прозрачны, может быть трудно увидеть и манипулировать положением бусин. Включение стержня из оксида железа улучшает видимость и облегчает манипуляции, поскольку положение шариков можно контролировать с помощью магнита. Однако, если пользователи знакомы с экспериментами REpi-seq, использование магнитных полиакриламидных шариков с сердечником можно пропустить.
  3. Перенесите суспензию наногранул в 2 пробирки (1,5 мл), центрифугу при 21 300 × г в течение 1 ч (используйте угловой ротор) при 4 ° C и удалите надосадочную жидкость.
  4. Суспендировать донную суспензию 1 мл 40% акриламида / бис-акриламида (19: 1, см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бис-акриламид является нейротоксином. Наденьте перчатки и лабораторный халат. Следуйте инструкциям по безопасности в учреждении. Утилизируйте использованную лабораторную посуду в соответствии с руководящими принципами учреждения.
  5. Центрифуга при 21 300 × г в течение 1 ч (используйте угловой ротор) при 4 °C.
  6. Центрифуга при 5 000 × г в течение 30 мин (используйте поворотный ротор без тормоза) при 4 °C.
  7. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки P1000 с медленной аспирацией.
  8. Отрегулируйте объем 400 мкл 40% акриламида/бис-акриламида (19:1, см. Таблицу материалов).
  9. Добавьте 25 мкл 10% раствора персульфата аммония (см. таблицу 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Персульфат аммония является сильным окислителем. Переносимая по воздуху пыль, содержащая персульфат аммония, может раздражать глаза, нос, горло, легкие и кожу при контакте. Наденьте перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Следуйте инструкциям по безопасности в учреждении. Утилизируйте использованную лабораторную посуду в соответствии с руководящими принципами учреждения.
  10. Чтобы получить магнитные полиакриламидные шарики с сердечником, перенесите 0,5 мкл суспензии оксида железа, модифицированной акриламидом, в пробирку для ПЦР.
  11. Добавьте 50 мкл 4% N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамина/минерального масла (TEMED, см. Таблицу 1) и выдержите в течение ночи при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: TEMED является легковоспламеняющимся растворителем. Работа под капотом. Не вдыхайте. Хранить вдали от открытого огня, горячих поверхностей и источников возгорания. Наденьте перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Следуйте инструкциям по безопасности в учреждении. Утилизируйте использованную лабораторную посуду в соответствии с руководящими принципами учреждения.

7. Модификация аминогруппы клеточных белков мономеракриламидом

ПРИМЕЧАНИЕ: REpi-seq был разработан для анализа эпигенома клеток мыши и человека на уровне отдельных клеток. Каждый шаг должен быть оптимизирован при использовании этого метода на клетках видов, отличных от мыши или человека.

  1. Заготовка клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время: 30 мин
    1. Измерьте концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью счетчика клеток (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток на этом этапе влияет на то, сколько клеток являются живыми клетками в анализе данных.
    2. Отрегулируйте концентрацию клеток до 1 ×10,5 клеток/мл с питательной средой (*), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: * Питательная среда является оптимальной питательной средой для интересующих клеток.
    3. Перенесите 1 мл клеточной суспензии в пробирку объемом 1,5 мл.
    4. Центрифугируют клеточную суспензию при 240 × г в течение 5 мин при 4 °С и удаляют надосадочную жидкость.
    5. Добавьте 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), перемешайте клетки мягким пипетированием и центрифугируйте клеточную суспензию при 240 × г в течение 5 мин при 4 ° C.
    6. Удалите надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все вышеперечисленные шаги следует выполнять в чистом колпаке с ламинарным потоком, чтобы предотвратить загрязнение.
  2. Модификация аминогруппы клеточных белков мономерным акриламидом
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 1,5 ч
    1. Добавьте 1 мл раствора для модификации аминогруппы (см. Таблицу 1) в клеточную гранулу и суспендируйте клеточную гранулу путем осторожного пипетирования.
    2. Инкубируют пробирку на льду в течение 1 ч и центрифугу клеточную суспензию при 240 × г в течение 5 мин при 4 °С.
    3. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки 100 мл 4% акриламида / 1 мМ ЭДТА / PBS, содержащего интеркаляторный краситель для ДНК (см. Таблицу 1, 1 клетка / мкл).

8. Подготовка многоразовых одиночных ячеек

  1. Подготовка многоразовых одиночных ячеек (ручная версия)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 9 ч/96 ячеек
    1. Смешайте 1 мл клеточной суспензии (1 клетка/мкл) и 199 мл 1 мМ ЭДТА/ПБС, содержащей интеркаляторный краситель для ДНК (см. Таблицу 1).
    2. Перенесите 200 мкл суспензии ячейки в каждую лунку с плоским дном 96-луночных пластин (всего 10 пластин, см. Таблицу материалов).
    3. Наденьте крышку на 96-луночную пластину и отсканируйте 10 пластин с помощью сканирующего микроскопа (см. Таблицу материалов), чтобы идентифицировать лунки, содержащие одну ячейку.
    4. Перенесите содержимое лунки, содержащей одну клетку, в ПЦР-пробирку.
      1. Наклоните пластину (в сторону оператора) и подождите несколько минут, пока одиночная ячейка не опустится до нижнего края колодца.
      2. Поместите наконечник пипетки в нижний угол и перенесите одну клетку и буфер (аспирация 210 мкл / лунка = 200 мкл буфера + 10 мкл воздуха) в пробирку для ПЦР.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте наконечник P200 с низким уровнем удержания.
      3. Проверьте лунку с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы подтвердить перенос.
      4. Если одна клетка все еще находится в лунке, добавьте 200 мкл / лунку 1 мМ ЭДТА / PBS, содержащую интеркаляторный краситель для ДНК.
      5. Затем повторите передачу.
    5. Центрифугируют ПЦР-пробирку при 240 × г в течение 5 мин при 4 °С с помощью поворотного ротора без тормоза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Торможение вызывает закрученный поток воды в трубке, который нарушает осаждение одиночной ячейки. При центрифугировании с качающимся ротором без тормоза одиночная ячейка всегда будет опускаться на дно трубки. Однако, если используется угловой ротор, одиночная ячейка прикрепляется к боковой стенке ПЦР-пробирки и может быть потеряна.
    6. Удалите 195 мкл надосадочной жидкости с очень низкой скоростью пипетирования.
    7. Добавьте 195 мкл / тюбик раствора акриламида / бис-акриламида / APS (см. Таблицу 1).
    8. Центрифугируют ПЦР-пробирку при 240 × г в течение 5 мин при 4 °С с помощью поворотного ротора без тормоза.
    9. Удалите 195 мкл надосадочной жидкости с очень низкой скоростью пипетирования.
    10. Перенесите нижние 3 мкл в пробирку для ПЦР, содержащую 4% TEMED/минерального масла и магнитный полиакриламидный шарик (полученный на этапе 6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте наконечник P10 с низким уровнем удержания. Распределите ячейку рядом с магнитным полиакриламидным шариком. В минеральном масле жидкость, содержащая одиночную ячейку, прилипает к поверхности магнитного полиакриламидного шарика за счет поверхностного натяжения.
    11. Инкубировать в течение ночи при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В результате этого процесса образуется двухслойный шарик акриламидного геля. Сердцевина представляет собой магнитный гелевый шарик. Внешний слой представляет собой полиакриламидный гель, содержащий одну ячейку. Одиночная клетка встроена во внешний слой геля. Безопасная точка остановки: После промывки многоразовых одиночных ячеек 50% глицерином/1 мМ ЭДТА/0,05% буфером Tween 20/0,5% BSA/TBS многоразовые одиночные ячейки можно хранить при -20 °C до 6 месяцев.
  2. Подготовка многоразовых одиночных ячеек (полуавтоматическая версия)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 3 ч/96 ячеек
    1. Смешайте 1 мл клеточной суспензии (1 клетка/мкл) и 199 мл 1 мМ ЭДТА/ПБС, содержащей интеркаляторный краситель для ДНК (см. Таблицу 1).
    2. Перенесите 200 мкл суспензии ячеек в каждую лунку пластины с нанолункой 4 нл (см. Рисунок 3 и Таблицу материалов) и поместите пластину с наноячейкой 4 нл на автоматизированного робота-сборщика одной ячейки (см. Таблицу материалов).
    3. Поместите ПЦР-планшет на 96 лунок в качестве целевой пластины на автоматизированном роботе для сбора отдельных клеток. Убедитесь, что каждая лунка содержит 200 мкл / лунку раствора акриламида / бис-акриламида / APS (см. Таблицу 1).
    4. Перенесите одну ячейку из нанолунки 4 нл в лунку 96-луночной ПЦР-пластины (см. Дополнительное видео S1).
    5. Накройте 96-луночную ПЦР-пластину крышкой и центрифугируйте 96-луночную пластину при 240 × г в течение 5 мин при 4 °C, используя поворотный ротор без тормоза.
    6. Поместите ПЦР-планшет с 96 лунками на палубу автоматического робота для работы с жидкостями (см. Таблицу материалов, рис. 4 и дополнительный код 1).
    7. Перетащите дополнительный код 1 в окно программного обеспечения (см. Таблицу материалов) робота для работы с жидкостями.
    8. Запустите программу на автоматическом роботе для работы с жидкостями (см. Дополнительное видео S2 и Дополнительное видео S3).
      1. Удалите 195 мкл надосадочной жидкости с очень низкой скоростью пипетирования.
      2. Добавьте 50 мкл 4% TEMED/минерального масла.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 8.2.8.1-8.2.8.2 могут быть выполнены с помощью ручного пипетирования.
    9. Инкубировать в течение ночи при комнатной температуре (Рисунок 5). Безопасная точка остановки: после промывки многоразовых одиночных ячеек 50% глицерином/1 мМ ЭДТА/0,05% буфером Tween 20/0,5% BSA/TBS храните многоразовые одиночные ячейки при -20 °C до 6 месяцев.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Автоматический отбор и перенос отдельных ячеек в 96-луночный планшет для ПЦР на шаге 8.2 . (A) Обзор системы отбора с одной ячейкой. Один робот для сбора ячеек находится в чистом колпаке с ламинарным потоком, чтобы избежать загрязнения. (B) 24-луночная пластина с нанолунками 4 нл внутри лунки. (C) Распределение ячеек в скважине из 24-луночного планшета. Зеленые точки - это клетки, идентифицированные как одна клетка в каждой нанояме объемом 4 нл. Пурпурные точки - это клетки, идентифицированные как дублеты или мультиплеты клеток. (D) Изображение скважины в светлом поле на 24-луночной пластине. Зеленый квадрат представляет собой нанолунку объемом 4 нл, содержащую одну ячейку. Пурпурный квадрат представляет собой нанолунку объемом 4 нл, содержащую несколько ячеек. (E) Увеличенное поле нанолунок объемом около 4 нл. Яркие точки представляют собой одиночные клетки в нанолунках 4 нл. Система отбора одиночных клеток идентифицирует нанолунки, содержащие одну клетку, путем получения яркого поля и флуоресцентных изображений клеток с окрашиванием DAPI. Идентифицированные одиночные клетки переносятся из нанолунки 4 нл в лунку 96-луночной ПЦР-пластины. Масштабные линейки = 2 мм (C, D), 100 мкм (E). Аббревиатура = DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-4
Рисунок 4: Создание многоразовых одиночных ячеек с использованием робота для обработки жидкостей. (А) Палуба робота для обработки жидкостей. Колода имеет 11 слотов для стоек для наконечников пипеток (наконечник P300: слоты 1-3, наконечник P20: слоты 5-6), планшет для глубоких скважин объемом 2 мл на 96 лунок (слот 4), два планшета для ПЦР на 96 лунок, содержащие по одной ячейке на лунку (слоты 7 и 10), и два планшета с плоским дном на 96 лунок для жидких отходов (слоты 8 и 11). (B) Палуба после размещения лабораторной посуды. (C) Схематическое изображение роботизированного пипетирования на этапе 8.8.1. Программа удаляет надосадочную жидкость без аспирации ни одной клетки со дна 96-луночной ПЦР-пластины. (D) Многоразовые одиночные ячейки, созданные с использованием Дополнительного кода 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

9. Случайный отжиг и удлинение грунтовки

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Звездочки (*) на следующих этапах указывают на то, что магнитный сепаратор может быть использован для управления положением полиакриламидных шариков, содержащих многоразовую одиночную ячейку в пробирке. Однако использование магнитного сепаратора не является обязательным. Медленно двигаясь вниз по наконечнику пипетки вдоль стенки трубки, шарики выталкиваются вверх для промывки или буферной замены. Время: 9 ч

  1. Удалите минеральное масло пипеткой (*) и промойте (*) 5 раз 200 мкл 1x TP Mg(-) буфера (разбавьте 10x TP Mg(-) буфер до 1x буфера сверхчистой водой, см. Таблицу 1).
  2. Удалите надосадочную жидкость (*) и добавьте 15 мкл буфера для отжига (см. Таблицу 1).
  3. Инкубировать в течение 1 ч на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этой инкубации является проникновение плазматической и ядерной мембран и доставка случайного праймера в ядро клетки.
  4. Поместите пробирки для ПЦР на термоциклер и нагревайте при температуре 94 °C в течение 3 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет приблизительно 20 мкл, включая объем полиакриламидного шарика. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C.
  5. Переложите трубки в охлажденный льдом металлический блок и выдерживайте в течение 2 минут.
  6. Добавьте 4 мкл смеси MgSO4/NaCl/dNTP (см. Таблицу 1) и перемешайте вихревым смесителем на средней скорости.
  7. Добавьте 1 мкл Bst-полимеразы, крупный фрагмент (см. Таблицу материалов) и перемешайте с помощью вихревого смесителя на средней скорости.
  8. Инкубировать в течение 4 ч на шейкере (600 об/мин при 4 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этой инкубации является доставка Bst-полимеразы в ядро клетки.
  9. Поместите ПЦР-пробирку на термоциклер и запустите одну из следующих программ.
    1. Запустите 4-часовую программу: 10 °C в течение 30 мин, 20 °C в течение 30 мин и 25 °C в течение 180 мин.
    2. В качестве альтернативы запустите ночную программу: 4 ° C в течение 4 ч, 10 ° C в течение 2 ч, 20 ° C в течение 2 ч, 25 ° C в течение 4 ч и удерживайте при 4 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет приблизительно 25 мкл, включая объем полиакриламидного шарика. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C. Безопасная точка остановки: Остановите эксперимент здесь на срок до 1 дня, храня многоразовые отдельные ячейки при температуре 4 °C.

10. Связывание антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 1,5 ч

  1. Добавьте 1,625 мкл раствора NaCl/EDTA/BSA (см. Таблицу 1) и перемешайте вихревым движением на низкой скорости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг направлен на то, чтобы: 1) облегчить хелатирование Mg2+ ЭДТА, 2) стабилизировать связывание расширенного1-го случайного праймера 300 мМ NaCl и 3) блокировать неспецифическое связывание антител с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA) в последующей реакции.
  2. Инкубируют в течение 1 ч на льду и добавляют по 0,1 мкг/мл каждого антитела и контрольного IgG, конъюгированного с зондом антител (приготовленным на шаге 5).
  3. Инкубировать в течение ночи на льду, слегка встряхивая шейкер.

11. Бесконтактное лигирование зонда антител и проксимально расширенного случайного праймера

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Звездочки (*) на следующих этапах указывают, где можно использовать магнитный сепаратор для управления положением полиакриламидных шариков, содержащих многоразовую одиночную ячейку в пробирке. Однако использование магнитного сепаратора не является обязательным. Медленно двигаясь вниз по кончику пипетки вдоль стенки трубки, шарики можно выталкивать вверх для промывки или замены буфера. Время: 6 ч

  1. Промыть (*) дважды 200 мкл 1x буфера TPM-T (20-минутная инкубация при каждой промывке) на льду. Разбавьте 10x буфер TPM-T (Tris-HCl / хлорид калия / сульфат магния / Triton X-100) до 1x сверхчистой водой).
  2. Удалите (*) надосадочную жидкость и промойте (*) один раз 1x буфером ДНК-лигазы Т4 (см. Таблицу материалов).
  3. Удалите (*) надосадочную жидкость и добавьте 19 мкл раствора адаптера лигирования (см. Таблицу 1).
  4. Инкубировать 1 ч при 25 °C.
  5. Добавьте 1 мкл ДНК-лигазы Т4 (см. Таблицу материалов) и перемешайте пробирку на вихревой смесителе на средней скорости.
  6. Поместите пробирку на термоциклер и запустите следующую программу: программа бесконтактного лигирования, 4 ч при 16 °C и 30 мин при 25 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет приблизительно 25 мкл, включая объем полиакриламидного шарика. Температура крышки термоциклера комнатная.
  7. Дважды ненадолго промойте (*) 200 мкл 1x буфера Bst Mg(-) EDTA(+) (см. Таблицу 1; приготовьте 1x буфер из 10x запасного буфера) и храните ячейку при температуре 4 °C на ночь. Безопасная точка остановки: Остановите эксперимент здесь на срок до 1 дня, храня многоразовые отдельные ячейки при температуре 4 ° C.

12. Полное расширение 1-го случайного праймера

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 4,5 часа

  1. Дважды промойте 200 мкл 1x Bst Mg(-) EDTA(-) буфером (см. Таблицу 1, приготовьте 1x буфер из 10x исходного буфера), удалите надосадочную жидкость и добавьте 20 мкл смеси Bst/dNTPs/MgSO4 (см. Таблицу 1).
  2. Смешайте с помощью вихревого смесителя на средней скорости и выдерживайте в течение 4 ч на орбитальном шейкере (при 6 °C и 500 об/мин).
  3. Поместите трубку на термоциклер и запустите следующую программу: программа полного расширения: 10 °C в течение 1 ч, 20 °C в течение 1 ч, 30 °C в течение 1 ч, 40 °C в течение 1 ч, 50 °C в течение 1 ч, 65 °C в течение 1 ч, 94 °C в течение 10 мин и держать при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная точка остановки: эксперимент можно остановить здесь на срок до 1 дня, храня многоразовые одиночные ячейки при температуре 4 ° C.

13. Многократное усиление смещения

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 2,5 ч (шаги 13.1-13.2) + 15 мин (шаги 13.3-13.4) + 1 день (шаги 13.5-13.10)

  1. Добавьте 0,4 мкл 100 мкМ2-й случайной грунтовки (см. Таблицу 3) и перемешайте вихревым смесителем на средней скорости.
  2. Инкубировать в течение 2 ч при 6 °C и 500 об/мин на орбитальном шейкере, поместить трубку в термоциклер и нагревать при 94 °C в течение 3 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет приблизительно 25,4 мкл, включая объем полиакриламидного шарика. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C.
  3. Поместите пробирки в металлический блок с ледяным охлаждением и добавьте 1 мкл / пробирку ДНК-полимеразы Bst.
  4. Закрутите вихрь на медленной скорости, поместите трубки на термоциклер и запустите следующую программу:
    4 °C в течение 4 ч, 10 °C в течение 30 мин, 20 °C в течение 30 мин, 30 °C в течение 30 мин, 40 °C в течение 30 мин, 50 °C в течение 30 мин, 65 °C в течение 60 мин, 94 °C в течение 3 мин и держать при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет приблизительно 26,4 мкл, включая объем полиакриламидного шарика. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C. Безопасная точка остановки: Остановите эксперимент здесь на срок до 1 дня, храня многоразовые отдельные ячейки при температуре 4 °C.
  5. Соберите надосадочную жидкость (примерно 20 мкл) и перенесите ее в ПЦР-пробирку.
  6. Храните собранную надосадочную жидкость при температуре -80 °C.
  7. Добавьте 20 мкл / пробирку 0,05% буфера Tween 20/0,1x TE в пробирку для ПЦР, содержащую многоразовую одиночную клетку (см. Таблицу 1), и инкубируйте многоразовую одиночную клетку при 4 ° C в течение ночи. Безопасная точка остановки: остановите эксперимент здесь на несколько дней, продлив время инкубации.
  8. Соберите надосадочную жидкость и объедините надосадочную жидкость с образцом, собранным на шаге 13.5.
  9. Повторите шаги 13.7-13.8 еще раз. Замочите многоразовую одиночную ячейку в 50% глицерине/5 мМ ЭДТА/0,5% BSA/0,05% Tween20/TBS буфера и инкубируйте в течение 30 минут на орбитальном шейкере (4 °C, 600 об/мин). Храните многоразовую одиночную ячейку при температуре -20 °C до следующего эксперимента.
  10. Добавьте 40 мкл смеси Exo-master (см. Таблицу 1), поместите пробирку на термоциклер и запустите следующую программу: i) 95 °C в течение 5 мин, ii) 95 °C в течение 30 с, iii) 60 °C 30 с, iv) 72 °C в течение 30 с, v) повторить шаги ii-iv 19 раз, vi) 72 °C в течение 5 мин, vii) хранить при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет приблизительно 45 мкл, включая объем полиакриламидного шарика. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C. Безопасная точка остановки: эксперимент можно остановить здесь, по крайней мере, на несколько дней, если хранить образец при температуре -80 °C.

14. Фенол-хлороформная очистка и осаждение полиэтиленгликоля

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 1,5 ч

  1. Перенесите продукт в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 0,5 мл и добавьте 100 мкл фенола: хлороформа: изоамилового спирта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фенол: хлороформ: изоамиловый спирт вызывает раздражение и, возможно, ожоги при контакте. Наденьте перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Используйте только при достаточной вентиляции или надевайте соответствующий респиратор. Следуйте инструкциям по безопасности в учреждении. Утилизируйте использованную лабораторную посуду в соответствии с руководящими принципами учреждения.
  2. Встряхните в течение 30 с вручную и центрифугу при 12 000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
  3. Соберите водную фазу (80 мкл) в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 0,5 мл и добавьте 40,84 мкл / пробирку смеси линейного акриламида / MgCl2 (см. Таблицу 1).
  4. Добавьте 47,06 мкл / пробирку 50% (мас./об.) PEG8000 (без РНКазы) и перемешайте пипеткой.
  5. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре и центрифуге при 240 × г в течение 10 мин при комнатной температуре.
  6. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 400 мкл / тюбик 80% этанола (EtOH).
  7. Промойте 80% EtOH, удалите надосадочную жидкость с помощью аспиратора и высушите гранулы на воздухе.
  8. Суспендируйте гранулу с 20 мкл 1 мМ ЭДТА / 10 мМ трис-HCl, буфер pH 7,4, и храните раствор при -80 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте концентрацию ДНК с помощью двухцепочечного интеркаляторного красителя, специфичного для ДНК (см. Таблицу материалов). Безопасная точка остановки: Эксперимент можно спокойно остановить здесь как минимум на неделю.

15. Транскрипция in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой и РНКазой. Время: 5 ч

  1. Разморозьте ДНК продуктов, полученных из одной клетки (начиная с этапа 14), и подготовьте смешанную библиотеку продуктов, полученных из одной клетки, путем смешивания 2 мкл / клетка продуктов ДНК (общий объем 20 мкл).
  2. Добавьте 26 мкл мастер-смеси для транскрипции in vitro (см. Таблицу материалов и протокол производителя) и перемешайте пипеткой.
  3. Поместите ПЦР-пробирку в термоциклер и инкубируйте в течение 4 ч при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет 46 мкл. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C.
  4. Добавьте 5 мкл 10-кратного буфера ДНКазы I (см. Таблицу материалов) и добавьте 4 мкл ДНКазы I (без РНКазы, 4 ЕД, см. Таблицу материалов).
  5. Смешать и инкубировать в течение 15 мин при 37 °C и перенести образец в пробирку объемом 0,5 мл.
  6. Добавьте 300 мкл / тюбик тиоцианата-фенола-хлороформа гуанидиния (см. Таблицу материалов) и перемешайте легким вихрением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тиоцианат-фенол-хлороформ гуанидиния может привести к серьезным химическим ожогам при контакте. Наденьте перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Используйте только при достаточной вентиляции или надевайте соответствующий респиратор. Соблюдайте правила безопасности в учреждении. Утилизируйте использованную лабораторную посуду в соответствии с руководящими принципами учреждения.
  7. Инкубировать в течение 5 минут при R.T. на шейкере, а затем хранить образцы при -80 °C до 3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная остановка: Эксперимент можно безопасно остановить здесь на срок до 3 дней.

16. Очистка РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой и РНКазой. Время: 2 часа

  1. Добавьте 80 мкл хлороформа в образец с этапа 15.7 и энергично встряхните пробирку вручную в течение 15 с.
  2. Инкубируют в течение 2-15 мин при комнатной температуре и центрифугируют образец при 12 000 × г в течение 15 мин при 4 °C.
  3. Соберите и перенесите водную фазу образца (~200 мкл) в новую пробирку объемом 1,5 мл.
  4. Добавьте 600 мкл / пробирку тиоцианата-фенола-хлороформа гуанидиния и перенесите образец в пробирку объемом 1,5 мл.
  5. Добавьте 180 мкл / тюбик хлороформа и энергично встряхивайте пробирку вручную в течение 15 с.
  6. Центрифугируют образец при 12 000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
  7. Соберите и перенесите водную фазу образца (~ 450 мкл) в пробирку объемом 1,5 мл.
  8. Добавьте 60 мкл / тюбик линейного акриламида (5 мкг / мкл) и добавьте 400 мкл / тюбик 100% изопропанола в водную фазу.
  9. Инкубируют пробирку при комнатной температуре в течение 10 мин и центрифугируют при 12 000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
  10. Удалите надосадочную жидкость аккуратно.
  11. Промойте гранулы РНК 3 раза 200 мкл 75% этанола (вода, не содержащая EtOH/РНКазы), удалите надосадочную жидкость и высушите гранулы РНК на воздухе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте РНК полностью высохнуть, потому что гранулы могут потерять растворимость.
  12. Ресуспендировать гранулу РНК в 20 мкл воды, не содержащей РНКазы, содержащей ингибитор РНКазы (1 мкл / 20 мкл), и растворить гранулу пипеткой.
  13. Измерьте коэффициент поглощения на длине волны 260 нм.

17. Обратная транскрипция

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 1 час

  1. Добавьте 7 мкл / тюбик праймера обратной транскрипции + смесь dNTP (см. Таблицу 1 и Таблицу 3) и поместите пробирки на термоциклер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет 27 мкл. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C.
  2. Нагрейте до 65 ° C в течение 5 минут и поместите трубки на лед не менее чем на 1 минуту.
  3. Добавьте 14 мкл / тюбик основной смеси обратной транскриптазы (см. Таблицу 1) и перемешайте пипеткой.
  4. Поместите трубки на термоциклер и инкубируйте их при 55 ° C в течение 10 минут, а затем при 80 ° C в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет 60 мкл. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C.

18. Синтез второй нити

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 2,5 часа

  1. Добавьте 40 мкл / пробирку сверхчистой воды и разделите раствор 100 мкл на две пробирки для ПЦР по 0,2 мл (50 мкл / пробирка).
  2. Добавьте 60 мкл на пробирку смеси Second Strand Synthesis (см. Таблицу 1), поместите пробирки на термоциклер и запустите следующую программу: i) 95 °C в течение 5 мин, ii) 95 °C в течение 30 с, iii) 60 °C в течение 30 с, iv) 72 °C в течение 30 с, v) повторить шаги ii-iv 20 раз и vi) держать при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пробирки составляет 0,2 мл. Объем раствора составляет 110 мкл. Температура крышки термоциклера составляет 105 °C.
  3. Добавьте 4,4 мкл на тюбик 0,5 М ЭДТА (конечные 20 мМ) и храните при температуре -80 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная точка остановки: Эксперимент можно безопасно остановить здесь на срок до нескольких дней.
  4. Очистите ДНК фенол-хлороформной очисткой и осаждением полиэтиленгликолем (описано на шаге 14).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная точка остановки: Эксперимент можно безопасно остановить здесь как минимум на одну неделю.

19. Переваривание ферментов рестрикции и выбор размера

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется под чистым колпаком, чтобы избежать загрязнения ДНКазой. Время: 3 часа (шаги 19.1-19.7)

  1. Измерьте концентрацию ДНК очищенной ДНК (начиная с шага 18.4) путем измерения абсорбции при 260 нм.
  2. Перенесите 6 мкг ДНК в пробирку для ПЦР, добавьте 30 мкл 10-кратного буфера для разложения и отрегулируйте объем до 294 мкл сверхчистой водой.
  3. Добавьте 6 мкл фермента рестрикции BciVI и инкубируйте при 37 ° C в течение 1 часа.
  4. Выполните осаждение EtOH с линейным полиакриламидом.
    1. Добавьте 60 мкл / тюбик 3 М ацетата натрия (pH 5,2), а затем добавьте 40 мкл / тюбик линейного акриламида (5 мг / мл, см. Таблицу материалов).
    2. Добавьте 400 мкл / тюбик EtOH и выдерживайте в течение ночи при -20 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная остановка: Эксперимент можно безопасно остановить здесь на один день.
    3. Центрифугу 12 000 × г в течение 10 мин при 4 °С и удалить надосадочную жидкость.
    4. Дважды промойте гранулы с 80% EtOH и высушите гранулы.
    5. Растворите гранулу 20 мкл буфера 1xTE и добавьте 4 мкл / тюбик свежего буфера 6x Gel Loading.
  5. Загрузите образец в 5% агарозный гель / 0,5-кратный буфер TAE и проведите электрофорез (50 В в течение 40 мин).
  6. Разрежьте и соберите гель с содержанием более 50.н. (см. рис. 6) и извлеките ДНК с помощью набора для экстракции геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная точка остановки: Эксперимент можно безопасно остановить здесь как минимум на одну неделю.
  7. Создайте библиотеку секвенирования, используя набор для подготовки библиотеки ДНК (см. Таблицу материалов)16,17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одиночные ячейки K562 были сгенерированы с использованием протокола, описанного на шаге 8 (см. рис. 5). Отдельные ячейки были встроены во внешний слой полиакриламидной гранулы. Клеточную ДНК окрашивали и визуализировали с помощью интеркаляторного красителя для окрашивания ДНК.

figure-results-1
Рисунок 5: Сгенерированные многора...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается пошаговый протокол для недавно зарегистрированного одноклеточного мультиэпигеномного анализа с использованием многоразовых одиночных клеток7. В последующих параграфах мы обсудим критические моменты, подчеркнув потенциальные ограничения в протоколе.

Одним из критических моментов на протяжении всего протокола (из шагов 7.2-13) является предотвращение загрязнения ДНКазой. Одна клетка имеет только две копии геномной ДНК. Поэтому повреждение геномн...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Доктора Онуки и Тосато являются соавторами патента под названием «Способы получения многоразовой одиночной клетки и методы анализа эпигенома, транскриптома и генома одной клетки» (EP3619307 и US20200102604). Заявка на патент была подана частично на основании предварительных результатов, связанных с технологией, описанной в настоящей рукописи. Изобретение или изобретения, описанные и заявленные в этой патентной заявке, были сделаны, когда изобретатели были штатными сотрудниками правительства США. Таким образом, в соответствии с 45 Сводом федеральных правил, часть 7, все права, титулы и интересы в отношении этой заявки на патент были или должны быть переданы по закону правительству США. Правительство США передает часть получаемых им роялти своим сотрудникам-изобретателям в соответствии с 15 Кодексом США § 3710c.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим докторов Дэвида Санчеса-Мартина и Кристофера Б. Бака за комментарии на этапе концептуализации проекта. Мы также благодарим Genomics Core, Центр исследований рака, Национальный институт рака, Национальные институты здравоохранения за помощь в предварительных экспериментах и Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH за советы по вычислительному анализу. Мы благодарим г-жу Анну Ворд за помощь в оптимизации ДНК-полимераз, используемых в методе. В этой работе использовались вычислительные ресурсы кластера NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). Этот проект поддерживается Очной программой Центра исследований рака, Национальным институтом рака, Национальными институтами здравоохранения, премией директора NCI за инновации (#397172) и федеральными средствами Национального института рака по контракту No HHSN261200800001E. Мы благодарим докторов Тома Мистели, Кэрол Тиле, Дугласа Р. Лоуи и всех сотрудников Лаборатории клеточной онкологии за продуктивные комментарии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x CutSmart bufferNew England BioLabsB600410x Digestion buffer
200 proof ethanolWarner-Graham Company200 proofEthanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Моноклональное антитело [HMC/4D9]EpigentekA-1018-100Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide StainLogos BiosystemsF23001Счетчик клеток
Раствор акриламида, 40% в H2O, для молекулярной биологииMilliporeSigma01697-500ML40% раствор акриламида
Универсальный флуоресцентный микроскоп BZ-X710KeyenceBZ-X710Сканирующий микроскоп
Amicon Ultra-0,5 Центробежный фильтрующий блокMilliporeSigmaUFC510024Ультрафильтрационная кассета
персульфат аммония для молекулярной биологииMilliporeSigmaA3678-100GПорошок персульфата аммония
Безводный DMFVector laboratoriesS-4001-005Безводный N,N-диметилформамид (DMF)
Анти-РНК-полимераза II CTD повтор YSPTSPS (фосфо S5) антитело [4H8]Abcamab5408Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (фосфо T1457) антителоAbcamab60950Anti-Med1
BciVINew England BioLabsR0596LBciVI
Bovi Bovi Borum Albumin раствор, 20 мг/мл в H2O, с низкой бионагрузкой, без протеазы, для молекулярной биологииMilliporeSigmaB8667-5ML20% BSA (Таблица 7)
Bst ДНК-полимераза, большой фрагментNew England BioLabsM0275LBst ДНК-полимераза
BT10 Series 10 µ l Барьерный наконечникNEPTUNEBT10P10 Наконечник с низким удержанием
CellCelectorAutomated Lab SolutionsN/AАвтоматизированный робот для отбора одиночных клеток
CellCelector 4 nl нанолуночные планшеты для клонирования одиночных клеток, планшет S200-100 100K, 24 лунки, ULAAutomated Lab SolutionsCC00794 nL нанолуночный планшет
ChloroformMilliporeSigmaChloroform
Corning Costar 96-Well, обработанная клеточными культурами, микропланшет с плоским дномCorning359696-луночные планшеты с плоским дном Deep
Vent (exo-) ДНК-полимеразаNew England BioLabsM0259LExo- ДНК-полимераза
DNA LoBind Tubes, 0,5 млEppendorf301080350,5 мл ДНК низкосвязывающаяся трубка
DNA Oligo, 1-й случайный праймерIntegrated DNA TechnologiesN/ А, см. Таблицу 31-й случайный праймер
ДНК Олиго, 2-й случайный праймер Cell#01Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 32-й случайный праймер
DNA Oligo, 2-й случайный праймер Cell#02Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 32-й случайный праймер
DNA Oligo, 2-й случайный праймер Cell#03Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 32-й случайный праймер
DNA Oligo, 2-й случайный праймер Cell#04Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 32-й случайный праймер
DNA Oligo, 2-й случайный праймер Cell#05Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 32-й случайный праймер
DNA Oligo, 2-й случайный праймер Cell#06Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 32-й случайный праймер
DNA Oligo, 2-й случайный праймер Cell#07Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 32-й случайный праймер
DNA Oligo, 2-й случайный праймер Cell#08Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 32-й случайный праймер
DNA Oligo, 2-й случайный праймер Cell#09Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 32-й случайный праймер
DNA Oligo, 2-й случайный праймер Cell#10Integrated DNA TechnologiesН/Д, см. Таблицу 32-й случайный праймер
DNA Oligo, 2-й случайный праймер Cell#11Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 32-й случайный праймер
DNA Oligo, 2-й случайный праймер Cell#12Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 32-й случайный праймер
DNA Oligo, 2-й синтез праймераIntegrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 32-й синтез праймера
ДНК Олиго, Адаптер лигированияIntegrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 3Адаптер лигирования
DNA Oligo, Праймер обратной транскрипцииIntegrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 3Праймер обратной транскрипции
DNase I (без РНКазы)New England BioLabsM0303LDNase I (без РНКазы, 4 U).
Реакционный буфер ДНКазы IEngland BioLabsB0303S10x Буфер DNase I (NEB)
dNTP Mix (10 мМ каждый)Thermo FisherR019210 mM dNTPs
Фетальная бычья сыворотка, происхождение из США, термоинактивированныйMilliporeSigmaF4135-500MLФетальная бычья сыворотка
HiScribe T7 High Yield РНК Набор для синтеза РНКNew England BioLabsE2040SМастер-микс для экстракорпоральной транскрипции
Гистон H3K27ac антителоАктивный мотив39133Anti-H3K27ac
Гистон H3K27me3 антителоАктивный мотив39155Anti-H3K27me3
IgG из сыворотки кроликаMillipore SigmaI5006-10MGControl IgG
Оксид железа (II,III) магнитный нанопорошок, 30 нм средний размер части (TEM), NHS эфир функционализированныйMilliporeSigma747467-1GNHS эфир функционализированный 30 нм порошок оксида железа
K-562American Type Culture Collection (ATCC)CCL-243клетки
Линейный акриламид (5 мг/мл)Thermo FisherAM9520Линейный акриламид
LUNA-FL Двойной флуоресцентный счетчик клетокLogos BiosystemsL20001Счетчик клеток
LUNA Cell Counting Slides, 50 слайдовLogos BiosystemsL12001Клеточный счетчик
Минеральное масло, Биореагент, для молекулярной биологии, легкое маслоMilliporeSigmaM5904-500MLМинеральное масло
N,N,N′,N′-Тетраметилэтилендиамин для молекулярной биологииMilliporeSigmaT7024-100MLN,N,N′,N′-Тетраметилэтилендиамин
NaCl (5M), РНКаза без РНКазыThermo FisherAM9760G5M NaCl
NanoDrop LiteThermo Fisher2516  Микрообъемный спектрофотометр
NEST 2 мл 96-луночный глубокий луночный планшет, V дноOpentronsN/A2 мл глубокий луночный 96-луночный планшет
Неюбковый 96-луночный ПЦР-планшетGenesee Scientific27-40596-луночный ПЦР-планшет
NuSive GTG AgaroseLonza50081Agarose
OmniPur Акриламид: бис-акриламид 19:1, 40% растворMilliporeSigma1300-500ML40%Акриламид/бис-акриламид
OT-2 лабораторный роботOpentronsOT2Автоматизированный робот для работы с жидкостями
Параформальдегид, класс EM, очищенный, 20% водный раствор Электроннаямикроскопия Науки1571320% Парармальдегид
PBS (10x), pH 7,4Thermo Fisher7001104410x PBS
PIPETMAN Classic P1000GILSONF123602A P1000 пипетка
Пробирки с белком LoBind, 1,5 млEppendorf9250000901,5 мл пробирки с низким связыванием белка
QIAgen Набор для экстракции геляQiagen28706A P1000 пипетка
Quant-iT PicoGreen dsDNA AssayThermo FisherP11495  dsDNA специфический интеркаляционный краситель
Набор для быстрого лигированияNew England BioLabsM2200LT4 DNA ligase (NEB
)RNaseOUT Рекомбинантный ингибитор рибонуклеазыThermo Fisher10777019РНКаза ингибитора
S-4FB Crosslinker (растворимый в DMF)Векторные лабораторииS-1004-105Сукцинимидил 4-формилбензоат (S-4FB)
S-HyNicВектор лабораторииS-1002-105Сукцинимидил 6-гидразинокотинат ацетон гидразон (S-HyNic)
Ацетат натрия, 3 М, pH 5,2, класс молекулярной биологииMilliporeSigma567422-100ML3M ацетат натрия (pH 5,2)
Бикарбонат натрия, 1М буферный раствор, pH 8,5Alfa AesarJ604081M буфер бикарбоната натрия, pH 8,5
Двухосновной фосфат натрия для молекулярной биологииMilliporeSigmaS3264-250GNa2HPO4
Одноосновной фосфат натрия для молекулярной биологииMilliporeSigmaS3139-250G2PO4
SuperScript IV обратная транскриптазаThermo Fisher18090050обратная транскриптаза
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10 000x концентрат в ДМСО)Thermo FisherS11494Интеркаляционный краситель для ДНК
T4 Реакционный буфер ДНК-лигазыEngland BioLabsB0202S10x T4 ДНК-лигаза реакционный буфер
ThermoPol Реакционный буферNew England BioLabsB9004S10x TPM-T буфер (Tris-HCl/хлорид поттазия/сульфат магния/Triton X-100)
Реактив TRIzol LSThermo Fisher10296-028Экстракция тиоцианата-фенол-хлороформа гуанидиния
Набор для подготовки библиотеки ДНК TruSeq NanoIllumina20015965Набор для подготовки библиотеки ДНК (см. также инструкцию производителя)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 3Аминомодифицированный ДНК-зонд для антител
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 3Аминомодифицированный ДНК-зонд для антител
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 3Аминомодифицированный ДНК-зонд для антитела
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 3Аминомодифицированный ДНК-зонд для антитела
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 3Аминомодифицированный ДНК-зонд для антител
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001Integrated DNA TechnologiesN/A, см. Таблицу 3Аминомодифицированный ДНК-зонд для контроля IgG
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher155750200,5M EDTA, pH 8,0
UltraPure DNase/RNase-Free Diстиллированная водаThermo Fisher10977023сверхчистой воде
Zeba Splin Desoling Columns, 7K MWCO, 0,5 млThermo Fisher89882Колонна обессоливания
New New

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781(2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., et al. Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Reusable Single CellIterative Epigenomic AnalysisSingle Cell EpigenomeProximity LigationPolyacrylamide EmbeddingAntibody DNA ProbeHistone ModificationsMultiple Displacement AmplificationCapillary ElectrophoresisMultiomics Analysis

Related Articles