Количественная оценка гистонов на глобальном уровне посттрансляционных модификаций в 3D-модели клеточной культуры печеночной ткани

Summary

Этот протокол описывает, как трехмерная система клеточных культур может быть использована для моделирования, обработки и анализа модификаций хроматина в почти физиологическом состоянии.

Abstract

Плоские культуры клеток млекопитающих являются широко используемым подходом in vitro для понимания физиологии клеток, но эта система ограничена в моделировании твердых тканей из-за неестественно быстрой репликации клеток. Это особенно сложно при моделировании зрелого хроматина, поскольку быстро реплицирующиеся клетки часто участвуют в репликации ДНК и имеют гетерогенную полиплоидную популяцию. Ниже представлен рабочий процесс для моделирования, обработки и анализа модификаций покоящегося хроматина с использованием трехмерной (3D) системы клеточных культур. Используя этот протокол, клеточные линии гепатоцеллюлярной карциномы выращиваются в виде воспроизводимых 3D-сфероидов в инкубаторе, обеспечивающих активную диффузию питательных веществ и низкие силы сдвига. Лечение бутиратом натрия и сукцинатом натрия индуцировало увеличение ацетилирования гистонов и сукцинилирования соответственно. Повышение уровней ацетилирования гистонов и сукцинилирования связано с более открытым состоянием хроматина. Сфероиды затем собираются для выделения клеточных ядер, из которых извлекаются гистоновые белки для анализа их посттрансляционных модификаций. Анализ гистонов выполняется с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией, за которой следует собственный вычислительный конвейер. Наконец, приведены примеры представления данных для исследования частоты и возникновения комбинаторных гистоновых меток.

Introduction

С конца 19^века системы клеточных культур использовались в качестве модели для изучения роста и развития клеток вне человеческого организма ^1,2. Их использование также было расширено для изучения того, как ткани и органы функционируют как в здоровом, так и в больном контексте ^1,3. Суспензионные клетки (например, клетки крови) растут в чашках или колбах Петри плавно и взаимозаменяемо, поскольку они не собираются в трехмерные (3D) структуры in vivo. Клетки, полученные из твердых органов, могут расти как в двумерных (2D), так и в 3D-сис....

Protocol

1. Подготовка буферов и реагентов

1. Среда роста клеток (для клеток HepG2 / C3A): Добавьте фетальную бычью сыворотку (FBS) (10% v / v), заменимые аминокислоты (1% v / v), добавку L-глутамина (1% v / v) и пенициллин / стрептомицин (0,5% v / v) в модифицированную среду Dulbecco Eagle 's Medium (DMEM, содержащую 4,5 г / л глюкозы). Питательные среды хранят при 4 °C в течение максимум 2 недель.
2. 200 мМ раствор бутирата натрия (NaBut): Для приготовления 10 мл повторно суспендируют 220,18 мг NaBut в 10 мл ddH₂O. Хранить 1 мл аликвоты при -20 °C. Перед обработкой клеток фильтруют раствор с помощью шприцевого фильтра 0,45 мм и доба....

Results

В этом протоколе сфероиды HepG2/C3A обрабатывали 20 мМ NaBut и 10 мМ NaSuc, оба из которых влияли на глобальные уровни гистоновых ПТМ (рисунок 3А). Затем гистоновые ПТМ были идентифицированы и количественно определены на уровне одного остатка с помощью сбора MS/MS (рисунок 3B).

Когда образцы запускаются в репликах, статистический анализ может быть выполнен для оценки обогащения изменения складки PTM между образцами, а также в.......

Discussion

Анализ гистоновых ПТМ принципиально отличается от типичного конвейера анализа протеомики. Большинство гистоновых ПТМ по-прежнему имеют загадочные биологические функции; в результате аннотации, такие как Генная онтология или базы данных путей, недоступны. Существует несколько ресурсов, которые связывают модификации гистонов с ферментом, ответственным за их катализ, или белками, содержащими домены, которые связывают эти ПТМ (например, HISTome³⁶). Кроме того, можно спекулировать на общем состоянии хр.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% раствор трипсина-ЭДТА	Gibco	25300054
0,5-20 L наконечники для пипеток	BRAND	13-889-172 (Fisher Scientific)
1,5 мл микроцентрифужные пробирки	Bio-Rad	2239480
10 &; L многоканальный пипетка	BRAND	BR7059000 (Millipore Sigma)
Шприц объемом 10 мл	Henke Sass Wolf	14-817-31 (Fisher Scientific)	Наконечник замка Luer, градуированный до 12 мл
10, 20, 200 и 1000 &микро; L одноканальные пипетки	Eppendorf	14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 &микро; L наконечники для пипеток	Rainin	30389164
18 G игла для шприца	Air-Tite	14-817-100 (Fisher Scientific)	3 дюйма длина, 0,05 дюйма диаметр
200 &; L многоканальный дозатор	Corning	4082
2-200 µ L наконечники для пипеток	BRAND	Z740118 (Millipore Sigma)
24-луночный микропланшет со сверхнизким уровнем крепления	Corning	07-200-602
75 см<суп>2  U-образная колба для клеточных культур	Corning	461464U	Необработанная, с вентиляционным колпачком
96-луночная окаймленная пластина	Axygen	PCR-96-FS-C (Corning)
Ацетон	Fisher Scientific	A949-1	Ацетон следует использовать холодом
Бикарбонат аммония (NH4HCO3)	Sigma-Aldrich	A6141-25G Гидроксид
аммония раствор	Fisher Scientific	AC423300250
Вода для клеточных культур	Corning	25-055-CV
ClinoReactor	CelVivo	10004-12	Биореактор для 3D клеточной культуры
ClinoStar	CelVivo	N/A	Clinostat CO2 инкубатор для 3D культуры клеток
управления	CelVivo	N/A	Таблетка для ClinoStar
настройки Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	17-205-CV	1X раствор с 4,5 г/л глюкозы и пирувата натрия, без L-глутамина и фенола красный
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Corning	35-010-CV
Муравьиная кислота	Thermo Scientific	28905
Вытяжной шкаф	Mott	N/A	Модель 7121000
Стекло Пастеровская пипетка	Fisher Scientific	13-678-8B	9", ватная пробка, боросиликатное стекло, нестерильная
добавка Glutagro	Corning	25-015-CI	200 мМ L-ананил-L-глутамин
Hank' s Сбалансированный солевой раствор (HBSS)	Corning	21-022-CV	1X раствор без кальция, магния и фенола красный
ацетонитрил класса ВЭЖХ	Fisher Scientific	A955-4
Вода класса ВЭЖХ	Fisher Scientific	W6-1
Соляная кислота (HCl)	Fisher Scientific	A481-212
Ice	Н/Д	/Д
МЕМ заменимые аминокислоты	Corning	25-025-CI	100X раствор
Oasis HLB смола	Воды	186007549	гидрофильно-липофильная (HLB) смола с 30&микро; m размер частиц
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid масс-спектрометр	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	Масс-спектрометр высокого разрешения
Oro-Flex I полипропиленовая фильтрующая пластина	Orochem	OF1100	96-луночная полипропиленовая фильтрующая пластина с 10 и микро; M PE фритта
Пенициллин-стрептомицин	Corning	30-002-CI	100X раствор
pH-бумага	Hydrion	Z111848 (Sigma-Aldrich)	0-13 pH-тестовая бумага
Пистолет-пипетка	Eppendorf	Z666467 (Millipore Sigma)
Полимикрокапилляр	Molex	50-110-7740 (Fisher Scientific)	Гибкая капиллярная трубка из плавленого диоксида кремния с полимидовым покрытием, 75 & микро; M ID x 363 & микро; M OD
Полистирол 10 мл серологические пипетки, стерильные	Fisher Scientific	1367549
Пропионовый ангидрид	Sigma-Aldrich	240311-50G
Охлаждаемая центрифуга	Thermo Scientific	75-217-420
Reprosil-Pur смола	MSWIL	R13. AQ.0003	120 Å размер пор, фаза C18-AQ, 3 & микро; Размер шарика
M Rotator	Clay Adams	25477 (American Laboratory Trading)	Nutator Mixer 1105
Секвенирование модифицированного трипсина	Promega	V5111
Бутират натрия	Thermo Scientific	A11079
Сукцинат натрия двухосновной	Sigma-Aldrich	14160-100G
SpeedVac вакуумный концентратор (микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл)	Savant	20249 (American Laboratory Trading)
Вакуумный концентратор SpeedVac (96-луночный)	Thermo Scientific	15308325	Savant SPD1010
Стерильный колпак	Thermo Scientific	1375	Класс II, тип A2
Серная кислота (H2SO4)	Fisher Scientific	02-004-375	Реагент
ACS Baker AnalyzeТканевая культура, обработанная 100 мм x 20 мм, чашка	Fisher Scientific	08-772-23
Трихлоруксусная кислота (ТСА)	Thermo Scientific	AC421451000	Ресуспендирование 100% массы в воде класса ВЭЖХ
Трифторуксусная кислота (ТФК)	Fisher Scientific	PI28904	класс секвенирования
Вакуумный коллектор 96-луночный	миллипор	MAVM0960R
Vortex	Sigma-Aldrich	Z258415
Водяная баня	Fisher Scientific	FSGPD10
Наконечники для пипеток широкого прохода 1000 &микро; L	Axygen	14-222-703 (Fisher Scientific)
Наконечники для пипеток широкого диаметра 200 &; L	Axygen	14-222-730 (Fisher Scientific)