Методическая статья

Цифровое пространственное профилирование для характеристики микросреды при диффузно проникающей глиоме взрослого типа

DOI:

10.3791/63620

⸱

13 сентября 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 3Department of Neurosurgery, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 4Dartmouth Cancer Center, Dartmouth-Hitchcock Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протеомная дисрегуляция играет важную роль в распространении диффузно инфильтрирующих глиом, но несколько соответствующих белков остаются неидентифицированными. Цифровая пространственная обработка (DSP) предлагает эффективный, высокопроизводительный подход для характеристики дифференциальной экспрессии белков-кандидатов, которые могут способствовать инвазии и миграции инфильтративных глиом.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Диффузно инфильтрирующие глиомы связаны с высокой заболеваемостью и смертностью из-за инфильтративного характера распространения опухоли. Они представляют собой морфологически сложные опухоли с высокой степенью протеомной изменчивости как в самой опухоли, так и в ее гетерогенном микроокружении. Злокачественный потенциал этих опухолей усиливается дисрегуляцией белков, участвующих в нескольких ключевых путях, включая процессы, которые поддерживают клеточную стабильность и сохраняют структурную целостность микросреды. Хотя было проведено множество объемных и одноклеточных анализов глиомы, существует относительная нехватка пространственной стратификации этих протеомных данных. Понимание различий в пространственном распределении опухолевых факторов и популяций иммунных клеток между внутренней опухолью, инвазивным краем и микроокружением дает ценную информацию о механизмах, лежащих в основе пролиферации и распространения опухоли. Цифровое пространственное профилирование (DSP) представляет собой мощную технологию, которая может стать основой для этих важных многослойных анализов.

DSP - это метод, который эффективно количественно определяет экспрессию белка в заданных пользователем пространственных областях в образце ткани. DSP идеально подходит для изучения дифференциальной экспрессии нескольких белков внутри и между регионами различия, обеспечивая несколько уровней количественного и качественного анализа. Протокол DSP является систематическим и удобным для пользователя, что позволяет проводить индивидуальный пространственный анализ протеомных данных. В этом эксперименте тканевые микрочипы строятся из архивных биопсий ядра глиобластомы. Затем выбирается панель антител, нацеленных на интересующие белки в образце. Антитела, которые предварительно конъюгируются с Олигонуклеотидами УФ-фоторасщепления ДНК, затем инкубируются с образцом ткани в течение ночи. При флуоресцентной микроскопии визуализации антител с образцами определяются области интереса (ROI), в пределах которых можно количественно оценить экспрессию белка. Затем ультрафиолетовый свет направляется на каждый ROI, расщепляя ДНК олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды микроаспирируются и подсчитываются в пределах каждого ROI, количественно оценивая соответствующий белок на пространственной основе.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Диффузно инфильтрирующие глиомы являются наиболее распространенным типом злокачественной опухоли головного мозга у взрослых и неизменно летальны. Склонность клеток глиомы к обширной миграции в мозге является серьезной терапевтической проблемой. Механизм, с помощью которого они распространяются, включает в себя направленную миграцию и неконтролируемое вторжение. Было показано, что инвазивные клетки глиомы демонстрируют тропизм и миграцию вдоль трактов белого вещества1, причем недавние исследования предполагают демиелинизацию этих путей в качестве активного протуморигенного признака2. Инвазия опосредована эпителиально-мезенхимальным переходом, при котором клетки глиомы приобретают мезенхимальные свойства за счет снижения экспрессии генов, кодирующих белки внеклеточного матрикса и молекул клеточной адгезии, усиливая миграцию и облегчая распространение через микроокружение опухоли 3,4,5.

На молекулярном уровне было продемонстрировано нарушение работы нескольких белков, которые придают клеточную стабильность и взаимодействие с иммуногенными компонентами6. Инфильтративные глиомы, как известно, подвергаются подавлению белков с антиапоптотическими (например, PTEN) свойствами7. Они также сверхэкспрессируют белки, которые способствуют уклонению иммунного ответа хозяина (например, PD1 / PDL1)8. Дисрегуляция этих сложных путей усиливает опухолегенность и повышает злокачественный потенциал.

В образцах инвазивной глиомы цель состояла в том, чтобы оценить дифференциальную экспрессию белков, имеющих ключевое значение для роста, выживания и пролиферации клеток, а также для структурной целостности микросреды между инвазивными и неинвазивными компонентами. Кроме того, мы стремились изучить дифференциальную регуляцию белков с активной иммуногенной ролью, предлагая понимание механизма, с помощью которого скомпрометированная иммунная защита хозяина может усиливать пролиферативный и инвазивный потенциал глиом. Это особенно актуально, учитывая недавнюю широту исследований, демонстрирующих, как иммунные маркеры и драйверы дисрегуляции злокачественных новообразований могут служить мишенями иммунотерапии. Определение жизнеспособных терапевтических мишеней среди многих белков, участвующих в иммунонадзоре и реактивности, требует высокочувствительного и комплексного подхода.

Учитывая широкий спектр белков-кандидатов, которые могут быть изучены, мы искали метод, похожий на иммуногистохимию, но с повышенной эффективностью обработки данных. В области биологии рака DSP стала мощной технологией с важными преимуществами по сравнению с альтернативными инструментами для протеомного анализа и количественной оценки. Отличительной чертой DSP является его высокопроизводительная мультиплексирующая способность, позволяющая одновременно изучать несколько различных белков в образце, отмечая важное отличие от стандартных, но низкоплексных технологий, таких как иммуногистохимия (IHC)9,10. Мультиплексная особенность DSP не ставит под угрозу его точность как количественного и аналитического инструмента, как показали исследования, сравнивающие DSP с IHC. При использовании для протеомной количественной оценки образцов немелкоклеточного рака легкого, например, было показано, что DSP имеет результаты, аналогичные IHC11. Кроме того, DSP предлагает настраиваемую региональную спецификацию, в которой пользователи могут вручную определять области, в которых выполняется протеомный анализ. Это представляет собой преимущество перед методами мультиплексирования всего сечения10,12. Таким образом, в одном раунде обработки DSP предлагает несколько уровней анализа, исследуя несколько белковых мишеней в нескольких областях, представляющих интерес.

DSP имеет применение в нескольких различных патологических условиях. DSP особенно выгоден в онкологическом анализе, так как пространственная изменчивость может коррелировать с клеточной трансформацией и дифференциальной экспрессией белка. Например, DSP был использован для сравнения протеомного профиля рака молочной железы с соседним микроокружением опухоли. Это имеет важные последствия для понимания естественной истории этой опухоли и ее прогрессирования, а также потенциального ответа на лечение13. Дополнительные контексты, иллюстрирующие универсальность DSP, включают пространственную количественную оценку разнообразия белков при раке предстательной железы14, связь экспрессии маркера иммунных клеток с прогрессированием заболевания при плоскоклеточном раке головы и шеи15 и демонстрацию эпителиально-мезенхимального градиента экспрессии белка, отличающего метастатический рак яичников от первичного чистоклеточного рака яичников16 . Реализуя DSP, мы характеризуем пространственную топографию белков, которые могут влиять на опухолевыйгенез и инвазию глиом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, изложенный ниже, соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований человека Дартмута-Хичкока. Информированное согласие было получено от пациентов, чьи образцы тканей были включены в это исследование. В разделе Таблица материалов приведены подробные сведения обо всех материалах, реагентах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе.

1. Подготовка слайдов17

  1. Извлеките или подготовьте закрепленную формалином, парафинированную ткань из диффузно инфильтрирующих глиом взрослого типа человека.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте использовались парафиновые встроенные блоки биопсии трех пациентов с глиобластомой.
  2. Создайте блок тканевого микрочипа (TMA). Возьмите несколько сердечников по 2 мм из каждой биопсии и поместите их в один блок TMA (рисунок 1, сверху). Вырежьте секции из блока TMA на 4 мкм и установите их на стеклянные слайды. Поместите каждый слайд в прокладку держателя слайда. Инкубируйте горку при 60 °C в течение 30 мин.

2. Полуавтоматическая подготовка системы IHC и настройка программного обеспечения (для загрузки и запуска слайдов)17

  1. Установите реагенты. Нажмите на кнопку Настройка реагента . Нажмите кнопку Добавить на вкладке Настройка .
    1. Зарегистрируйте буфер стирки, введя его имя в поле Имя . Выберите Вспомогательный в поле Тип . Нажмите кнопку Сохранить.
    2. Зарегистрируйте блокирующее решение, повторив те же шаги, что и выше (измененные в зависимости от обстоятельств, например, в поле «Имя »), но выбрав «Первичное антитело » в поле «Тип ». Выберите нужные протоколы в раскрывающихся списках Протокол окрашивания по умолчанию и Протокол HIER по умолчанию. При необходимости выберите параметр «Протокол ферментов по умолчанию » (это поле было оставлено пустым в текущем протоколе). Нажмите кнопку Сохранить.
  2. Зарегистрируйте систему обнаружения, состоящую из лотка для контейнеров с реагентами со штрих-кодом. Отсканируйте штрих-код.
    1. Начните ввод сведений о реагентной системе в окне Добавить исследовательскую реагентную систему . Введите имя системы обнаружения.
    2. Введите дату истечения срока действия. Выделите первую строку диаграммы Реагенты и отсканируйте штрих-код нового контейнера с реагентами объемом 30 мл, после чего штрих-код заполнит строку 1.
    3. Поместите контейнер в положение 1 системы обнаружения. Выберите название буфера промывки в выпадающем списке столбца Реагент и нажмите кнопку Добавить. Повторите эти шаги, чтобы добавить дополнительные реагенты в последующие строки, включая блокирующий раствор.
  3. Настройте белковый протокол для IHC. Нажмите Настройка протокола. Выделите строку, соответствующую нужному протоколу, и нажмите кнопку Копировать. Введите Имя и заполните все другие соответствующие поля в окне Изменение свойств протокола .
    1. Установите флажок Показать шаги стирки. Убедитесь, что поля Inc (min) и DispenseType верны для каждого реагента (10 мин для блокирующего раствора, 0 мин для буфера промывки и 150 мкл для каждого DispenseType). Нажмите кнопку Сохранить.
  4. Подготовьте исследование. Заполните контейнер в позиции 1 буфером для стирки. Заполнить 150 мкл на слайд и 5 мл мертвого объема; оставьте крышку открытой. Повторите эти шаги для контейнера в позиции 2, который должен быть заполнен блокирующим решением. Этот контейнер должен иметь 150 мкл на слайд и 350 мкл мертвого объема.
    1. Загрузите лоток для контейнеров с реагентами на машину. Разрешите системе выполнять меры по распознаванию контейнеров и подтверждению томов. Нажмите на настройка слайдов | Добавить исследование. Введите идентификатор исследования и название исследования и выберите 150 мкл в разделе Объем дозирования | требуемый протокол в раскрывающемся списке Протокол подготовки (предлагается Bake and Dewax ). Выделите исследование и нажмите « Добавить слайд».
    2. Выберите исследуемую ткань по типу ткани | 150 мкл при объеме дозирования | Одиночный и рутинный из раскрывающихся списков Режим окрашивания. Выберите процесс (IHC для текущего исследования) | Имя решения блокировки в раскрывающемся списке поля Маркер | Протокол IHC DSP в поле Окрашивание вкладки Протоколы | * Выпечка и депарация для приготовления | * HIER 20 мин с ER1 для HIER. Оставьте поле Enzyme пустым.
    3. Повторите этот процесс для каждого слайда. Нажмите «Закрыть» после завершения, а затем нажмите « Печать наклеек». Отметьте все наклейки на слайдах, которые еще не напечатаны для текущего исследования , и нажмите «Печать». Прикрепите метки к верхней части слайдов.
  5. Загружайте и запускайте слайды. Загрузите слайды в лоток для слайдов, убедившись, что образец и этикетка обращены вверх. Поместите плитки обложки поверх слайдов, убедившись, что слайды ориентированы с вкладками внизу. Загрузите лотки для слайдов на инструмент.
    1. Нажмите светодиодную кнопку, чтобы опустить лоток и позволить инструменту начать сканирование и распознавание слайдов. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать эксперимент.
  6. Завершите эксперимент. Нажмите светодиодную кнопку, когда она мигает зеленым цветом, указывая на завершение запуска. Снимите лоток с инструмента и осторожно поднимите крышку плитки с каждого слайда. Поместите слайды в 1x фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), удалите избыточный буфер и очертите каждый участок ткани гидрофобной ручкой, чтобы создать гидрофобный барьер.

3. Инкубация антител и окрашивание ядер17

  1. Выберите панель антител для локализации интересующих антигенов (см. Таблицу 1 для антител, используемых в этом эксперименте).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое антитело уже конъюгировано с олигонуклеотидом ДНК с УФ-фоторасщепляющимся сегментом (PC-oligo), который однозначно идентифицирует его (индексирование олиго, рисунок 2).
  2. Сделайте рабочий раствор антитела-PC-олиго, добавив на каждый слайд 8 мкл каждого антитела (разведенного 1:40) в панель. Используйте блокирующий реагент в качестве разбавителя, чтобы достичь конечного объема 200 мкл для каждого слайда. Инкубировать в течение ночи при 4 °C (рисунок 3, этап 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Морфологические маркеры, биологические красители или флуоресцентно меченые антитела также могут быть добавлены в раствор на этом этапе.
  3. На следующий день поместите горку в банку Coplin и вымойте 3 x 10 минут в 1x TBS-T. Постфикс в 4% параформальдегиде в течение 30 мин при комнатной температуре, затем 2 х 5 мин в 1x TBS-T.
  4. Добавьте ядерное пятно SYTO13 (разбавленное 1:10 в 1x TBS) в течение 15 мин при комнатной температуре. Вымойте 2x с 1x TBS-T, а затем сохраните слайд в 1x TBS-T.

4. Флуоресцентная визуализация, идентификация ROI и УФ-фоторасщепление на приборе DSP17

  1. Наведя указатель мыши на Пункт сбора данных в Центре управления выберите Создать/Продолжить выполнение.
  2. Поместите слайд в держатель слайда с наклейкой к пользователю. Опустите зажим лотка для слайдов, следя за тем, чтобы ткань была видна в удлиненном окне. Добавьте 6 мл buffer S.
  3. Следуйте инструкциям в Центре управления. Увеличьте масштаб между различными осями с помощью ползунков X и Y, чтобы очертить область для сканирования. Выберите Сканировать. Разрешите сканирование продолжаться до тех пор, пока не будет сфотографирована вся определенная целевая область.
  4. Создайте 20-кратное изображение. Определите рентабельность инвестиций автоматически или вручную (рисунок 3, шаг 2). Чтобы следовать этому протоколу, выберите три круглых ROI одинакового размера (диаметр 250 мкм) для каждого ядра ткани (рисунок 4, внизу).
    ПРИМЕЧАНИЕ: ROI настраиваются по размеру и форме. В каждом разделе можно выбрать несколько ROI. В этом эксперименте циклические ROI определяются вручную.
  5. Подтвердите окупаемость инвестиций, нажав кнопку Выход из рабочей области сканирования . Подождите, пока ультрафиолетовый свет расщепляет олиго от антител.
  6. После завершения процесса очистки инструмента выберите Новый сбор данных , чтобы продолжить работу с текущими слайдами или пластинами. В противном случае выберите Удалить слайды и микропластины.
  7. Откройте окно Finalize Plate , дважды щелкнув область значка пластины в правом нижнем углу Центра управления. Если известен номер лота пакета кода гибридизации (Hyb) (#), введите номер и нажмите « Обновить» (необязательно на этом шаге). Нажмите На кнопку Завершить.
  8. Отсоедините держатель слайда и пластину сбора, следуя инструкциям. Храните слайды в TBS-T. Если слайды не будут использоваться в течение длительного времени, накройте их водной средой и крышкой.

5. Считывание белка17

  1. Используйте проницаемое уплотнение и высушите аспираты при 65 °C в термоциклере с открытым верхом. Добавьте 7 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, и перемешайте. Инкубируйте на RT в течение 10 минут, а затем быстро раскрутите.
  2. Выберите соответствующие уравнения Probe R и Probe U из таблицы 2 , чтобы направлять создание смеси зонд/буфер. Основываясь на количестве Гиб-кодов, необходимых для гибридизации в настоящем эксперименте, примените уравнение (1), как показано ниже. Быстро перемешайте и раскрутите.
    # Hyb Codes Probe R Рабочий пул Probe U Буфер гибридизации рабочего пула n = _____ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1)
  3. Добавьте 84 мкл смеси зондов и буферов в каждый пакет кода Hyb, который будет использоваться. Проведите пальцем, чтобы смешать и вращать вниз. В свежей 96-луночной гибридизационной пластине добавьте 8 мкл каждой Hyb Code Master Mix во все 12 скважин указанного ряда.
  4. Перенесите 7 мкл с коллекторной пластины DSP в соответствующую скважину в пластине гибридизации. Аккуратно перемешать. Термоуплотняйте и выполняйте быстрый отжим. Затем инкубируют в течение ночи при 67 °C. Охладите тарелку на льду и выполните быстрое вращение.
  5. Выложите продукты hyb из каждой скважины в ленточную трубу, аккуратно прокачивая каждую скважину 5x для смешивания. Закройте ленточную трубку и открутите вниз. Заморозьте все оставшиеся несмотанные продукты hyb при -80 °C. Загрузите ленточные трубы в систему анализа.
  6. Сохраните CDF-файл на USB-накопитель, а затем перенесите данные с DSP-инструмента в цифровой анализатор. Завершите настройку, выполнив следующие действия.
    1. Загрузите расходные материалы и объединенные образцы на подготовительную станцию. На экране нажмите Начать обработку. Выберите Высокая чувствительность, а затем Далее. Нажмите Выбрать все для количества скважин с пробами | Финишная | Далее по | уведомлений по электронной почте Начало.
    2. Как только подготовительная станция будет готова, запечатайте картридж и перенесите на цифровой анализатор. Нажмите Начать подсчет, выберите Положение рабочей области, нажмите Загрузить существующий CDF-файл и выберите ранее загруженный файл. Нажмите Готово, снова выберите положение этапа, нажмите Готово | Запустите программу.
  7. Сохраните сжатый файл файлов преобразования счетчика репортеров из системы анализа на USB-накопитель, а затем вставьте диск в устройство DSP. В Центре управления DSP наведите указатель мыши на пункт Сбор данных и выберите пункт Отправить счетчики. Выберите соответствующий ZIP-файл.

6. Анализ данных17

  1. Щелкните Записи в Центре управления DSP. Чтобы просмотреть проверки в очереди, выберите Добавить выбранные сканирования в очередь | Моя очередь анализа. Выберите Новое исследование из очереди после наведения указателя мыши на параметр Анализ данных в Центре управления.
  2. Выберите Контроль качества в разделе Параметры панели задач. Продолжите использовать значения по умолчанию или при необходимости измените. Выберите Выполнить контроль качества и просмотрите сетку результатов. Щелкните Выполнить контроль качества , чтобы продолжить и создать новый набор данных, нормализовав значения до положительных элементов управления гибридизацией.
  3. Импортируйте новые теги в файл XLSX. Выберите Управление заметками в области Сканирование , а затем загрузите шаблон, вставьте теги и импортируйте файл.
  4. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: После выполнения контроля качества настройте данные с помощью других параметров панели инструментов. Используйте инструменты на панели Визуализации для построения преобразованных данных.
  5. Перейдите по серому раскрывающемуся списку параметров, чтобы создать каждый график на панели Визуализации . Выберите определенную область на графике, чтобы визуализировать соответствующие выделенные сегменты на панели Сканирование , и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы создать теги или группы. В разделе Сводка набора данных просмотрите графики из раздела Нормализация, Масштабирование и другие параметры анализа и отображения.
  6. Сохраните визуализацию, щелкнув значок Сохранить; просмотрите визуализации, уже сохраненные в разделе Сводка. Нажмите кнопку Экспорт (.svg), чтобы экспортировать визуализацию в .svg формате. Экспортируйте данные, на которых основана визуализация, нажав кнопку Экспорт (.xlsx ). Экспортируйте все данные, содержащиеся в определенном наборе данных, наведя курсор на имя набора данных во второй панели и щелкнув значок экспорта .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 4 показаны репрезентативные результаты эксперимента DSP, проведенного на образцах глиобластомы. Представлена тепловая карта, иллюстрирующая один из методов визуального сбора данных с помощью программного обеспечения DSP. Строки представляют белковые мишени, и каждый столбец соответствует интересующей области. Цветовая гамма от синего до красного обозначает низкую и высокую экспрессию соответственно. Изменчивость цвета в пределах ряда отражает региональную гетерогенность белка и пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Учитывая разнообразие белков, которые потенциально могут влиять на агрессивность глиом, и представление о том, что некоторые из этих белков остаются неоткрытыми, высокопроизводительный метод количественной оценки белка является идеальным технологическим подходом. Кроме того, учитывая, что пространственные данные в онкологических образцах часто коррелируют с дифференциальной экспрессией18, включение пространственного профилирования в подход к количественной оценке белка позволяет проводить более эф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают поддержку Лаборатории клинической геномики и передовых технологий в отделе патологии и лабораторной медицины системы здравоохранения Дартмута Хичкока. Авторы также признают общий ресурс патологии в Дартмутском онкологическом центре с грантом поддержки онкологического центра NCI 5P30 CA023108-37.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Исследовательская система обнаружения BONDLeica Biosystems, Вецлар, ГерманияDS9455Открытая система обнаружения, содержащая открытые контейнеры в лотке для реагентов
BOND WashLeica Biosystems, Вецлар, ГерманияAR95010X концентрированный буферный раствор для промывки неподвижных тканей
Буфер WNanoString, Сиэтл, Вашингтонконтактная компанияБлокирующий реагент
Набор для конъюгации Cy3Abcam, Кембридж, ВеликобританияAB188287набор для конъюгации флуоресцентных антител Cy3
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)NanoString, Сиэтл, штат Вашингтонконтактная компанияСистема визуализации и определения характеристик белковых и РНК-мишеней
GeoMx DSP Instrument BufferKitNanoString, Сиэтл, штат Вашингтон100471набор буферов для GeoMX DSP (включая буферы для обработки и подготовки образцов)
GeoMx Hyb Code Pack_ProteinNanoString, Сиэтл, Вашингтон121300401Элементы управления для запуска GeoMX DSP Опыты GeoMx
Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)NanoString, Сиэтл, Вашингтон121300101Модуль белка с мишенями для иммунных клеток человека и иммуноонкологическими мишенями
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)NanoString, Сиэтл, Вашингтон121300105Белковый модуль с мишенями для нескольких типов опухолей человека и для маркеров эпителиально-мезенхимального перехода
GeoMx Protein Slide Prep FFPENanoString, Сиэтл, Вашингтон121300308Реагенты для пробоподготовки анализа белка GeoMX DSP
LEICA Bond RXLeica Biosystems, Wetzlar, Германиясвязаться с компаниейПолностью автоматизированный краситель IHC
Master Kit--12 реакцийNanoString, Сиэтл, Вашингтон100052Материалы и реагенты для использования с системой анализа nCounter Analysis
System NanoString, Сиэтл, штат Вашингтонконтактная компанияАвтоматизированная система для мультиплексного количественного определения экспрессии мишени (для использования с GeoMx DSP)
TMA Master II3DHistech Ltd., Будапешт, ВенгрияДля создания блока тканевых микрочипов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
  2. Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).
  3. Iwadate, Y. Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression. Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).
  4. Tao, C., et al. Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma. Frontiers in Oncology. 10, 183(2020).
  5. Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
  6. Barthel, L., et al. Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment. Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).
  7. Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas. Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).
  8. Berghoff, A. S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).
  9. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  10. Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
  11. Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. Precision Cancer Medicine. , Online (2021).
  12. Ye, L., et al. Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis. Frontiers in Immunology. 13, 831253(2022).
  13. Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456(2021).
  14. Brady, L., et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling. Nature Communications. 12 (1), 1426(2021).
  15. Kulasinghe, A., et al. Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients. Frontiers in Oncology. 10, 607349(2021).
  16. Wang, D. Y. -T., et al. Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient. bioRxiv. , (2021).
  17. GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. GeoMx DSP. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).
  18. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).
  19. Wolchok, J. D., et al. Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).
  20. Blank, C. U., et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).
  21. Matthews, R. T., et al. Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member. Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).
  22. Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease. Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).
  23. Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).
  24. Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).
  25. Finn, O. J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic. Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).
  26. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  27. Chen, L., Han, X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).
  28. Cai, X., et al. Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment. Frontiers in Oncology. 11, 672928(2021).
  29. Ishii,, et al. Histological characterization of the tumorigenic "peri-necrotic niche" harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma. PLoS One. 11 (1), 0147366(2016).
  30. Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).
  31. NanoString. CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution. NanoString. , (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Digital Spatial ProfilingGlioma MicroenvironmentProtein Expression ProfilingTissue MicroarrayFluorescence MicroscopyRegion Of InterestTumor HeterogeneityImmune Cell ProfilingAntibody Oligonucleotide ConjugatesSpatial Proteomics

Похожие статьи