Протеомная дисрегуляция играет важную роль в распространении диффузно инфильтрирующих глиом, но несколько соответствующих белков остаются неидентифицированными. Цифровая пространственная обработка (DSP) предлагает эффективный, высокопроизводительный подход для характеристики дифференциальной экспрессии белков-кандидатов, которые могут способствовать инвазии и миграции инфильтративных глиом.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Цифровое пространственное профилирование для характеристики микросреды при диффузно проникающей глиоме взрослого типа
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Диффузно инфильтрирующие глиомы связаны с высокой заболеваемостью и смертностью из-за инфильтративного характера распространения опухоли. Они представляют собой морфологически сложные опухоли с высокой степенью протеомной изменчивости как в самой опухоли, так и в ее гетерогенном микроокружении. Злокачественный потенциал этих опухолей усиливается дисрегуляцией белков, участвующих в нескольких ключевых путях, включая процессы, которые поддерживают клеточную стабильность и сохраняют структурную целостность микросреды. Хотя было проведено множество объемных и одноклеточных анализов глиомы, существует относительная нехватка пространственной стратификации этих протеомных данных. Понимание различий в пространственном распределении опухолевых факторов и популяций иммунных клеток между внутренней опухолью, инвазивным краем и микроокружением дает ценную информацию о механизмах, лежащих в основе пролиферации и распространения опухоли. Цифровое пространственное профилирование (DSP) представляет собой мощную технологию, которая может стать основой для этих важных многослойных анализов.
DSP - это метод, который эффективно количественно определяет экспрессию белка в заданных пользователем пространственных областях в образце ткани. DSP идеально подходит для изучения дифференциальной экспрессии нескольких белков внутри и между регионами различия, обеспечивая несколько уровней количественного и качественного анализа. Протокол DSP является систематическим и удобным для пользователя, что позволяет проводить индивидуальный пространственный анализ протеомных данных. В этом эксперименте тканевые микрочипы строятся из архивных биопсий ядра глиобластомы. Затем выбирается панель антител, нацеленных на интересующие белки в образце. Антитела, которые предварительно конъюгируются с Олигонуклеотидами УФ-фоторасщепления ДНК, затем инкубируются с образцом ткани в течение ночи. При флуоресцентной микроскопии визуализации антител с образцами определяются области интереса (ROI), в пределах которых можно количественно оценить экспрессию белка. Затем ультрафиолетовый свет направляется на каждый ROI, расщепляя ДНК олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды микроаспирируются и подсчитываются в пределах каждого ROI, количественно оценивая соответствующий белок на пространственной основе.
Введение
Диффузно инфильтрирующие глиомы являются наиболее распространенным типом злокачественной опухоли головного мозга у взрослых и неизменно летальны. Склонность клеток глиомы к обширной миграции в мозге является серьезной терапевтической проблемой. Механизм, с помощью которого они распространяются, включает в себя направленную миграцию и неконтролируемое вторжение. Было показано, что инвазивные клетки глиомы демонстрируют тропизм и миграцию вдоль трактов белого вещества1, причем недавние исследования предполагают демиелинизацию этих путей в качестве активного протуморигенного признака2. Инвазия опосредована эпителиально-мезе....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол, изложенный ниже, соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований человека Дартмута-Хичкока. Информированное согласие было получено от пациентов, чьи образцы тканей были включены в это исследование. В разделе Таблица материалов приведены подробные сведения обо всех материалах, реагентах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе.
1. Подготовка слайдов17
- Извлеките или подготовьте закрепленную формалином, парафинированную ткань из диффузно инфильтрирующих глиом взрослого типа человека.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 4 показаны репрезентативные результаты эксперимента DSP, проведенного на образцах глиобластомы. Представлена тепловая карта, иллюстрирующая один из методов визуального сбора данных с помощью программного обеспечения DSP. Строки представляют белковые мишени, и каждый столбец соответствует интересующей области. Цветовая гамма от синего до красного обозначает низкую и высокую экспрессию соответственно. Изменчивость цвета в пределах ряда отражает региональную гетерогенность белка и пр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Учитывая разнообразие белков, которые потенциально могут влиять на агрессивность глиом, и представление о том, что некоторые из этих белков остаются неоткрытыми, высокопроизводительный метод количественной оценки белка является идеальным технологическим подходом. Кроме того, учитывая, что пространственные данные в онкологических образцах часто коррелируют с дифференциальной экспрессией18, включение пространственного профилирования в подход к количественной оценке белка позволяет проводить более эф.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Авторы признают поддержку Лаборатории клинической геномики и передовых технологий в отделе патологии и лабораторной медицины системы здравоохранения Дартмута Хичкока. Авторы также признают общий ресурс патологии в Дартмутском онкологическом центре с грантом поддержки онкологического центра NCI 5P30 CA023108-37.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Исследовательская система обнаружения BOND | Leica Biosystems, Вецлар, Германия | DS9455 | Открытая система обнаружения, содержащая открытые контейнеры в лотке для реагентов |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Вецлар, Германия | AR950 | 10X концентрированный буферный раствор для промывки неподвижных тканей |
| Буфер W | NanoString, Сиэтл, Вашингтон | контактная компания | Блокирующий реагент |
| Набор для конъюгации Cy3 | Abcam, Кембридж, Великобритания | AB188287 | набор для конъюгации флуоресцентных антител Cy3 |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Сиэтл, штат Вашингтон | контактная компания | Система визуализации и определения характеристик белковых и РНК-мишеней |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Сиэтл, штат Вашингтон | 100471 | набор буферов для GeoMX DSP (включая буферы для обработки и подготовки образцов) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Сиэтл, Вашингтон | 121300401 | Элементы управления для запуска GeoMX DSP Опыты GeoMx |
| Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs | )NanoString, Сиэтл, Вашингтон | 121300101 | Модуль белка с мишенями для иммунных клеток человека и иммуноонкологическими мишенями |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Сиэтл, Вашингтон | 121300105 | Белковый модуль с мишенями для нескольких типов опухолей человека и для маркеров эпителиально-мезенхимального перехода |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Сиэтл, Вашингтон | 121300308 | Реагенты для пробоподготовки анализа белка GeoMX DSP |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Германия | связаться с компанией | Полностью автоматизированный краситель IHC |
| Master Kit--12 реакций | NanoString, Сиэтл, Вашингтон | 100052 | Материалы и реагенты для использования с системой анализа nCounter Analysis |
| System NanoString | , Сиэтл, штат Вашингтон | контактная компания | Автоматизированная система для мультиплексного количественного определения экспрессии мишени (для использования с GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Будапешт, Венгрия | Для создания блока тканевых микрочипов |
Ссылки
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
