Описан протокол выделения мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека и их дифференцировки в линию скелетных мышц.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генерация мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека и их дифференцировка в линию скелетных мышц
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Изучение терапевтического потенциала мезенхимальных стволовых клеток зависит от легкости изоляции, способности к дифференцировке, а также надежности и надежности источника. Мы описываем здесь поэтапный протокол выделения мезенхимальных стволовых клеток из ткани пуповины человека (uMSCs), их иммунофенотипирования и распространения таких культур в течение нескольких проходов. В этой процедуре жизнеспособность uMSC высока, потому что нет ферментативного пищеварения. Далее удаление кровеносных сосудов, включая пуповинные артерии и вену, обеспечивает отсутствие загрязнения клеток эндотелиального происхождения. Используя проточную цитометрию, uMSC при выделении получают CD45−CD34−, что указывает на отсутствие клеток в кроветворной линии. Важно отметить, что они выражают ключевые маркеры поверхности, CD105, CD90 и CD73. После создания культур в данной работе описывается эффективный метод индуцирования дифференцировки в этих умСК в линию скелетных мышц. Детальный анализ миогенной прогрессии в дифференцированных умСК показывает, что умСК экспрессируют Pax7, маркер миогенных предшественников на начальных стадиях дифференцировки, за которым следует экспрессия MyoD и Myf5, и, наконец, терминальный маркер дифференцировки, тяжелая миозиновая цепь (MyHC).
Введение
Считается, что пуповина человека обладает надежным резервуаром мезенхимальных стволовых клеток, которые в настоящее время исследуются для регенеративной терапии из-за их надежной скорости пролиферации и дифференцировки, иммуномодулирующих свойств и способности генерировать клетки из всех трех зародышевых слоев1. Пуповинная ткань состоит из нескольких компартментов, таких как пуповинная кровь, субэндотелий пуповинной вены и желе Уортона (WJ), которое само по себе охватывает три нечеткие области - периваскулярную зону, межсосудистую зону и субамнион или подкладку пуповины (CL)2. Хотя uMSC могут быть изолированы от всех эти....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Использование ткани пуповины в этом исследовании было одобрено Институциональным комитетом по исследованию стволовых клеток (IC-SCR), Комитетом по институциональной этике, Институтом науки и технологии трансляционного здравоохранения (IEC-THSTI), Комитетом по институциональной этике гражданской больницы, Гуруграм, Харьяна, и Институциональным комитетом по биобезопасности, THSTI. Образцы пуповинной ткани человека были собраны из доношенных родов во время родов. Информированное письменное согласие было получено от субъектов. Все методы проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами.
1. Выделение МСК из....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успех выделения умСК из пуповинной ткани составляет >95%, в отличие от плохих показателей успеха из цельноповинной крови. После успешной изоляции uMSC анализ FACS показывает, что все клетки являются CD34−CD45−CD105+CD90+. Однако в сравнительном анализе uMSCs, выделенные из пуповинной крови, отображают гетерогенные популяции, в которых доля клеток показывает CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%). Кроме того, двойные положительные CD105 + CD.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Критические шаги
Критическим этапом в этом протоколе является сбор ткани в асептических условиях, от момента доставки до поддержания стерильных культур, в течение всего периода размножения. Во время сбора пуповины важно, чтобы шнур не касался какой-либо нестерилизованной поверхности и был снаружи пропитан 70% этанолом перед сбором в пробирках, содержащих PBS, дополненные антибиотиками. Важно ограничить время между забором пуповины и обработкой ткани для выделения uMSC. В случае необходимости транспорт.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
Мы благодарим г-на Оджаса Тику за их помощь в съемках и видеопроизводстве. Мы также признаем помощь, полученную от сотрудников GARBH-Ini (Междисциплинарная группа по перспективным исследованиям и результатам родов - DBT India), медсестер и старших научных сотрудников в гражданской больнице Gurugram и доктора Паллави Кшетрапала для помощи в логистике. Эта работа была поддержана грантами, предоставленными Сучитре Гопинатх от Департамента биотехнологии, Индия (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Амфотерицин B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Раствор антибиотика 100x Жидкий, эндотоксин протестирован (10 000 ЕД пенициллина и 10 мг стрептомицина/мл в 0,9% нормальном физиологическом растворе) | HiMedia | A001A-50mL | |
| антитело против GAPDH | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Антитело Anti-MyHC (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Антитело против MyoD (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Антитело против миогенина (клон F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Антитело против Pax7 | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Мышиный клон CD90 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Коллаген 1 типа | Merck | C8919 | |
| D (+) глюкоза | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Дексаметазон | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II или FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Фетальная сыворотка бычьего скота, сертифицированная Бразилия | GIBCO | 10270106 | не является термоинактивированной |
| мышью FITC Mouse anti-human Клон CD106 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Мышь античеловеческий клон CD14 M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Мышь античеловеческий клон CD31 WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Мышь античеловеческий клон CD34 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Мышь античеловеческий клон CD45 HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Мышь античеловеческий клон CD49D 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Мышь античеловеческий клон CD90 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Мышь античеловеческий клон HLA-A,B,C G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Мышь античеловеческий клон IgG G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| программное обеспечение FlowJo | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Сыворотка для лошадей | HiMedia | RM1239 | |
| Гидрокортизон | Merck | H4001 | |
| Ламинин | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification без L-глутамина, рибо- и дезоксирибонуклеозидов | Hyclone | SH30568. FS | Базальная среда для uMSCs |
| PE Мышь античеловеческий клон CD105 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Мышь античеловеческий клон CD44 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Мышь античеловеческий клон CD49E llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Мышь античеловеческий клон IgG G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Мышь античеловеческий CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| фосфатно-солевой буфер (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| раствор трипсина/ЭДТА (1x 0,25% трипсин и 0,02% ЭДТА в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
Ссылки
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
