Всестороннее понимание изменения походки, вызванного бездействием, у грызунов

Отсутствие физической активности или неиспользование приводит к ухудшению опорно-двигательного аппарата, такого как атрофия мышц и потеря костной^{массы 1} и декондиционирование всего тела². Более того, в последнее время замечено, что бездействие влияет не только на структурные аспекты опорно-двигательного аппарата, но и на качественные аспекты движения. Например, положение конечностей крыс, подвергшихся воздействию смоделированной среды микрогравитации, отличалось от положения неповрежденных животных даже через 1 месяц после окончания вмешательства ^3,4. Тем не менее, мало что было сообщено о дефиците движения, вызванном бездействием. Кроме того, не были полностью определены комплексные характеристики движения износов.

Текущий протокол демонстрирует и обсуждает применение кинематической оценки для визуализации изменений движения, ссылаясь на дефицит движения походки, вызванный неиспользованием у крыс, подвергшихся разгрузке задних конечностей.

Показано, что гиперэкстензии конечностей при ходьбе после смоделированной среды микрогравитации наблюдаются как у человека⁵, так и у животных ^4,6,7,8. Поэтому для универсальности мы сосредоточились на общих параметрах в этом исследовании: углах коленного и голеностопного суставов и вертикальном расстоянии между плюснефаланговым суставом и тазобедренным суставом (примерно эквивалентно высоте бедра) в средней точке фазы стойки (посередине). Кроме того, в ходе обсуждения предлагаются потенциальные области применения кинематической оценки видео.

Серия кинематических анализов может быть эффективной мерой для оценки функциональных аспектов нейронного контроля. Однако, хотя анализ движения был разработан от наблюдения следа или простого измерения на захваченном видео ^9,10 до нескольких систем камер ^11,12, универсальные методы и параметры еще не установлены. Метод в этом исследовании предназначен для обеспечения этого совместного анализа движения с комплексными параметрами.

В предыдущей работе¹³ мы попытались проиллюстрировать изменения походки у крыс модели поражения нервов с помощью комплексного видеоанализа. Однако в целом потенциальные результаты анализа движения часто ограничиваются заранее определенными переменными, представленными в рамках анализа. По этой причине в настоящем исследовании более подробно описывается, как включить определяемые пользователем параметры, которые являются широко применимыми. Кинематические оценки с использованием видеоанализа могут иметь дальнейшее применение, если реализованы надлежащие параметры.

Настоящее исследование было одобрено Экспериментальным комитетом по животным Киотского университета (Med Kyo 14033) и выполнено в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения (Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, 8-е издание). Для настоящего исследования использовались 7-недельные самцы крыс Wistar. Схема, представляющая последовательность процедур, приведена в дополнительном файле 1.

1. Ознакомление крыс с беговой дорожкой

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь с ранее опубликованным отчетом¹³ для получения подробной информации о процедуре.

1. Поместите крысу на беговую дорожку, предназначенную для грызунов (см. Таблицу материалов). В первом сеансе позвольте животному исследовать беговую дорожку, чтобы привыкнуть к окружающей среде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс занимает около 5 минут.
2. Постепенно увеличивайте скорость пояса до нужного уровня (20 см/с) и выгуливайте крысу. Используйте электрический шок в конце беговой дорожки, если необходимо¹⁴.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один сеанс ходьбы длится примерно 10-20 минут.
3. Повторяйте этот процесс через день в течение 1 недели или чаще, если это необходимо 15,16,17.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начните ознакомительный период за 1 неделю до шага 2.
4. Держите крыс группами в клетках (по 2-3 крысы в каждой клетке) с 12-часовым светло-темным циклом. Обеспечьте еду и воду ad libitum.

2. Применение разгрузки задних конечностей к крысам и установка совместных маркеров

ПРИМЕЧАНИЕ: Поднимите задние конечности крысы с помощью нити и клейкой ленты, прикрепленной к хвосту, как описано в предыдущих докладах 18,19,20. Убедитесь, что нить и лента прикреплены к основанию хвоста, чтобы предотвратить скольжение кожи хвоста. Внимательно следите за животными и при необходимости регулируйте высоту разгрузки или герметичность ленты.

1. Под 2-5% ингаляции изофлурана с анестезирующей маской оберните первую половину полоски клейкой ленты длиной 30 см вокруг проксимальной части хвоста крысы.
2. Сложите хлопчатобумажную нить длиной 1 м (хлопковый кухонный шпагат, диаметром около 1 мм) пополам. Сделайте петлю, завязав узел в сложенной средней точке 50 см. Узел должен находиться примерно в 5 см от кончика, чтобы оставить петлю окружности 10 см.
3. Пусть оставшиеся 15 см клейкой ленты пройдут один раз через петлю резьбы, чтобы закрепить ленту. Оберните оставшуюся ленту вокруг дистальной части хвоста.
4. Закрепите другой наконечник резьбы на верхней платформе клетки. Держите животных в клетке, которая достаточно высока, чтобы поднять их задние конечности за хвосты. Помимо разгрузки, обеспечьте те же условия, что и для группы Ctrl, такие как еда, вода и напольные принадлежности.
5. Настройте совместные маркеры и программное обеспечение (см. Таблицу материалов), выполнив следующие действия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об этом шаге, пожалуйста, см. Wang et ^al.13.
   1. Под 2-5% ингаляции изофлурана прикрепляют цветные полусферические маркеры (диаметром 3 мм) к бритой коже, соответствующие костным ориентирам. Держите уровень изофлурана как можно ниже, чтобы предотвратить очень глубокую анестезию.
   2. Убедитесь, что ориентирами являются передний верхний подвздошный отдел позвоночника (ASIS), основной трохантер (тазобедренный сустав), коленный сустав (колено), латеральный маллеол (лодыжка) и пятый плюснефаланговый сустав (MTP)²¹.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нарисуйте кончик пальца ноги, если необходим угол наклона пальца ноги. Используйте маркер краски на масляной основе (см. Таблицу материалов). Жидкий клей предпочтительнее для клея, так как жидкая форма сохнет быстрее.

3. Отслеживание маркеров с помощью захваченных видео

1. Откройте приложение MotionRecorder (см. раздел Таблица материалов) и включите беговую дорожку. Поместите крысу на ремень беговой дорожки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре камеры для видеозахвата (см. Таблицу материалов) расположены вдоль длинных краев беговой дорожки: две камеры на каждом краю, примерно 50 см х 50 см друг от друга, обращенные к центру области пояса беговой дорожки.
2. Увеличьте скорость ленты до 20 см/с. Когда крыса начнет нормально ходить с нужной скоростью, нажмите на значок «Запись », чтобы начать захват видео. Как только будет получено достаточное количество шагов (5 последовательных шагов, предпочтительно 10 шагов), остановите захват, снова нажав на значок «Запись ».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор данных о нескольких животных в одном эксперименте. Попробуйте до пяти раз для каждой крысы. Если крыса не ходит, захватите другую и попробуйте первую позже. Скорость захвата камеры составляла 120 кадров/с.
3. Откройте приложение 3DCalculator (см. Таблицу материалов) и видеофайл для анализа.
4. Обрежьте видео, отрегулировав горизонтальный ползунок сверху, чтобы он содержал достаточное количество последовательных шагов. Захваченное изображение изменяется путем перетаскивания значков концевых кончиков желтого слайда.
5. Чтобы захватить маркеры, выберите условные обозначения маркеров, нажав на легенды маркера на модели изображения флика, перетащив их на соответствующий маркер на захваченном видео и отпустив кнопку. Этот процесс выделяет цвет маркера легенде маркера на картинке стика. Повторите этот процесс для каждого отслеживаемого маркера.
6. Щелкните значок Автоматическая трассировка . Если система не отслеживает точно маркеры или процесс отслеживания останавливается из-за потери маркера, переключитесь в ручной режим.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот автоматический процесс не останавливается, если маркеры не пропущены. Если остановки происходят чаще, чем каждые несколько кадров, рассмотрите возможность изменения положения потерянных маркеров.
7. Если требуется ручной режим, щелкните значок Вручную , чтобы переключиться. Нажмите на отсутствующую легенду маркера на картинке стика и соответствующий маркер на видео. Видео продолжается с одним кадром за каждый клик в ручном режиме.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свободно доступные приложения, которые включают автоматический щелчок, чтобы предотвратить усталость тех, кто отслеживает (оцифровывает) маркеры (см. Таблицу материалов).

4. Вычисление желаемых параметров

1. Откройте приложение KineAnalyzer (см. раздел Таблица материалов) и загрузите файл.
2. Перейдите в меню Вид > Редактировать маркер. Откроется окно "Редактирование мастера маркера".
   ПРИМЕЧАНИЕ: Захваченные маркеры имеют простые цифры, пока они не будут помечены.
3. Нажмите на нужную метку (ориентир) на вкладке маркера , затем нажмите на нужный цвет. Этот процесс обозначает каждый маркер определенному ориентиру.
4. Перейдите на вкладку ссылки . Создавайте линии, нажимая на два маркера последовательно. Этот процесс создает линии, которые соответствуют каждой конечности, используя помеченные маркеры.
5. Присвойте цвета созданным линиям, выбрав нужный цвет в столбце «Цвет ».
6. Определите углы, назначив опорные/движущиеся линии и направления углов. Перейдите на вкладку угол . Назвав угол, назначьте вектор A (опорная линия) и вектор B (движущаяся линия), щелкнув по маркерам , соответствующим каждому ориентиру. Затем определите направление угла со значением в операционной секции на той же вкладке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования параметры, на которых в основном фокусировались, находились в середине фазы положения (середина): KSt (угол колена), ASt (угол лодыжки), MHD (плюсневое расстояние бедра: эквивалентно высоте бедра, см. следующий раздел). Угол колена и угол лодыжки были определены как угол между бедренной и большеберцовой костями и большеберцовой и пятой плюсневой костью соответственно. Угол 0° означает, что соединение было полностью согнуто.
7. На вкладке расстояние определите параметр расстояния (MHD). Выберите два соответствующих маркера в разделе Настройка расстояния . Также будут доступны совместные траектории в зависимости от нормализованного ступенчатого цикла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Определение углов/параметров должно быть выполнено только один раз. Настройки параметров будут доступны для последующей оценки после завершения этого процесса определения.

12 животных были случайным образом распределены в одну из двух групп: разгрузочную группу (UL, n = 6) или контрольную группу (Ctrl, n = 6). Для группы UL задние конечности животных были выгружены хвостом в течение 2 недель (период UL), тогда как животные группы Ctrl были оставлены свободными. Через 2 недели после разгрузки группа UL показала отчетливый паттерн походки по сравнению с группой Ctrl. На рисунке 1 показаны нормализованные совместные траектории репрезентативных субъектов. Во время фазы стойки группа UL демонстрировала дальнейшие разгибания в колене и лодыжке (то есть подошвенное сгибание для лодыжки), чем группа Ctrl, называемая «ходьбой пальца ноги» 3,16. Целью данного исследования было определение комплексных характеристик этих ухудшений движения. Для выяснения количественных показателей этих общих результатов были реализованы три параметра, указанные выше: KSt, угол колена посередине; ASt, угол лодыжки; МГД, плюсневое расстояние бедра (вертикальное расстояние между пятым плюснефаланговым суставом и тазобедренным суставом), которое практически эквивалентно высоте тазобедренного сустава посередине.

Через 2 недели (2 недели после разгрузки) как KSt, так и ASt группы UL были значительно больше, чем у группы Ctrl (рисунок 2A,B, непарный t-тест: p < 0,01). Кроме того, МГД был значительно выше в группе UL (рисунок 3, непарный t-тест: p < 0,01). Положение лапы во время среды показано на дополнительном рисунке 1.

Меньшая активность при разгрузке может вызвать нейронные изменения 22,23,24,25. Эти изменения могут привести к ухудшению функциональных особенностей опорно-двигательного аппарата 3,4 и опорно-двигательного аппарата. Значительные изменения в параметрах, описанных выше, могут быть связаны с этими нейронными изменениями.

Рисунок 1: Нормализованные совместные траектории репрезентативных субъектов. Ордината настраивается таким образом, чтобы траектории на диаграмме появлялись примерно в центре. (A) Коленные и (B) голеностопные суставы в группе разгрузки демонстрировали дальнейшее разгибание (подошвенное сгибание для лодыжки), чем контрольная группа во время фазы стояния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Суставные углы колена и лодыжки посередине. Группа разгрузки показала значительно большие углы как в (A) KSt (колено), так и (B) Ast (лодыжка), чем контрольная группа (непарный t-тест: p < 0,01). Строка ошибок представляет доверительный интервал 95 %. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Высота тазобедренного сустава посередине. Расстояние плюсневого бедра у группы разгрузки было значительно выше, чем у контрольной группы (непарный т-тест: p < 0,01). Строка ошибок представляет доверительный интервал 95 %. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Схема, представляющая последовательность процедур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 1: Положение лапы крысы во время среды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео 1: Отслеживание шагов снизу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительное видео 2: Оценка достигающих движений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.