Мышиная модель дисфункции рук, связанной с гемодиализом

Установление и сохранение функционального сосудистого доступа остается важной основной целью для пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности (ТПН), получающих заместительную почечную терапию посредством гемодиализа¹. Повторные процедуры гемодиализа необходимы для удаления продуктов жизнедеятельности, нормализации электролитов и поддержания баланса жидкости после того, как функция почек становится неадекватной, и, таким образом, необходимы для долгосрочной выживаемости². Таким образом, сосудистый доступ представляет собой «спасательный круг» для пациентов с ТПН, и размещение аутогенного артериовенозного свища (АВФ) остается предпочтительным вариантом доступа к диализу среди этой когорты³. Тем не менее, примерно 30-60% пациентов, находящихся на гемодиализе, испытывают целый спектр нарушений кисти, клинически определяемых как дисфункция рук, связанная с доступом (ARHD). Симптомы АРГД могут варьироваться от слабости и дискоординации до моноплегии и пальцевой гангрены, которые могут возникать рано после создания АВФ или развиваться постепенно с созреванием свища. Кроме того, ARHD усложняет схему лечения ТПН, что связано с низким качеством жизни, высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний и повышенной смертностью ^2,3,4.

Было разработано несколько моделей на животных для изучения сосудистого ремоделирования, вызванного гемодинамическими изменениями после создания AVF 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Модели крупных животных с АВФ подвздошной или бедренной кости 16,17,18,19,20 и модели грызунов с использованием анастомоза сонной артерии-яремной вены или формирования свища нижней полой вены инфраренальной аорты хорошо известны для изучения вышеупомянутых аспектов созревания и проходимости АВФ ²¹ . Например, венозная гипертензия, больший диаметр просвета и увеличение толщины стенки вены являются признаками успешного созревания АВФ, тогда как значительный фиброз среды и гиперплазия интимы или развитие тромба без изменений потока часто характеризуют неудачи АВФ ^6,15. Тем не менее, модели крупных животных не обладают экспериментальной гибкостью или трансгенными возможностями мышиных моделей, в то время как современные модели грызунов не облегчают исследование АРГД из-за анатомического расположения и/или отсутствия сопутствующей патологии конечностей. Действительно, из-за отсутствия установленной доклинической модели животных, которая повторяет соответствующий клинический фенотип, прогресс исследований по выяснению патобиологических механизмов и разработке новых терапевтических стратегий оставался в застое, несмотря на прогрессирующее увеличение числа симптоматических пациентов с ДРГД. Таким образом, основная цель этого исследования состоит в том, чтобы представить уникальную мышиную модель АРГД, обеспечивающую процедурные этапы микрохирургии АВФ и характеристику патофизиологии, связанной с АВФ.

Все процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Флориды и Медицинским центром по делам ветеранов Малкольма Рэндалла.

ПРИМЕЧАНИЕ: Молодые взрослые (8-10 недель) самцы мышей C57BL / 6J были приобретены в лаборатории Джексона и размещены в помещении для контролируемых животных с легким (12-часовой свет: 12-часовой темный цикл), температурой (22 °C ± 1 °C) и влажностью (50% ± 10%). Пяти мышам было разрешено жить в клетке (Ш: 18 см x Д: 29 см x В: 12,5 см) с материалами для гнездования, пищей и водой, которые были доступны вволю. После 7 дней акклиматизации среды обитания со стандартным кормом мыши были переведены на рацион на основе казеина в течение 7 дней в качестве переходной фазы диеты. После этого мышей кормили чау-чау на основе казеина добавкой аденина 0,2%-0,15% в течение 2-3 недель, чтобы вызвать почечную дисфункцию (ХБП) до операции AVF, как описано ранее^22,23,24. Контрольные мыши получали пищу на основе казеина без добавок аденина (контроль). Контрольная диета и диета при ХБП сохранялись в течение всего послеоперационного восстановительного периода (POD).

1. Предоперационные измерения

1. Оцените исходные/предоперационные исходы, диаметры аорто-подвздошных сосудов и параметры гемодинамического потока с помощью дуплексной ультразвуковой визуализации и перфузии задних конечностей с помощью лазерной допплерографии, как описано ранее²⁵.
2. Определите одностороннюю силу захвата задних конечностей и оценку походки на беговой дорожке, чтобы установить исходную функцию задних конечностей, как описано ранее^25,26.
3. Оцените функцию почек путем измерения скорости клубочковой фильтрации (СКФ) с помощью клиренса FITC-инулина и/или уровня азота мочевины мочевины (АМК) сыворотки крови, как описано ранее^22,24,27.

2. Хирургическая подготовка

1. Подготовьте следующие хирургические инструменты и расходные материалы (Таблица материалов): стерилизатор горячих шариков, смазка для глаз, триммер для ручек, спиртовые препараты, салфетки с хлоргексидином, сверхтонкие щипцы Graefe, стерилизованные 0,9% физиологический раствор, игольчатые шприцы 29 г и 31 г, нетканые губки 2 х 2, средние односторонние круглые (SC-9) и маленькие двусторонние твердые, острые, заостренные (SC-4) ватные палочки, низкотемпературное прижигание, прямые щипцы Dumont, щипцы Dumont под углом 45°, прямые пружинные ножницы Vannas, изогнутые пружинные ножницы Vannas, иглодержатели с круглой ручкой, швы нескольких размеров (шелк 4-0, PGA, шелк 6-0 и нейлоновые швы 10-0), гепарин, рассасывающаяся желатиновая губка, держатель прямой иглы и бупренорфин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Резинки для фиксации конечностей и ретракторы для живота и ног были изготовлены вручную.
2. Стерилизуют хирургические препараты в автоклаве с паровой стерилизацией при 120-125 °C в течение 30 минут с последующей сушкой в течение 30 минут перед операцией. Используйте 70% очистку этанолом с последующей стерилизацией горячих гранул (240-270 ° C в течение 3 минут) между каждой операцией на животных.
3. Приготовьте стерилизованный 0,9% физиологический раствор, гепаринизированный физиологический раствор (100 МЕ / мл) и бупренорфин (0,01 мг / мл) с помощью игольчатых шприцев по 29-31 г.

3. Анестезия и позиционирование

1. Инициируйте анестезию мыши в индукционной камере (0,8 мл / мин, 2,5% изофлурана). После того, как мышь будет адекватно анестезирована, поместите мышь в положение лежа на спине на хирургической станции, накрытой стерильной простыней. Уменьшите концентрацию изофлурана до ~ 1,2% на этапах бритья и позиционирования.
2. Нанесите смазку для глаз, чтобы защитить глаза от высыхания во время операции.
3. Используя триммер для ручки, сбрейте волосы на животе перед операцией и волосы на ногах для послеоперационных измерений перфузии. Очистите волосы от операционного поля.
4. Зафиксируйте верхние и нижние конечности резинками и зажимами, проверьте глубину анестезии, контролируя рефлекс защемления пальцев ног, и при необходимости титруйте анестезию. Выполняйте оценку характера дыхания каждые 3-5 минут на протяжении всей хирургической процедуры, чтобы откалибровать уровень анестезии.

4. Исследование хирургической целевой области

1. Очистите выбритый участок кожи несколько раз, чередуя спиртовые салфетки и салфетки с хлоргексидином по кругу, чтобы продезинфицировать операционное поле.
2. Делают срединную лапаротомию от нижнего края грудины до лобкового симфиза. Рассеките лобковую жировую подушку, чтобы получить более широкое операционное поле.
3. Откройте целиотомию, чтобы получить доступ к перитонеальному содержимому с помощью ретракторов, и выпотрошите тонкую и толстую кишку с помощью средних односторонних круглых ватных тампонов. Накройте кишечник пропитанной солевым раствором нетканой губкой.
4. После получения адекватного воздействия на забрюшинную сосудистую сеть покройте оставшийся кишечник, почки и мочеточники небольшими неткаными губками, пропитанными физиологическим раствором. Эвакуируйте растянутый мочевой пузырь, осторожно сжимая купол мочевого пузыря средними односторонними круглыми ватными тампонами по мере необходимости.
5. Тщательно рассекают периваскулярную фасцию и жировую ткань примерно на 1 см проксимально до бифуркации аорты, доходящей до уровня левой бифуркации подвздошной кости, используя прямые щипцы Дюмона и небольшие двусторонние твердые, острые, заостренные ватные тампоны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Левая подвздошная артерия и вена остаются прилипшими друг к другу, изолируя артериовенозные структуры в массовом порядке. Этот шаг обеспечит достаточную мобилизацию судов для облегчения создания AVF.
6. Если обнаружены какие-либо небольшие венозные ветви, происходящие из левой общей подвздошной вены или сходящиеся с ней, перевязывайте их с помощью низкотемпературного прижигания с шелковым швом 6-0 или без него по мере необходимости.
7. Проведите кончиком угловых щипцов под левым общим пучком подвздошных сосудов и аккуратно распределите несколько раз, чтобы мобилизовать сосуды из нижележащей забрюшинной мускулатуры (рис. 1А).

5. Создание общего анастомоза подвздошной артериовенозной фистулы

1. Наложите два шелковых шва 4-0 вокруг изолированного левого общего подвздошного артериовенозного пучка и используйте их в качестве лигатур (например, перекрестных зажимов) к сосудистому пучку. Создайте один узел с каждым шелковым галстуком 4-0 и наложите их последовательно от проксимального к дистальному.
2. Убедитесь, что поперечные зажимы с шелковыми галстуками расположены достаточно далеко друг от друга, чтобы изолировать ~ 2 мм длины сосуда, а последовательное наложение шовных лигатур ускорит нагрубание левой подвздошной вены.
3. Используя шелковые шовные нити 4-0 в качестве ручек, поверните левый подвздошный артериовенозный сосудистый пучок по часовой стрелке и точно отрегулируйте положение, чтобы временно расположить вену спереди от артерии (рис. 1B).
4. Сделайте продольную венотомию (~1 мм) прямыми пружинными ножницами Vannas и аккуратно смойте остатки крови из венозного просвета 0,9% физиологическим раствором (рис. 1В). Будьте осторожны на этом этапе, так как промывка физиологическим раствором под высоким давлением может вызвать венозное нарушение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Область красного цвета, которая остается в подвздошной артерии после венозной промывки, обеспечивает визуальное окно для следующего шага.
5. Наложите имбрикационный нейлоновый шов 10-0 через заднюю стенку вены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть подвздошной вены должна находиться непосредственно к передней стенке подвздошной артерии, и стенки естественно прилипают. Шов должен проходить через обе стенки и завязывать шов одним узлом (рис. 1D). Обратите внимание, что небольшое количество кровотечения, которое происходит из застоявшейся крови в подвздошной артерии, появится, как только игла пройдет через обе стенки. Если внутрипросветное кровотечение продолжается на этом этапе, поперечные зажимы шелкового шва могут быть слишком ослаблены и нуждаются в дальнейшем затягивании.
6. Возьмитесь за отрубленные концы швов и поместите их под легкое натяжение, чтобы сместить переднюю стенку от задней стенки подвздошной артерии. Сделайте эллиптический разрез ~ 1,0 мм x 0,3 мм с помощью изогнутых пружинных ножниц Vannas, удалив прилипшие стенки как подвздошной артерии, так и вены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, артериовенозная фистула создается после того, как этот общий канал установлен. На этом этапе можно повредить боковые стенки вены, так как разрез задней подвздошной вены / передней подвздошной артерии выполняется через венотомию. Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать этого осложнения, так как это может значительно уменьшить диаметр свища и привести к развитию тромба.
7. Осторожно промойте остаточную кровь из открытого просвета артерии 0,9% физиологическим раствором и гепаринизированным физиологическим раствором (100 МЕ / мл)²⁸ (рис. 1E).
8. После создания AVF восстановите первоначальную венотомию передней стенки с помощью двух или трех нейлоновых швов 10-0 в прерывистом режиме (рис. 1F).
9. Восстановите сосудистый пучок в его первоначальной анатомической ориентации и поместите небольшой кусочек пропитанной физиологическим раствором желатиновой губки рядом с восстановленной венотомией, чтобы облегчить гемостаз.
10. Ослабьте лигатуры с перекрестным зажимом 4-0 с одним узлом последовательно от дистального к проксимальному. Внимательно следите за местом венотомии на предмет чрезмерного кровотечения, ослабляя каждый шов.
11. Если восстановление не является адекватно кровоостанавливающим, повторно наложите крестовые зажимы и наложите еще один нейлоновый шов 10-0 на место кровотечения. Если гемостаз обеспечен, снимите швы, а затем рассасывающуюся желатиновую губку.
12. Аккуратно потрите сосудистый пучок небольшими двусторонними твердыми, острыми, заостренными ватными палочками, которые еще больше облегчают восстановление кровотока. Подтвердите технический успех операции с помощью визуализации пульсирующей, ярко-красной насыщенной кислородом крови, поступающей в подвздошную вену и смешивающейся с темной венозной кровью, возвращающейся из задней конечности.
13. Ввести гепаринизированный физиологический раствор (0,2 МЕ / г)¹⁵ в НПВ для системной антикоагуляции для улучшения результатов проходимости АВФ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что этот этап происходит после сосудистой реконструкции (в отличие от человеческого аналога, где гепаринизация происходит до перекрестного пережатия сосудов), при выполнении на этом этапе процедуры наблюдалось снижение интраоперационного кровотечения и улучшение проходимости АВФ. Инъекция в участок, покрытый фасцией и/или жиром, предпочтительна для предотвращения кровотечения из места прокола.
14. Повторно осмотрите место операции на предмет гемостаза после инъекции гепаринизированного физиологического раствора. Если нет проблем с кровотечением, закройте срединную фасцию, а затем разрез кожи рассасывающимися швами 5-0 PGA в беговой манере.
15. Для фиктивных операций выполните все ключевые этапы процедуры, кроме формирования AVF. Наложите один узел шелковой лигатуры 4-0 на проксимальный конец левого подвздошного артериовенозного пучка и сопоставьте время зажима с операциями AVF (например, ~ 20 минут, в зависимости от квалификации микрохирурга).

6. Послеоперационный уход и измерение

1. После закрытия лапаротомии измерьте перфузию крови двусторонних передних мышц большеберцовой кости и вентральных лап с помощью лазерной допплерографии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Односторонний дефицит перфузии подтвердит отклонение артериального кровотока фистулой («кража»).
2. Введите 0,1 мг / кг бупренорфина подкожно и верните мышь в предварительно разогретую клетку для мыши с хорошо впитываемой мягкой подстилкой с гнездом.
3. Дайте мыши восстановиться в предварительно разогретой клетке для мыши до тех пор, пока анестезия не пройдет, что будет очевидно, когда мышь будет амбулаторной и интерактивной (~ 2 часа). Во время выздоровления обеспечьте мышке легкий доступ к увлажненной, мягкой диете.
4. Вводите бупренорфин и/или подкожную гидратацию физиологическим раствором каждые 12–48 ч и проводите ежедневный мониторинг в течение 5 дней после операции. Усыплять животных с ухудшающимся состоянием или чрезмерным некрозом тканей, классифицированным как модифицированная оценка ишемии ≥2²⁹.
5. Используйте серийные дуплексные ультразвуковые исследования для оценки проходимости свища после операции; мыши с тромбозом свищей исключаются из последующих анализов, если целью экспериментов не является характеристика недостаточности созревания AVF.
6. Определите другие показатели послеоперационных результатов, такие как локальная гемодинамика, сила захвата и эффективность походки в период восстановления. Собирают свищ и мышечную ткань для оценки гистоморфологии в конце эксперимента во время жертвоприношения^25,27.

Животные, подвергшиеся воздействию адениновой диеты, имеют сниженную скорость клубочковой фильтрации (контроль: 441,3 ± 54,2 мкл / мин против ХБП: 165,1 ± 118,3 мкл / мин, p < 0,05) и повышенный уровень азота мочевины в сыворотке крови (контроль: 20,39 ± 4,2 мкл / мин против ХБП: 38,20 ± 10,65 мкл / мин, p < 0,05) по сравнению с животными, получавшими чау на основе казеина, что подтверждает наличие почечной недостаточности до операции по удалению артериовенозной фистулы.

Валидация проходимости АВФ
Хотя интраоперационным визуальным подтверждением технического успеха является первичное выявление проходимости свища, оно не гарантирует в полной мере проходимость или физиологическое созревание на протяжении всего периода исследования. Исходы послеоперационной проходимости (т.е. успех или неудача) определяли как с помощью дуплексной ультразвуковой визуализации, так и с помощью гистологического исследования, как мы ранее продемонстрировали25. На рисунке 2 показаны репрезентативные изображения режима B, допплерографии пульсовой волны и цветного допплеровского ультразвука и морфологические срезы анастомоза артериовенозной фистулы соответственно. Патентованный свищ непосредственно визуализируется при цветном допплеровском анализе с турбулентной гемодинамикой, а также спектральным расширением в месте свища. Адаптивные проточно-опосредованные изменения сосудов притока и оттока также косвенно подтверждают проходимость АВФ. В частности, аорта имеет повышенную пиковую систолическую и конечную диастолическую скорость, НПВ развивает пульсацию с повышенной пиковой скоростью, а расширение сосудов как в аорте, так и в НПВ очевидно (рис. 2А). Напротив, неудачный или тромбированный свищ почти не имеет изменений в измерениях притока или оттока, а также не имеет турбулентности или спектрального расширения в левой подвздошной сосудистой сети. Обычно фистула из-за тромбоза частично или полностью окклюзирует левую подвздошную артерию, что визуализируется как минимальный поток или его отсутствие при пульс-волновом допплеровском анализе. На рисунке 2B показаны серийные гистологические срезы АВФ через 2 недели после хирургического создания. Срезы имеют толщину 5 мкм и окрашены трихромом Массона. Хирургический анастомоз артерии и вены очевиден, и присутствует отчетливая венозная артериализация (утолщение венозной стенки и фиброз с неоинтимальной гиперплазией). Ультразвуковая визуализация проводилась на 3-й день после операции, чтобы исключить мышей с ранней недостаточностью AVF, а затем в течение всего периода исследования были получены серийные неинвазивные измерения. Морфологическая оценка предоставляет детали ремоделирования сосудов для конкретного периода во время жертвоприношения и использовалась для подтверждения результатов ультразвукового исследования. Первоначально следует ожидать проходимости AVF примерно 50% (20-30% послеоперационной смерти и 20-30% недостаточности свища)25 , но частота успеха хирургического вмешательства значительно улучшается (~ 5-10% отказов) с практикой и повышением мастерства.

Патофизиологические особенности формирования подвздошной артериовенозной фистулы
Гемодинамические изменения: Характеристики гемодинамики AVF и дистальной перфузии задних конечностей должны быть количественно определены, чтобы контекстуализировать патофизиологию конечностей, связанную с доступом. Ультразвуковые измерения В-моды и импульсно-волновой допплерографии после операции выявили расширение сосудов притока и оттока (IVC: в 1,4 раза при POD3 и в 1,6 раза при POD13 и IRA: в 1,4 раза при POD3 и в 1,7 раза при POD13, p < 0,05) и увеличение пиковой систолической скорости (пиковая систолическая скорость IVC: в 5,5 раза при POD3 и в 4,9 раза при POD13 и пиковая систолическая скорость IRA: в 2,8 раза при POD3 и в 3,7 раза при POD13, P < 0,05) по сравнению с фиктивными животными (рис. 3A-D). Кроме того, односторонняя ишемия задних конечностей была очевидна после операции, что подтверждает опосредованную кражу артериальной гипоперфузии дистальнее свища. Ожидается, что дефицит перфузии левой лапы составит ~ 20% от контралатеральной конечности, а дефицит перфузии передней большеберцовой мышцы составляет ~ 60%. Мыши частично восстановили этот дефицит в течение всего периода исследования (рис. 3E, F).

Дисфункция задних конечностей: После создания АВФ ожидается инвалидность ипсилатеральных конечностей, которая включает в себя легкую (в большинстве случаев) или тяжелую (в редких случаях) хромоту ног, которая может длиться несколько дней. Неразрешенный паралич задних конечностей и/или некроз лап могут свидетельствовать о тяжелом ишемическом инсульте, вызванном размером свища, выходящим за пределы нормы. Нейромоторная функция задних конечностей была количественно определена с помощью тестирования силы захвата и анализа паттерна походки на беговой дорожке, которые выполнялись последовательно в течение всего периода восстановления. Ожидаемая односторонняя сила захвата составляет ~ 50% от контралатеральной конечности на 4-й день после операции с постепенным восстановлением. Мышам AVF также требуется снижение скорости беговой дорожки во время оценки походки (<20 см / мин) (рис. 3G, H).

Рисунок 1: Микрохирургические этапы анастомоза артериовенозной фистулы . (A) Воздействие на хирургическую целевую область, включая срединную лапаротомию и изоляцию левой подвздошной артерии/вены. (B) Шовные лигатуры 4-0 (например, используемые в качестве временных зажимов для сосудов) на левом общем подвздошном артериовенозном пучке в проксимальном и дистальном участках. (C) Продольная венотомия на передней стенке подвздошной вены. (D) 10-0 имбрикационный шов через заднюю стенку подвздошной вены и переднюю стенку подвздошной артерии. (E) Эллиптический разрез с имбрикационным растяжением. (F) Первоначальная продольная венотомия на снимке C восстанавливается с помощью прерывистого шва 10-0. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Валидация проходимости артериовенозной фистулы . (А) Ультразвуковая допплерография для определения проходимости АВФ. Характеристики патентованной фистулы включают артериальную и венозную дилатацию при визуализации в режиме В, турбулентный поток при цветном допплеровском анализе сосудистой сети левой подвздошной кости, пульсирующее спектральное расширение при пульс-волновой допплеровской оценке левых подвздошных сосудов, увеличение пиковой систолической и конечной диастолической скорости инфраренальной аорты и пульсации в НПВ с увеличением пиковой систолической скорости. Уменьшение или отсутствие кровотока в подвздошных сосудах указывает на недостаточность / тромбоз AVF. Метод дуплексного ультразвука предоставляет как морфологические, так и физиологические данные. Измерения скорости измеряются в миллиметрах в секунду. (B) Морфологическая оценка анастомоза AVF через 14 дней после образования свища. Изображения были испачканы трихромом Массона. Наблюдаются анатомические изменения в микроскопии серийных срезов от проксимальной (левый конец) до дистальной (правый конец) общей подвздошной артериовенозной анатомии. Окклюзия сосудистой сети из-за сгустка и/или чрезмерной неоинтимальной гиперплазии подтверждает недостаточность АВФ. Изображения имеют 10-кратное увеличение. A: Общая подвздошная артерия, V: Общая подвздошная вена. Масштабная линейка = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Патофизиологические характеристики до и после образования АВФ. Количественная оценка ультразвуковой визуализации при (A) диаметре инфраренальной аорты, (B) систолической скорости пика инфраренальной аорты, (C) диаметре нижней полой вены и (D) пиковой систолической скорости нижней полой вены до операции и на 3-й и 13-й дни после операции. Локальное измерение перфузии крови (лазерная допплерография) на (E) передней большеберцовой кости и (F) вентральной лапе перед операцией и в течение 2-недельного периода восстановления. Нейромоторное функциональное тестирование включало (G) силу хвата и (H) тест на беговой дорожке до и после операции. Данные были проанализированы с использованием двусторонней ANOVA, и при необходимости был проведен пост-фактум тест Тьюки. Значения являются средними ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 против Control_Sham. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, ####p < 0,0001 против CKD_Sham. N = 6-10/группа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторам раскрывать нечего.