Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анестезия и интубация предподростков мышиных щенков для кардиоторакальной хирургии

2.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64004

⸱

2 июня 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Cardiology and Biophysics Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent’s Clinical School, University of New South Wales Sydney, 3Department of Anaesthesia, The Children’s Hospital at Westmead, 4School of Child and Adolescent Health, University of Sydney

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Кардиоторакальные хирургические модели у мышей в возрасте >7 дней требуют интубации, но это сложно для предподростковых (8-14-дневных) щенков мышей, и существует мало информации о схемах анестезии для интубации. Здесь мы представляем схемы дозирования кетамина / ксилазина / атропина у 10-дневных детенышей мышей C57BL / 6J, которые позволяют эндотрахеальную интубацию, сводя к минимуму смертность животных.

Аннотация

Мышиные хирургические модели играют важную роль в доклинических исследованиях. Механистическое понимание регенерации миокарда после травмы сердца может быть получено из моделей кардиоторакальной хирургии у 0-14-дневных мышей, кардиомиоциты которых, в отличие от взрослых, сохраняют пролиферативную способность. Мышиные щенки до 7 дней эффективно обездвиживаются при переохлаждении и не требуют интубации для кардиоторакальной хирургии. Однако предподростковые (8-14-дневные) щенки мышей требуют интубации, но это сложно, и существует мало информации об анестезии для облегчения интубации. Здесь мы представляем схемы дозирования кетамина / ксилазина / атропина у 10-дневных детенышей мышей C57BL / 6J, которые позволяют эндотрахеальную интубацию, сводя к минимуму смертность животных. Эмпирическое титрование режимов дозирования кетамина/ксилазина/атропина к массе тела показало, что реакция на анестезию детенышей мышей разного веса была нелинейной, в результате чего дозы 20/4/0,12 мг/кг, 30/4/0,12 мг/кг и 50/6/0,18 мг/кг облегчали интубацию детенышей весом 3,15-4,49 г (n = 22), 4,50-5,49 г (n = 20) и 5,50-8,10 г (n = 20), соответственно. Щенки с нижней массой тела требовали больше попыток интубации, чем более тяжелые детеныши (p < 0,001). Выживаемость после интубации коррелировала с массой тела (59%, 70% и 80% для групп с низким, средним и высоким весом соответственно,R2 = 0,995). Для хирургии инфаркта миокарда после интубации хирургическую плоскость анестезии индуцировали 4,5% изофлураном в 100% кислороде и поддерживали 2% изофлураном в 100% кислороде. Выживаемость после операции была аналогичной для трех весовых групп на 92%, 86% и 88% (p = 0,91). Вместе с усовершенствованиями в практике обращения с животными для интубации и хирургии и минимизацией каннибализации после операции, общая выживаемость за всю процедуру (интубация плюс хирургия) коррелировала с массой тела (55%, 60% и 70% для групп с низким, средним и высоким весом, соответственно,R2 = 0,978). Учитывая трудности, возникающие при интубации 10-дневных щенков и связанную с этим высокую смертность, мы рекомендуем кардиоторакальную хирургию у 10-дневных щенков ограничить щенками весом не менее 5,5 г.

Введение

Мышиные модели являются бесценными инструментами в доклинических кардиоторакальных исследованиях, в частности, из-за легкости, с которой могут быть сгенерированы генетически модифицированные линии мыши, а также легкости, с которой мышей можно хирургически манипулировать, чтобы обеспечить патологические модели заболеваний, позволяющие, например, изучать регенерацию миокарда после сердечной травмы1. . В связи с этим интересно, что, в отличие от взрослых мышей, у которых кардиомиоциты выведены из клеточного цикла, 0-2-дневные сердца мышей неонатального возраста восстанавливаются с минимальным рубцеванием после апикальной резекции или индукции инфаркта миокарда 2,3,4. Напротив, 7-дневные неонатальные сердца регенерируют неполностью с более высокой частотой рубцевания 2,3. Поскольку кардиомиоциты в верхушке левого желудочка сохраняют пролиферативную способность до 2 недель после рождения, механистические исследования регенерации после повреждения сердца у 0-14-дневных мышей могут быть информативными для выявления терапевтических мишеней для регенерации поврежденного сердца взрослого человека5.

Разработка мышиных моделей сердечной травмы предполагает хирургические манипуляции под наркозом. Это требует, чтобы грудная клетка была открыта для доступа к сердцу, что, как правило, требует интубации и механической вентиляции. Напряжение мыши, масса тела и возраст влияют на чувствительность к анестетикам6. Взрослые мыши могут быть обезболены широким спектром агентов, общим режимом интубации является кетамин / ксилазин / атропин при 100/13 / 0,5 мг / кг 6,7. Неонатальные мыши (0-7 дней) не имеют централизованного болевого рефлекса, и могут быть эффективно обездвижены на льду и подвергнуты хирургическому вмешательству без интубации 6,8,9. Предподростков (8-14-дневных) детенышей мышей нельзя анестезировать при переохлаждении 9,10; они требуют интубации для кардиоторакальной хирургии. Нет предыдущих исследований кардиоторакальной хирургии у предподростков в возрасте до 14 дней. По нашему опыту, интубация изофлурано-анестезирующих предподростков мышей в возрасте до 14 дней затруднена. Рекомендуемый режим инъекционного анестетика, о котором сообщалось для мышей старше 7 дней, составляет 50-150 мг / кг кетамина и 5-10 мг / кг ксилазина10. Предподростковые мыши все еще развиваются неврологически, и их реакции на лекарства и метаболизм лекарств сильно отличаются от взрослых животных6. Это создает повышенный риск дисбаланса жидкости, электролитов и кислотно-щелочных оснований, а также гипогликемии и гипотермии не только из-за их высокой скорости метаболизма, которая быстро истощает их ограниченные запасы энергии, но и из-за их терморегуляторной незрелости 6,11,12. Таким образом, существует мало информации о схемах анестезии, которые одновременно облегчают интубацию и максимизируют выживаемость предподростков мышей.

Здесь мы эмпирически титровали режимы дозирования кетамина/ ксилазина / атропина у 10-дневных детенышей мышей C57BL / 6J весом от 3 до 8 г для достижения плоскости анестезии, достаточной для интубации эндотрахеи для последующей кардиоторакальной хирургии, при минимизации смертности животных. Мы также усовершенствовали методы обращения с животными, чтобы снизить смертность от интубации, хирургии и послеоперационного материнского каннибализма.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике животных больницы Гарвана / Сент-Винсента в соответствии с Австралийским кодексом практики по уходу и использованию животных в научных целях и руководящими принципами ARRIVE, и все эксперименты были выполнены опытным хирургом мелких животных (JW) под руководством детского анестезиолога (JJS).

1. Подготовка инструментов

  1. В день операции устанавливают специализированное оборудование для интубации 10-дневных щенков (рисунок 1А,В). Это включает в себя нагревательную лампу, интубационную платформу, волоконно-оптический свет, небольшие щипцы, ларингоскоп, изготовленный из куска медной проволоки диаметром 0,02 мм (длиной 60 мм с концом проволоки, вылепленным в круг диаметром 3 мм под углом 175°; Рисунок 1B) и пластиковую внутривенную (т.е.в.) канюлю 24-го калибра, которая используется в качестве эндотрахеальной трубки.
  2. Убедитесь, что канюля состоит из пластиковой трубки длиной 19 мм (0,7 мм OD), прикрепленной к 21-миллиметровому пластиковому адаптеру замка luer (рисунок 1B). Укрепите трубку канюли, вставив кусок медной проволоки через адаптер замка luer. Используйте канюлю общим объемом 130 мкл для мыши с приливным объемом ~8 мкл/г13,14.

2. Анестезия 10-дневных мышей

  1. В день операции извлеките дамбу из клетки 10-дневных щенков C57BL/6J и поместите клетку на согревающую площадку (37 °C).
  2. Обезболить детенышей по 10 мкл на г массы тела внутрибрюшинной инъекцией с использованием инсулинового шприца 0,5 мл и иглы 29 г с кетамином/ксилазином/атропином в соотношениях, описанных в таблице 1 для различных весовых групп.
  3. Сразу после инъекции поместите щенка в подогретую (37 °C) камеру из плексигласа, которая была предварительно насыщена кислородом 100% кислородом.

3. Интубация 10-дневных мышей

  1. После 3-4 мин оксигенации переведите щенка на площадку для интубации по существу как у взрослых мышей. Выполните это со щенком в положении лежа на спине (рисунок 1С) или подвешенным под углом 45°15. Поддерживайте температуру с помощью нагревательной лампы.
    1. Перед интубацией оцените глубину анестезии по рефлексу защемления лапы. Для оптимальной интубации рефлекс защемления лапы все еще должен присутствовать, но заметно уменьшен по сравнению с рефлексом сознательного животного.
  2. После закрепления обезболенного щенка лежа на спине к интубационной платформе (рисунок 1С) зажмите язык небольшими щипцами и используйте ларингоскоп, изготовленный из куска медной проволоки (рисунок 1B), чтобы обнажить голосовую щель и голосовые связки. Помощь в визуализации голосовых связок путем транс-освещения с помощью гибкого волоконно-оптического света (рисунок 1D).
  3. Используя жесткую канюлю, наклоните канюлю так, чтобы конец замка луера был немного ниже (~ 10 °), чем наконечник, и как только голосовые связки отделяются, вставьте канюлю и продвигайте ее, пока адаптер замка люера не окажется прямо за пределами рта. Снимите проволоку сразу после интубации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: У мышей этого возраста не ожидается резистентности во время интубации, если только канюля не продвинулась слишком далеко, и сопротивление не ощущается от киля.
    1. Оцените глубину анестезии после интубации по способности животного дышать спонтанно. Подтвердите успешную интубацию трахеи спонтанно дышащих детенышей, ненадолго заблокировав катетер интубации, чтобы проверить, что это предотвращает движение грудной клетки.
  4. Немедленно переведите интубированного щенка на согревающую прокладку (37 °C) и подключите эндотрахеальную канюлю к вентилятору, доставляющему 100% кислорода со скоростью потока 1 л/мин с 30 мкл/ход, 40 мкл/инсульт или 50 мкл/инсульт в течение 3,15-4,59 г, 4,50-5,49 г или 5,50-8,10 г детенышей соответственно и 150 ударов/мин.
  5. Выполняйте эти процедуры быстро, в течение <15 с, чтобы свести к минимуму повторное дыхание.

4. Хирургия инфаркта миокарда 10-дневных мышей

  1. Чтобы вызвать хирургическую плоскость анестезии для операции, переключите газ, поступающий в вентилятор, со 100% кислорода на 4,5% изофлурана в кислороде (концентрация изофлурана определяется испарителем) на 4-5 мин.
    1. После перехода на изофлуран еще раз подтвердите интубацию трахеи, проверив, что частота движения грудной стенки равна частоте движения вентилятора. Потеря спонтанного дыхания с последующим отсутствием рефлекса защемления хвоста или лапы свидетельствует о том, что хирургическая плоскость анестезии достигнута (через 4-5 мин).
  2. Поддерживайте анестезию с 2% изофлураном в кислороде.
  3. Выполняйте операции по инфаркту миокарда под хирургическим микроскопом (объектив 10x и 16x), как описано в16.
    1. Продезинфицируйте кожу круговыми движениями несколько раз чередующимися раундами скраба на основе йода или хлоргексидина и 70% спирта. С помощью тонких ножниц сделайте горизонтальный кожный разрез между третьим и четвертым ребром (четвертым межреберным пространством) в левой боковой стенке грудной клетки. Используя тонкие щипцы, откройте грудную клетку тупым рассечением межреберного пространства и используйте втягивающее устройство, чтобы сохранить пространство открытым.
    2. Индуцировать инфаркт миокарда путем перевязки левой коронарной артерии только дистально к левому предсердному придатку с 9-0 полипропиленовым монофиламентным швом. После операции инфаркта ~10 мин закройте кожу 7-0 проленом и продезинфицируйте разрез бетадином. Очистите щенка от крови 70% этанолом или физиологическим раствором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перевязка левой коронарной артерии у предподростков детенышей по существу бескровна, как и при перевязках у взрослых.
    3. Вводят один за другим с инсулиновым шприцем 0,5 мл и иглой 29 г: атипамезол (1-5 мг/кг, 10 мкл, внутрибрюшинный) для быстрого восстановления после седации, анальгезии (бупренорфин, 0,075 мг/кг, 10 мкл, подкожный) и физиологический раствор (50 мкл, внутрибрюшинный).
  4. Позвольте животным восстановиться, прекратив прием изофлурана. Убедитесь, что спонтанное дыхание возобновляется в течение нескольких минут после этого.
    1. Верните щенка в нагретую предварительно насыщенную кислородом камеру и непрерывно контролируйте во время восстановления, пока не восстановится корректирующий рефлекс, после чего экстубируйте щенка.
    2. Аккуратно потрите щенка домашней подстилкой в клетке, держите щенка в тепле, убедитесь, что дыхание регулярное, и что щенок способен к спонтанному движению. Это уменьшит послеоперационный каннибализм у плотины.
  5. Верните плотину в клетку, когда все щенки полностью восстановятся после анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время, затрачиваемое на подготовку, анестезию, интубацию, операцию и восстановление одного щенка, может варьироваться от 40 до 60 минут.
  6. Домашняя плотина и щенки на ночь в клетке, помещенной наполовину / наполовину от нагревательной площадки 37 ° C.

5. Послеоперационная оценка размера инфаркта

  1. На3-й день после операции обезболивают детенышей, помещая их в камеру из плексигласа, предварительно уравновешенную 4,5% изофлурана в кислороде со скоростью потока 1 мл / мин.
  2. После того, как хирургическая плоскость анестезии была достигнута (через 4-5 мин), оцененная рефлексом защемления лапы, извлеките щенка из камеры и закрепите в положении лежа на спине на согревающей подушке, заклеив хвост.
  3. Поместите резьбу на резцы и ленту в положение, чтобы держать голову вытянутой, и поместите голову в носовой конус, соединенный с вентилятором, доставляющим 4,5% изофлурана в кислороде при 200 мкл / ход, 150 ударов / мин. Поддерживайте хирургическую плоскость анестезии с 2% изофлураном в кислороде.
  4. Дезинфицируйте кожу 70% этанолом. Используя тонкие ножницы, сделайте разрез 1 см в коже над правой общей сонной артерией вдоль трахеи и канюлюцируйте открытый сосуд с помощью одной полиэтиленовой трубки просвета (OD 0,61 мм, ID 0,28 мм) для введения 0,2 мл гепаринизированного физиологического раствора (200 U) в течение 1 мин для предотвращения свертывания крови.
  5. Увеличивают изофлуран до 4,5% в кислороде в течение 1 мин перед быстрым введением 0,2 мл 3,3 М ККл в течение 2 с для остановки сердца в диастоле.
  6. Рассекните правую яремную вену через тот же разрез и перерегите ее. Перфузируйте сердце 0,2 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), а затем перфьюируйте 0,1 мл 0,2% Alcian Blue, чтобы окрасить неинфарктный удаленный миокард. Проверьте успешную перфузию, о чем свидетельствует вымывание крови, PBS, а затем Alcian Blue через яремную вену.
  7. Откройте грудную клетку и иссекните сердце, рассекая окружающую соединительную ткань и сосуды, чтобы освободить сердце. Промыть сердце в PBS, удалить предсердия, если это необходимо, и сфотографировать сердце с помощью камеры, установленной на хирургическом микроскопе с использованием 10-кратного объектива.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Анестезия 10-дневных мышей. 10-дневных детенышей можно обезболить 4,5% изофлураном через 4-5 мин; однако они восстанавливаются после анестезии в процессе подготовки к интубации. Из-за их небольших размеров интубация под изофлурановой анестезией, доставляемой стандартным носовым конусом, невозможна. Ранее мы использовали схему анестезии кетамина / ксилазина / атропина 100/13 / 0,5 мг / кг, соответственно, для кардиоторакальной хирургии у 15- и 21-дневных щенков и взрослых 4,7<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящее время не существует хорошо документированных методов анестезии и интубации 10-дневных мышей для кардиоторакальной хирургии. С этой целью мы титровали схемы дозирования кетамина/ксилазина/атропина по массе тела, в результате чего дозы 20/4/0,12 мг/кг, 30/4/0,12 мг/кг и 50/6/0,18 мг/кг облегчали интубацию детенышей с низкой (3,15-4,49 г), средней (4,50-5,49 г) и высокой (5,50-8,10 г) массой тела соответственно. Выживаемость после интубации коррелировала с массой тела (59%, 70% и 80% для групп с низким, средним ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом программы NHMRC [ID 1074386], грантом Leducq Transatlantic Network of Excellence in Cardiovascular Research (RMG) и грантом RT Hall Trust [RMG & SEI].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Атипамезол (антиседан)Provet (NSW) Pty LtdATIP I
Atropine 600 мкг/млClifford Hallam Healthcare Pty Ptd1957699 PFIZER-0143386
BetadineLivingstone InternationalBU0520
Бупренорфин (Temgesic)Provet (NSW) Pty LtdTEMG I
Волоконно-оптический светLeica 3011350CLS 150X
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCВерсия 9.1.2
Платформа для интубации --Любая прочная коробка (например, пластиковая коробка для наконечников) с приблизительными размерами 12 (Д) x 8,5 x (Ш) x 7,5 см (H)
IsofluraneProvet (NSW) Pty LtdISOF 07
Кетамин 100 мг/млProvet (NSW) Pty LtdKETAI1
Пластиковая внутривенная канюля 24-го калибра Polywin Safety BD Insyte CE0086Пластиковая трубка длиной 19 мм (наружный диаметр 0,7 мм) прикреплена к пластиковому адаптеру Luer Lock диаметром 21 мм; общий объем кольцевого кольца 130 мкм; L
Однопросветная полиэтиленовая трубкаCritchley Electrical Products Pty Ltd Оберн, Новый Южный УэльсВнешний диаметр 0,61 мм, внутренний диаметр 0,28 мм
Маленькие щипцыF.S.T.No 11051-10
Хирургический микроскоп (камера опционально)Leica M651 (камера Leica IC80 HD)10x и 16x объектив
Шов 7-0 проленовыйEthicon8708H
Шов 9-0 полипропиленовая мононитьEthicon2813
V-1 Столешница с активной очисткой изофлурановая анестезия системаVetEquip901820
Вентилируемая индукционная камера из плексигласа 2 литраVetQuip Pty Ltd94210225 см (Д) x 13 см (Ш) x 11 см (H)
Согревающая лампаBrilant Lighting99223
XylazineProvet (NSW) Pty LtdXYLA Z 2

Ссылки

  1. Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovascular Research. 74 (1), 29-38 (2007).
  2. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  3. Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
  4. Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
  5. Bogush, N., et al. DUSP5 expression in left ventricular cardiomyocytes of young hearts regulates thyroid hormone (T3)-induced proliferative ERK1/2 signaling. Scientific Reports. 10 (1), 21918(2020).
  6. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. Third edition. , Elsevier Inc. (2009).
  7. Iismaa, S. E., et al. Cardiac hypertrophy limits infarct expansion after myocardial infarction in mice. Scientific Reports. 8 (1), 6114(2018).
  8. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
  9. Boston University Institutional Animal Care and Use Committee. Anesthesia and Analgesia: Neonatal Mice and Rats. , Available from: https://www.bu.edu/researchsupport/compliance/animal-care/working-with-animals/anesthesia/anesthesia-and-analgesia-neonatal-mice-and-rats-iacuc/ (2019).
  10. University of Texas at Austin Animal Resources Center. Mouse-Specific Anesthesia Guidance. , Available from: https://research.utexas.edu/qpcontent/uploads/sites/7/2020/02/Mouse_Anesthesia_guidance_ARC_112519.pdf (2019).
  11. Paddleford, R. Manual of Small Animal Anaesthesia. Second edition. , Masson. (2000).
  12. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 53 (1), 55-69 (2012).
  13. Daubenspeck, J. A., Li, A., Nattie, E. E. Acoustic plethysmography measures breathing in unrestrained neonatal mice. Journal of Applied Physiology. 104 (1), 262-268 (2008).
  14. Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visulaized Experiments. (90), e51755(2014).
  15. Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
  16. Du, X. -J., Gao, X., Ramsey, D. Surgical methods of inducing transverse aortic stenosis and myocardial infarction in the mouse. Asia Pacific Heart Journal. 7 (3), 187-192 (1998).
  17. Wu, J., et al. Anesthesia and intubation of 10-Day old C57BL/6J mouse pups for cardiothoracic surgery. Research Square. , (2021).
  18. Silver, L. M. Mouse Genetics: Concepts and Applications. Mouse Genome Informatics, The Jackson Laboratory. , (2008).
  19. West, G. B., Woodruff, W. H., Brown, J. H. Allometric scaling of metabolic rate from molecules and mitochondria to cells and mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 1 2473-2478 (2002).
  20. Moscovitz, J. E., Aleksunes, L. M. Establishment of metabolism and transport pathways in the rodent and human fetal liver. International Journal of Molecular Science. 14 (12), 23801-23827 (2013).
  21. Blevins, C. E., Celeste, N. A., Marx, J. O. Effects of oxygen supplementation on injectable and inhalant anesthesia in C57BL/6 mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 60 (3), 289-297 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Анестезия и интубация предподростков мышиных щенков для кардиоторакальной хирургии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.