Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение роста скелетных мышц в реальном времени у отдельных живых рыбок данио, подвергшихся измененной электрической активности

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64063

⸱

16 июня 2022 г.

 ,  ,  , 
1Randall Centre for Cell and Molecular Biophysics, School of Basic and Medical Biosciences, King’s College London

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Оптическая прозрачность является основным преимуществом для биологической и физиологической работы клеток у рыбок данио. Описаны надежные методы измерения роста клеток у отдельных животных, которые позволяют по-новому взглянуть на то, как рост скелетных мышц и соседних тканей интегрирован с ростом всего тела.

Аннотация

Ряд методов может быть использован для визуализации отдельных клеток по всему телу живых эмбриональных, личиночных или молодых рыбок данио. Показано, что живые рыбы с флуоресцентно-маркированными плазматическими мембранами могут быть отсканированы в конфокальном лазерном сканирующем микроскопе с целью определения объема мышечной ткани и количества присутствующих мышечных волокон. Эффективные подходы к измерению количества и размера клеток у живых животных с течением времени описываются и проверяются с помощью более сложных методов сегментации. Описаны методы, позволяющие контролировать электрическую и, следовательно, сократительную активность мышц. Потеря сократительной активности скелетных мышц значительно снижает рост мышц. У личинок описан протокол, позволяющий повторно вводить узорчатую электрическую сократительную активность. Описанные методы минимизируют влияние межиндивидуальной изменчивости и позволят проанализировать влияние электрических, генетических, лекарственных или экологических стимулов на различные клеточные и физиологические параметры роста в контексте живого организма. Впоследствии может быть выполнено долгосрочное наблюдение за измеренными эффектами определенного вмешательства в раннем возрасте на людей.

Введение

Регулируемый рост тканей, включающий увеличение количества клеток (гиперплазия) и / или размера клеток (гипертрофия), является решающим фактором развития, регенерации и экологической и эволюционной адаптации. Несмотря на огромные успехи в молекулярно-генетическом понимании как клеточной биологии, так и биологии развития за последние десятилетия, механистическое понимание регуляции размера тканей и органов все еще находится в зачаточном состоянии. Одной из причин этого пробела в знаниях является сложность количественной оценки роста тканей в живых организмах с необходимой пространственной и временной точностью.

Различные аспекты роста целых организмов могут быть измерены многократно с течением времени, выявляя кривые роста для каждого отдельного 1,2,3,4,5. Все более сложные методы сканирования, такие как двойная рентгеновская абсорбциометрия (DXA), компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ), позволяют отслеживать рост целых органов и других областей тела (например, отдельных идентифицированных скелетных мышц) у отдельных людей, как человека, так и в модельных организмах 6,7,8,9,10 . Тем не менее, эти методы еще не имеют разрешения для выявления отдельных клеток, и, таким образом, связи между клеточным поведением и ростом на уровне тканей было трудно различить. Чтобы установить такие связи, традиционные исследования часто опирались на когорты похожих отдельных животных, некоторые из которых приносятся в жертву в последовательные моменты времени, а затем анализируются в цитологических деталях. Такие подходы требуют усреднения наблюдаемых изменений по группам (предпочтительно похожих, но, тем не менее, переменных) людей и, таким образом, страдают от отсутствия временного и пространственного разрешения, что затрудняет поиск коррелированных событий на клеточном уровне, наводящих на мысль о причине и следствии.

Исследования на модельных организмах беспозвоночных, первоначально у C. elegans и D. melanogaster, обошли эти проблемы, разработав оптическую микроскопию для достижения клеточного разрешения и точного измерения роста с течением времени у отдельных особей. Такие исследования выявили поразительно инвариантное поведение клеточной линии в росте этих небольших модельных организмов 11,12,13,14,15,16,17. Тем не менее, многие животные, включая всех позвоночных, имеют неопределенные клеточные линии и контролируют рост тканей с помощью таинственных процессов обратной связи, которые служат для превращения генетически закодированной программы роста в функциональный трехмерный организм со всеми составляющими его тканями и органами, соответствующим образом подобранными по размеру. Чтобы понять эти сложные процессы роста, желательно изобразить целые ткани или органы с течением времени у отдельных людей, которыми можно экспериментально манипулировать с помощью генетических, фармакологических или других вмешательств в выбранное время и последующего анализа эффекта.

Каждая скелетная мышца позвонка имеет определенный размер, форму и функцию, а также хорошо охарактеризованные взаимодействия с соседними тканями, такими как кости, сухожилия и нервы. Некоторые мышцы маленькие, лежат прямо под кожей и поэтому являются хорошими кандидатами для исследований с высоким разрешением. Подобно большинству органов, каждая мышца растет на протяжении всей эмбриональной, постнатальной и ювенильной жизни, прежде чем достичь стабильного взрослого размера. Мышцы, однако, также обладают уникальной способностью изменять размер во взрослой жизни, в зависимости от использования и питания18, и это свойство оказывает серьезное влияние на физическую форму организма, спортивные результаты и независимую жизнь. Потеря мышечной массы и функции в пожилом возрасте, саркопения, является проблемой растущей обеспокоенности для обществ, сталкивающихся со старением населения 19,20,21.

Мы и другие сосредоточились на росте определенных блоков скелетной мышечной ткани в сегментно-повторяющемся теле личинок рыбок данио, как внешне замкнутой системы, содержащей несколько сотен клеток, в которых можно наблюдать рост, поддержание и восстановлениетканей и манипулировать 22,23,24,25,26. В то время как ранее сообщалось онекоторых количественных работах 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, нет подробного и проверенного метода измерения роста мышц в клеточных деталях у отдельных организмов позвоночных с течением времени. Здесь описан эффективный протокол выполнения таких повторных измерений наряду с валидацией и приведен пример его использования для анализа изменений как гипертрофического, так и гиперпластического роста в ответ на измененную электрическую активность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные исследования проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами и под соответствующими лицензиями Министерства внутренних дел Великобритании в соответствии с Законом о животных (научные процедуры) 1986 года и последующими изменениями. Эмбрионы/личинки следует выращивать при 28,5 °C до завершения гаструляции, но затем их можно держать при 22-31 °C для контроля скорости развития. Рыбу можно сканировать или стимулировать при комнатной температуре.

1. Обезболивание личинок рыбок данио

  1. Скрещивайте подходящих флуоресцентных репортерных взрослых рыб, таких как Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg reference36 или Tg(α-actin:mCherry-CAAX)pc22Tg reference37 и собирайте эмбрионы, как описано38.
  2. В момент выбора, например, через 2 дня после оплодотворения (dpf), ненадолго обезболивайте эмбрионы, используя трикаинсодержащую рыбью среду (либо рыбью воду, либо среду E3), и экранируйте EGFP или mCherry под флуоресцентным микроскопом, таким как Leica MZ16F. Если у вас много эмбрионов, выберите эмбрионы с самым ярким сигналом. Верните эмбрионы в нормальную рыбью среду сразу после скрининга.

2. Крепление рыбы для конфокального сканирования

  1. Включите конфокальную лазерную сканирующую систему и лазеры, чтобы система стабилизировалась в течение 30-60 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы использовали микроскоп Zeiss LSM 5 Exciter с вертикальной подставкой для материалов (которая увеличивает рабочее расстояние), оснащенную водоиммерным объективом 20x/1.0 W.
  2. Приготовьте 1% низкоплавкой агарозы (LMA) и храните в тепловом блоке при температуре 37 °C для повторного использования в пробирке объемом 1,5 мл. Чтобы избежать теплового удара, удалите аликвоту LMA из теплового блока и дайте ей остыть до уровня чуть выше установки перед нанесением на личинку, тестируя кожу, чтобы судить о соответствующей температуре, как при оценке температуры молочных смесей.
  3. Выберите рыбу для установки и временно обезболивайте каждую рыбу по очереди трикаином (0,6 мМ в рыбной среде).
  4. Возьмите чашку Петри диаметром 60 мм, покрытую слоем 1% агарозы, и поместите на сцену рассекающего микроскопа.
  5. Переложите личинку пластиковой пипеткой Пастера объемом 1 мл на чашку Петри с покрытием 60 мм и удалите как можно больше переносимой среды. Затем, все еще используя пипетку Пастера, поместите от 5 до 10 капель LMA на рыбу и быстро расположите горизонтально в боковом виде с щипцами (или огнеполированной тонкой стеклянной иглой) до того, как LMA установится. Для оптимальной визуализации желательно расположить личинку близко к верхней поверхности LMA.
    1. Альтернативно, используя пластиковую пипетку Пастера объемом 1 мл, соберите личинку с как можно меньшим количеством рыбьей среды и перенесите личинку в аликвоту охлажденного LMA. Дайте личинке опуститься на 5 секунд, чтобы полностью окружиться LMA. Затем извлеките личинку и перенесите ее в капле LMA на чашку Петри, покрытую агарозой. Быстро ориентируйтесь и позиционируйте личинку, как описано выше.
  6. Ориентируйте личинку как переднезадней, так и дорсовентральной осями в пределах 10° от горизонтали (см. примечание «Об ошибке и ее исправлении» в пункте 4.6 ниже).
    1. Если личинка неправильно закреплена горизонтально вблизи поверхности агарозной капли, удаляют и повторно встраивают. Личинки могут быть легко извлечены путем мягкого всасывания с использованием микротонкой пластиковой пипетки Пастера объемом 1 мл, а LMA может быть аккуратно удалена с помощью Kimwipes. Практика действительно делает совершенным в процедуре монтажа; проведите день, встраивая некоторых неважных личинок, прежде чем попробовать это в реальном эксперименте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: О конструкции микроскопа: Многие лаборатории используют инвертированные конфокальные микроскопы для визуализации через крышку. Мы обнаружили, что повторное внедрение и удаление рыбы, содержащейся в агарозе под покровом для наблюдения в перевернутом микроскопе, приводит к большей потере образцов при повторном сканировании, чем в описанной процедуре с помощью вертикального микроскопа. По этой причине рекомендуется использовать вертикальную систему, если таковая имеется. Тем не менее, ключом к высокому качеству данных является правильный выбор и использование объективных и сканирующих параметров, тема, слишком большая для обсуждения здесь.

3. Конфокальное сканирование

  1. Когда LMA установится, наполните блюдо около 10 мл рыбной среды, содержащей трикаин. Если планируется захват конфокальных стеков, дайте конной рыбе отдохнуть не менее 10 минут, прежде чем приступить к сканированию, так как возникает некоторое набухание агарозы.
  2. Загрузите блюдо с образцом на стадию конфокальной системы, найдите личинку и сосредоточьтесь на нужном сомите. Somite 17 может быть выбран из-за его легкости локализации вблизи анального отверстия и легкости визуализации. Проверьте, отсчитывая сомиты спереди.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первый сомит слит за ухом и не имеет передней границы, но можно легко наблюдать за поперечно-полосатыми мышечными волокнами.
  3. Настройтесь так, как если бы захватывали Z-стек, определяя верх (т.е. чуть выше кожи) и низ (т.е. чуть ниже нотохорды, чтобы включить весь сомит, даже если рыба смонтирована слегка перекошенной). Как левая, так и правая стороны могут быть захвачены по желанию. Это гарантирует, что все быстрые сканирования YZ захватывают желаемые области.
  4. Запишите XY-образ следующим образом. Ориентируйте область сканирования по отношению к рыбе, как позволяет конфокальное программное обеспечение. Расположите рыбу с переднезадней осью, параллельной изображенной оси X , и дорсовентральной осью параллельно оси Y с сомитом 17 в центре поля, как показано в дополнительном файле 1. Сосредоточьтесь на плоскости среднего уровня в самом верхнем миотоме, в которой видны целые половинки эпаксиального и гипаксиального сомита вместе с вертикальной и горизонтальной миосептой, и захватывайте изображение высокого разрешения XY . Не забудьте назвать и сохранить изображение.
  5. Захватите одно или несколько изображений YZ следующим образом. В репрезентативных результатах (ниже) сравнивается точность 2-срезовых и 4-срезовых методов. В 2-срезовом подходе используются одиночные сканирования XY и YZ . В 4-срезовом подходе три сканирования YZ усредняются, чтобы дать более точную оценку объема миотомы. Если это требуется конфокальным программным обеспечением, переориентируйте поле сканирования.
    1. Нарисуйте точно дорсальную и вентральную линию через выбранный сомит перпендикулярно переднезадней оси рыбы в выбранном переднезаднем положении. Выполните сканирование линии Z-стека.
    2. Повторите сканирование линии YZ три раза в определенных переднезадних положениях вдоль выбранного миотома, чтобы захватить YZa, YZm и YZp. Репрезентативные результаты показаны на рисунке 2А. Назовите и сохраните эти изображения вместе с соответствующим изображением XY .
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе плоскостей YZ : Миотома имеет V-образную форму и ее форма изменяется во время роста. Для получения наиболее точной оценки объема миотомы 17 методом 4 слайса позиционируют YZa на переднем кончике миотомы, YZp на задних кончиках миотомы в дорсальном и вентральном крайних точках и YZm на полпути между YZa и YZp. Предполагая, что сомит сужается равномерно, среднее значение измерений из каждого участка YZ будет представлять миотому в целом. Для 2-срезового метода одно сканирование YZ должно быть расположено на заднем конце горизонтального миосептума, что примерно соответствует переднезаднему центру интересующей миотомы (например, YZm). Альтернативно, набор из трех секций YZ может быть взят в передней, средней и задней части горизонтального миосектума, но, как показано ниже, такое измерение будет немного завышать или недооценивать объем миотомы (для ростральных и каудальных сомитов, соответственно, из-за сужения миотомы). По сути, последовательность в позиционировании плоскости (плоскостей) среза YZ между рыбами и экспериментами является ключом к воспроизводимости.

4. Анализ

  1. Поскольку миотома меняет размер вдоль рыбы градуированным образом, всегда работайте с одним и тем же сомитом в сравнительных исследованиях.
  2. Чтобы измерить и рассчитать объем миотомы, используйте конфокальное программное обеспечение (например, файлы .lsm, созданные с помощью программного обеспечения Zeiss ZEN microscope) или универсальное программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом, такое как Fiji / ImageJ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При изменении форматов файлов убедитесь, что размер Z-шага передан правильно, так как не все программы могут правильно читать проприетарные конфокальные форматы файлов. Например, чтобы импортировать изображение сканирования строки ZEN на Фиджи, сначала используйте команду Файл/Экспорт для экспорта в качестве .tif в окне Изображение с полным разрешением - одноплоскостной формат, а затем импортируйте в Фиджи. Хотя YZ scan.lsm можно открыть непосредственно на Фиджи, результирующие изображения YZ обычно сжимаются в измерении Z из-за неправильной оценки размера шага Z .
  3. Анализ с использованием ZEN
    1. Сначала откройте файлы XY scan.lsm в ZEN. Перейдите на вкладку Графика и выберите инструмент «Линия». Проведите линию между двумя вертикальными миозептами сомита 17, охватывающую всю длину миотомы (параллельную переднезадней оси рыбы). Установите флажок M, чтобы показать значения измерения (Длина = 89,71 мкм, см. Дополнительный файл 2).
    2. Откройте файлы YZ scan.lsm. На вкладке Графика выберите инструмент Закрытый Безье . Нарисуйте по периметру миотомы. После завершения установите флажок M, это покажет значение измерения (Площадь = 11980,01 мкм2, см. Дополнительный файл 3).
    3. Запишите значения каждого измерения вручную в электронную таблицу. Усредните измерения CSA по мере необходимости. Объем миотомы может быть рассчитан как Объем = Длина миотома x CSA, т.е. 89,71 мкм x 11980,01 мкм2 = 1,075 x 106 мкм3.
  4. Анализ с использованием Fiji/ImageJ
    1. Откройте файлы XY scan.lsm на Фиджи/ImageJ. Проверьте, правильно ли откалиброваны изображения XY , непосредственно открытые на Фиджи, по шкале, как это и должно быть.
    2. Выберите инструмент «Прямая линия » из значков. Проведите линию по длине сомита 17, как описано в шаге 4.3.1. Задайте параметры измерения, перейдя в раздел Анализ, затем выберите Установить измерения..., и установите следующие флажки Область и Метка дисплея. Чтобы измерить, просто нажмите горячую клавишу M или перейдите в меню Анализ и выберите Измерить. В результате появится всплывающее окно со списком всех значений измерений (например, Длина = 90,023 мкм; см. Дополнительный файл 4). Результаты могут быть сохранены в виде .csv и открыты в Microsoft Excel или аналогичном для последующего анализа.
    3. Чтобы измерить CSA на изображениях YZ , откройте изображения YZ в формате .tif, как описано в шаге 4.2.
    4. Откалибруйте изображения YZ .tif, так как они не калибруются при экспорте. Параметры калибровки можно получить в ZEN, перейдя в раздел Информация выбранных изображений: запишите значения Scaling X (0,489 мкм) и Scaling Z (0,890 мкм; см. Дополнительный файл 5). Затем, когда изображения открыты на Фиджи, перейдите в раздел Изображение и выберите Свойства.... Введите 0,489 мкм для ширины пикселя и высоты пикселя и 0,890 мкм для глубины вокселя. Установите флажок Глобальный , чтобы применить калибровку повсеместно, если предполагается повторное измерение изображений YZ (см. Дополнительный файл 6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все изображения YZ сняты с использованием одних и тех же параметров сканирования; перезапустите Fiji/ImageJ или измените значения калибровки, если требуется новый набор калибровки.
    5. Чтобы измерить CSA калиброванных изображений YZ , выберите инструмент «Выделение полигонов» на значках. Нарисуйте по периметру сомита и нажмите клавишу M , чтобы показать значения измерения (Площадь = 11980,395 мкм2; см. Дополнительный файл 7). Объем миотомы может быть рассчитан как Объем = Длина миотома x CSA, т.е. 90,023 мкм x 11980,395 мкм2 = 1,079 x 106 мкм3.
    6. Повторите измерения на других изображениях XY и YZ . Рекомендуется использовать одно и то же программное обеспечение для всех измерений в экспериментальной серии для согласованности. Оценка объема по каждому программному обеспечению одинакова, но не идентична из-за различных инструментов рисования, т.е. ZEN = 1,074 × 106 мкм3 и Fiji/ImageJ = 1,079 × 106 мкм3. Рост миотомы между двумя временными точками (т.е. от 3 до 4 dpf) может быть рассчитан как: (Том 4 dpf - Том 3 dpf)/ Том 3 dpf × 100%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Об ошибке и ее исправлении. Во время монтажа рыба должна быть ориентирована своей сагиттальной плоскостью (т.е. переднезадней и дорсовентральной осями) как можно ближе к горизонтали, чтобы избежать рыскания и крена соответственно. Это связано с тем, что как длина миотомы L, измеренная при сканировании XY , так и CSA, измеренная при сканировании YZ , будут переоценены, если рыба показывает рыскание (вращение вокруг дорсовентральной оси) из-за наклонного переднезадней установки. Ни тангаж, ни крен во время монтажа не должны влиять на измерения после сканирования, как описано в разделе 3. Тем не менее, дорсовентральное вращение (рулон) ухудшает качество изображения. Простая тригонометрия показывает, что до 10° рыскания даст 3% погрешность измерения объема, так как измеренные L и CSA увеличиваются пропорционально (cosq)-1, где q - угол в сторону от переднезадней горизонтали (рыскание). 15° и 20° отключения дадут 7% и 13% завышенных оценок объема соответственно.
      Поскольку нотохорда является цилиндрической, включение всей нотохорды в сканирование YZ может быть использовано для расчета угла и степени наклона от ориентации и величины большой и малой осей и тем самым корректировки измеренных L и CSA для максимальной точности. Скорректированный CSA = Измеренный CSA x Нотохорд минорная ось/Нотохорд большая ось. Скорректированная L = Измеренная малая ось L x Нотохорда/Нотохорда в направлении Z микроскопа.
      Дальнейшее рассмотрение позволяет дополнительно исправить L. По мере роста миотомы она наклоняется в корональной плоскости (нормальной для дорсовентральной оси) так, что медиальная миотома слегка предшествует боковой миотоме. Если смотреть со спины, вертикальная миозепта с левой и правой сторон образуют широкий шеврон, указывающий спереди. Если рыскание низкое, эта морфология не влияет на измерение L. Но если фрамбезия значительна, тригонометрическая коррекция становится сложной, и лучшим подходом является измерение истинного L непосредственно путем оценки координат XYZ двух точек, где передняя и задняя вертикальная миозепта встречаются с нотохордой в горизонтальном миосекте. Простая тригонометрия позволяет вычислить True L из этих координат как L = SQRT[(X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2 + (Z2 - Z1)2]. Недостатки этого последнего подхода заключаются в том, что а) выбор точек может варьироваться в зависимости от оператора и б) не сохраняется визуальная запись выбранных точек. Это соображение не влияет на коррекцию CSA.

5. Необязательный метод: удалите и повторно введите электрическую активность мышц

  1. Создайте стимулирующую камеру.
    1. Возьмите плиту скважины размером 6 х 35 мм, создайте два небольших отверстия (диаметром <5 мм, на расстоянии 1 см друг от друга) с каждой стороны каждого колодца (см. Рисунок 1) с помощью узкого паяльника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с горячим паяльником с осторожностью и работайте в вытяжном шкафу, если это необходимо, чтобы избежать вдыхания пара.
    2. Проденьте пару серебряных или платиновых проволок (длиной ~20 см) через отверстия каждой скважины (см. Рисунок 1). Многоразовый клейкий материал (например, BluTack) можно наносить вблизи отверстий, чтобы удерживать провода на месте и обеспечивать расстояние между проводами в 1 см (см. Рисунок 1).
  2. При 3 dpf разделите рыбу на три условия: контроль рыбы, неактивный и неактивный + стим.
    1. Для неактивных и неактивных + стим групп обезболивают личинок через 72 часа после оплодотворения (hpf) трикаином (0,6 мММ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии со ссылкой38 замороженные аликвоты трикаина размораживают и разбавляют (40 мкл/мл рыбной среды до конечной концентрации 0,6 мМ) перед добавлением в рыбу. Не добавляйте трикаин прямо в воду, содержащую рыбу, так как некоторые рыбы могут получать высокие дозы. Запас трицина следует использовать в течение месяца и никогда не замораживать повторно.
    2. Для рыбной среды Контролируйте рыб, оставьте их без анестезии.
  3. В выбранное время (ы) после начала воздействия трицина (т.е. при 80 л.с.ф.) подготовьте группу Inactive+Stim для стимуляции.
    1. Приготовьте 60 мл 2% агарозы (1,2 г порошка агарозы в 60 мл рыбьей среды) и полностью расплавите с помощью микроволновой печи, охладите, добавьте трикаин и налейте 4 мл в каждую лунку стимулирующей камеры (рисунок 1).
    2. Немедленно добавьте изготовленные на заказ 4-луночные гребни между электродами (созданные путем вырезания пластмасс (например, полипропилена) желаемых размеров и склеивания с помощью Superglue; см. Рисунок 1). Дайте 10 минут для схватывания геля. Аккуратно удалите гребни, чтобы создать четыре прямоугольных колодца.
    3. Наполните каждую лунку трикаиновой водой и поместите одну анестезированную личинку Inactive+Stim в каждую лунку, используя микропипетку, с их переднезадней осью, перпендикулярной электродам (см. Рисунок 1).
    4. Проверьте под рассекающим флуоресцентным микроскопом, полностью ли обезличена каждая рыба в каждой лунке камеры.
  4. Подключите регулируемый стимулятор электрофизиологической картины к камере через контроллер полярности, используя крокодиловые зажимы, соединенные с каждым из электродов с одной стороны камеры (см. Рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Контроллер полярности используется для изменения полярности каждые 5 с, чтобы предотвратить электролиз и коррозию электродов.
  5. Стимулируйте рыбу. Например, 1s с поездом импульсов 200, 20 В, с длительностью импульса 0,5 мс и разделением импульсов 4,5 мс, один раз в 5 с дает эффективный режим сопротивления многократному сокращению.
  6. Регулярно проверяйте под микроскопом, чтобы убедиться, что рыбы стимулируются; пример электрического стимула должен вызывать видимое двустороннее сокращение и легкое движение, один раз в 5 с.
  7. Для режима сопротивления /высокой силы стимулируйте рыбу на высокой частоте в течение схватки 5 мин, три раза, причем каждый бой отделяется 5 мин отдыха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как рыбы на одной стороне камеры отдыхают, крокодиловые зажимы могут быть подключены к паре электродов на другой стороне камеры, и эти дополнительные рыбы стимулируются.
  8. После стимуляции осторожно извлеките рыбу из каждой лунки, аккуратно смыв ее пластиковой пипеткой и верните в инкубатор в свежей рыбьей среде, содержащей трикан.
  9. Вылейте трикановую воду из камеры и используйте щипцы, чтобы разрезать и удалить агарозу из каждого колодца. Лунки промойте водопроводной водой и дайте высохнуть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании электродов из серебряной проволоки иногда оксид серебра может накапливаться на поверхности проволоки после эксперимента по стимуляции. Поскольку оксид серебра менее проводящий, чем серебро, для поддержания воспроизводимости тщательно втирайте оксид серебра с проволоки с помощью Kimwipes перед повторным использованием установки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Быстрое и точное измерение объема сомита
Описан метод пробоподготовки, сбора данных и объемного анализа, позволяющий быстро измерить рост мышц у личинок рыбок данио. Размер мышц может быть измерен у живых животных с использованием рыбы, меченной на их плазматических мембранах мембранным GFP (β-актин: HRAS-EGFP) или mCherry (α-актин: mCherry-CAAX). Личинки были временно обезболены с использованием трикаина, установлены в агарозе с низкой температурой плавления и визуализированы с помо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы сообщаем о методе точной и эффективной оценки мышечного объема живых личинок рыбок данио на стадиях или в генетических вариантах, в которых пигментация не является большим препятствием для визуализации и когда транзиторная анестезия и / или иммобилизация хорошо переносятся. В то время как мы использовали лазерную сканирующую конфокальную микроскопию, описанные подходы применимы к вращающейся дисковой конфокальной или световой листовой микроскопии и к любому другому методу, который создает стопки изображений в ра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Авторы глубоко обязаны усилиям членов лаборатории Хьюза докторов Ситарамайи Аттили, Яны Кот, Фернанды Баянки, Виктории С. Уильямс, Янива Хиниц, Джорджии Бергамин и Владимира Снеткова по разработке описанных протоколов, а также Генри Рёлю, Кристине Хаммонд, Дэвиду Лангенау и Питеру Карри за совместное использование плазмид или линий рыбок данио. SMH является научным сотрудником Совета по медицинским исследованиям (MRC) с программным грантом G1001029, MR/N021231/1 и MR/W001381/1support. Ma провела mrc doctoral training program PhD Studentship от Королевского колледжа Лондона. Эта работа выиграла от тригонометрического вклада Дэвида М. Робинсона, ученого, наставника и друга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клей, Blu TackBostik--
Аэрозольный пылесос ---
АгарозаSigma-AldrichA9539-Агароза
, низкая температура гелеобразованияSigma-AldrichA9414После расплавления держите при температуре 37oC в блочном нагревателе, чтобы оставаться в жидкой форме для повторного использования.
Блочный нагревательCole-ParmerSBH130-BODIPY
FL C5-керамидThermo ScientificD3521Для разведения в рыбной воде и использования при 5 & микро; М для ночной инкубации.
Крокодиловые зажимы и проволока---
Фиджи/imageJНациональные институты здравоохранения, NIH-
-Рыбная среда, Рыбная вода--Вода из циркуляционной системы, собранная на рыбном предприятии.
Рыбья среда, среда E3-E3 описана в "Книге рыбок данио-рерио". http://zfin.org (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl<суб>2 и 0,33 мМ MgSO4 в дистиллированной воде).
Флуоресцентный микроскопLeica, Leica MZ16Fфлуоресцентный микроскоп другого типа, как ожидается, также подойдут.
Стеклянная иглаWorld Precision Instruments, Inc.1В100-6Подвергнуться огневой полировке для предотвращения повреждения эмбрионов во время манипуляций.
стимулятор травыGrass InstrumentsS88Также подойдут стимуляторы другого вида.
СалфеткиKimberly-Clark Professional13258179-лазерный
сканирующий микроскоп (LSM) ZeissZeiss LSM 5 Exciter
Zeiss LSM 880		LSM другого типа.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-луночный планшетThermo Scientific140675-Objective
, 20&/1,0 Вт погружение в водуZeiss--
Pasteur Pipette, градуированный 1 млStarlab GroupE1414-0100-Pasteur
Pipette, Micro Fine Tip 1 млStarlab GroupE1414-1100-Чашка
Петри, 60 ммSigma-AldrichP5481-
Плазмида, ЦМВ-лазурнаяКристина Л. Хаммонд (Бристольский университет)pCS2+_cerulean_kanR плазмида, вводимая в дозе 25-75 пг на одноклеточной стадии.  Цитата: Бассман Дж., и Шульте-Меркер С. (2011) Развитие 138:4327-4332. DOI: 10.1242/dev.068080.
Плазмида, pCS-mCherry-CAAXHenry Roehl (Университет Шеффилда)-для транскрипции in vitro с использованием промотора SP6 (могут использоваться плазмиды, содержащие другие маркеры маркировки мембран);
синтезированную мРНК с колпачком для введения в дозе 100-200 пг на одноклеточной стадии.
Импульсный контроллер Hoefer Scientific InstrumentsPC750-Паяльник
--
-ТрикаинСигма-ОлдричE10521этил3-аминобензоатметасульфонат/MS-222; растворяется в рыбьей воде и используется при 0,6 мМ.
VolocityPerkin Elmer/Quorum Technologies Inc-
Часовые щипцы, No 5--
- Проволока, платинаГудфеллоуPT005142/120,40 мм в диаметре; дорогая альтернатива серебру.
Проволока, сереброAcros Organics317730010диаметром 0,25 мм (диапазон диаметров 0,25-0,5 мм был протестирован, что дало аналогичные результаты).
Данио-рерио, myog:H2B-mRFPДэвид М. Лангенау (Массачусетская больница общего профиля; Harvard Stem Cell Institute)-ZFIN официальное название: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Цитирование: Тан К., Мур Дж.С., Игнатиус М.С., Тененте И.М., Хейс М.Н., Гарсия Э.Г., Торрес Йордá n N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Визуализация гетерогенности опухолевых клеток после трансплантации оптически прозрачных иммунодефицитных рыбок данио. Nat Commun. 2016 Янв 21;7:10358. DOI: 10.1038/ncomms10358.
Данио-рерио, α-actin:mCherry-CAAXPeter D. Currrie (ARMI, Monash University)-ZFIN официальное название: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Цитирование: Бергер Дж., Таракчи Х., Бергер С., Ли М., Холл Т.Е., Арнер А., и Карри.Д. Потеря тропомодулина4 у мутанта данио-рерио trä ГЭ вызывает образование цитоплазматических палочек и мышечную слабость, напоминающую немалиновую миопатию. Dis Model Mech. 2014 декабрь; 7(12):1407-15. DOI: 10.1242/dmm.017376.
Данио-рерио, β-actin:HRAS-EGFP--ZFIN официальное название: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Цитирование: Купер М.С., Сзето Д.., Соммерс-Херивель Г., Топчевски Дж., Солника-Крезель Л., Канг Х.К., Джонсон И., и Кимельман Д. Визуализация морфогенеза у трансгенных эмбрионов рыбок данио с использованием красителя метилового эфира BODIPY TR в качестве жизненно важного противовеса для GFP. Дев Дин. 2005 февраль; 232(2):359-68. DOI: 10.1002/dvdy.20252.
Программное обеспечение ZENZeiss--
, Ожидается, что Также ожидается, что подойдут

Ссылки

  1. Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
  2. Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
  3. Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162(2011).
  4. Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123(2016).
  5. Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10(2019).
  6. Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
  7. Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
  8. Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247(2019).
  9. Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028(2019).
  10. Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728(2021).
  11. Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
  12. Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
  13. Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  14. Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567(2016).
  15. Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676(2017).
  16. Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
  17. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).
  18. Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
  19. Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
  20. Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
  21. Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
  22. Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161(2015).
  23. Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
  24. Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
  25. Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232(2018).
  26. Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
  27. Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
  28. Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
  29. Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
  30. Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
  31. Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
  32. Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
  33. Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
  34. Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
  35. Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
  36. Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
  37. Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
  38. Westerfield, M. The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  39. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  40. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751(2014).
  41. Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
  42. Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
  43. Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
  44. Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
  45. Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
  46. Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
  47. Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391(2013).
  48. Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Мышцы zebrafishконфокальная микроскопияэлектрическая стимуляцияизмерение мышечных волоконвизуализация живых объектовобъем миотомаактивность-зависимый ростметод четырех срезовличинки zebrafish
Измерение роста скелетных мышц в реальном времени у отдельных живых рыбок данио, подвергшихся измененной электрической активности
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.