Этот протокол описывает обогащение внеклеточных везикул (ADEV), полученных из астроцитов, из плазмы крови человека. Он основан на разделении EV методом осаждения полимеров с последующим иммунозахватом ADEV на основе ACSA-1. Анализ ADEV может дать ключ к изучению изменений в воспалительных путях у живых пациентов, неинвазивно с помощью жидкой биопсии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обогащение внеклеточных везикул, полученных из астроцитов из плазмы крови человека
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Внеклеточные везикулы (ВВ) — это биологические наночастицы, секретируемые всеми клетками для клеточной коммуникации и выведения отходов. Они участвуют в широком спектре функций, воздействуя на другие клетки и перенося их в другие клетки при физиологических и патологических состояниях. Учитывая их присутствие в биожидкостях, ВВ представляют собой отличный ресурс для изучения процессов заболевания и могут рассматриваться как жидкая биопсия для открытия биомаркеров. Привлекательным аспектом анализа ВВ является то, что они могут быть выбраны на основе маркеров их происхождения, что отражает окружающую среду конкретной ткани в их грузе. Тем не менее, одним из основных препятствий, связанных с методами изоляции электромобилей, является отсутствие методологического консенсуса и стандартизированных протоколов. Астроциты — это глиальные клетки, играющие важную роль в мозге. При нейродегенеративных заболеваниях реактивность астроцитов может привести к изменению груза EV и аберрантной клеточной коммуникации, способствуя прогрессированию заболевания. Таким образом, анализ ВВ астроцитов может привести к открытию биомаркеров и потенциальных мишеней заболеваний. Этот протокол описывает двухэтапный метод обогащения ВВ, полученных из астроцитов (ADEV) из плазмы человека. Во-первых, электромобили обогащаются из дефибринированной плазмы с помощью осаждения на основе полимеров. Затем следует обогащение ADEV с помощью иммунозахвата на основе ACSA-1 с помощью магнитных микрогранул, где ресуспендированные EV загружаются на колонку, помещенную в магнитное поле. Электромобили с магнитной маркировкой ACSA-1+ остаются внутри колонны, в то время как другие электромобили протекают через колонну. После того, как колонка снята с магнита, ADEV элюируются и готовы к хранению и анализу. Для подтверждения обогащения астроцитарных маркеров глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) или другие специфические астроцитарные маркеры внутриклеточного происхождения могут быть измерены в элюате и сравнены с проточным. Этот протокол предлагает простой и эффективный по времени метод обогащения ADEV из плазмы, который может быть использован в качестве платформы для изучения маркеров, относящихся к астроцитам.
Введение
Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой гетерогенную группу мембранозных наночастиц, секретируемых всеми типами клеток, несущих белки, липиды и нуклеиновые кислоты1. Микровезикулы (100-1000 нм), экзосомы (30-100 нм) и апоптотические тельца (1000-5000 нм) составляют основные типы ВВ, различающиеся по месту их происхождения 2,3. ВВ регулируют важные физиологические процессы, такие как презентация антигена и иммунные реакции4, рециркуляция рецепторов, элиминация метаболитов5 и клеточная коммуникация
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Исследование, описанное в этом протоколе, проводилось с образцами человеческой плазмы от здоровых взрослых доноров обоих полов (возраст 65,9-81,3 года, 45,5% женщин) из когорты Инициативы Сант-Пау по нейродегенерации (SPIN), Барселона, Испания36. Участники дали информированное согласие. Исследование проводилось в соответствии с международными этическими принципами медицинских исследований, содержащимися в Хельсинкской декларации и испанском законодательстве. Комитет по этике исследований Сант-Пау (CEIC) рассмотрел и одобрил протокол сбора и хранения образцов плазмы крови человека из когорты SPIN (#16/2013).
1. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Было успешно осуществлено выделение ADEV из плазмы, собранной у здоровых доноров. Для получения общей фракции EV был использован метод осаждения на основе полимеров с последующим иммунозахватом с помощью магнитных микрогранул для получения ADEV.
Вестерн-блоттинг общей фракции ВВ до этапа иммунозахвата показал отсутствие кальнексина (маркера клеточной контаминации) и присутствие Alix и трансмембранного белка CD9 в препаратах ВВ (рис. 2A).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Электромобили вызвали большой интерес в биомедицинских исследованиях благодаря своему диагностическому и терапевтическому потенциалу. В настоящее время одним из основных препятствий, связанных с методами изоляции ВВ, является отсутствие методологического консенсуса и стандартизированных протоколов. В этом исследовании представлен подробный протокол обогащения ВВ астроцитов из плазмы крови человека с помощью преципитации на основе полимеров и иммунозахвата GLAST.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Доктор Белбин сообщил о получении личных гонораров от ADx NeuroSciences вне представленной работы. Д-р Алколеа сообщил о получении личных гонораров за услуги консультативного совета и/или гонорары докладчиков от Fujirebio-Europe, Roche, Nurtricia, Krka Farmacéutica, Zambon S.A.U. и Esteve вне представленной работы. Д-р Льео работал консультантом или членом консультативных советов компаний Fujirebio-Europe, Roche, Biogen, Grifols и Nutricia вне представленной работы. Д-р Фортеа сообщал о получении личных гонораров за работу в консультативных советах, судейских комитетах или гонораров докладчиков от AC Immune, Novartis, Lundbeck, Roche, Fujirebio и Biogen вне представленной работы. Доктора Алколеа, Белбин, Ллео и Фортеа сообщают о владении патентом на маркеры синаптопатии при нейродегенеративных заболеваниях (лицензирован ADx, EPI8382175.0). О других разоблачениях не сообщалось. Всем остальным авторам больше нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы выражают признательность Сорайе Торрес, Шайме Эль Бунасри Эль Беннади и Ориолу Санчесу Лопесу за помощь в работе с образцами и их подготовке. Мы также хотели бы выразить признательность за сотрудничество Хосе Амабле Бернабе из ICTS "NANBIOSIS", подразделение 6 (подразделение CIBER по биоинженерии, биоматериалам и наномедицине) Института материаловедения Барселоны, Марти де Кабо Жауме из отделения электронной микроскопии Автономного университета Барселоны, доктора Марты Солер Кастань и Лии Рос Бланко из платформы проточной цитометрии в Институте биомедицинских исследований Сант-Пау (IIB-Sant Pau). а также доктору Джоану Карлесу....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Первичное антитело Anti-Alix для вестерн-блоттинга | EMD Millipore | ABC40 | |
| &микро; Сепаратор MACS | Miltenyi Biotec | 130-042-602 | The µ Сепаратор MACS используется в сочетании с µ Колонки и микрогранулы MACS. |
| Первичное антитело против кальнексина для вестерн-блоттинга | Genetex | GTX109669 | |
| Анти-CD9 первичное антитело для вестерн-блоттинга | Cell Signaling | 13174 | |
| Блокатор BSA (10%) 200 мл | Thermo Fisher | 37525 | |
| Bransonic 1510E-MT Ультразвуковая ванна | Автоанализатор Branson | ||
| COBAS 6000 | Roche Diagnostics | Анализатор для иммунотурбидиметрического определения ApoB; коммерческий автоанализатор | |
| cOmplete Protillness Inhibitor Cocktail (без ЭДТА) | Roche | 11873580001 | |
| Digital Micrograph 1.8 | программное обеспечение для микросъемки | ||
| Dulbecco's PBS Mg++, Ca++ free 500 мл | Thermo Fisher | 14190144 | |
| EveryBlot Blocking Buffer | BioRad | 12010020 | |
| Exoquick (раствор для осаждения экзосом 5 мл) + Тромбин | System Bioscience | EXOQ5TM-1 | ExoQuick 20 мл также можно приобрести (EXOQ20A-1) |
| Gatan 895 USC 4000 | камера | ||
| GeneGnome XRQ хемилюминесцентная система визуализации | Syngene | ||
| Человеческий антиген CD81 (CD81) Набор для ИФА | Cusabio | CSB-EL004960HU | |
| Программируемая гибель клеток человека 6-взаимодействующий белок (PDCD6IP) Набор для ИФА | Cusabio | CSB-EL017673HU | |
| Мембрана иммуноблоттинга PVDF | BioRad | 1620177 | |
| Просвечивающий электронный микроскоп JEOL 2011 | JEOL LTD | оснащена ПЗС-камера Gatan 895 USC 4000 (Гатан 626, Гатан, Плезантон, США) | |
| Лаванда EDTA BD Vacutainer K2E тубы | Becton dickinson | 367525 | |
| Leica EM GP | Коммерческий морозильник | Leica Microsystem | |
| Микропробирки с низким связыванием 1,5 мл | Deltalab | 4092.3NS | |
| MACS & Колонны с плунжурами | Miltenyi Biotec | 130-110-905 | &микро; Колонки с плунжорами специально разработаны для выделения экзосом из жидкостей организма |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Считыватель пластин MAGPIX | Luminex Corporation | 80-073 | Блок мультиплексирования xMAP от Luminex (программное обеспечение Luminex xPonent v 4.3) |
| MicroBead Kit100 μ L Anti-GLAST (ACSA-1)-биотин, человек, мышь, крыса – небольшие размеры; 100 μ L Антибиотин Микрошарики | Miltenyi Biotec | 130-095- 825 | |
| MILLIPLEX MAP Kit Панель цитокинов/хемокинов/факторов роста человека Панель магнитных шариков | EMD Millipore | HCYTA-60K-25 | |
| M-PER Реагент для экстракции белка млекопитающих 25 мл | Thermo Fisher | 78503 | Для некоторых применений, таких как вестерн-блоттинг, можно использовать более агрессивные буферы для лизиса (например, RIPA) |
| MultiSkan SkyHigh Microplate Spectrophotometer | Thermofisher | A51119500C | |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NTA; версия 3.4 Pierce | |
| Halt Протеаза и ингибитор фосфатазы Коктейль | Thermo Fisher | 78441 | |
| Полипропиленовый шприц (G29) | Шприц PeroxFarma | 1 мл; 0,33x12 мм-G29x1/2 " | |
| Вторичный анти-кролик антитела | Thermo Fisher | 10794347 | |
| Simoa GFAP Discovery Kit | Quanterix | 102336 | |
| Simoa, инструмент SR-X | Quanterix | SR-X Ultra-Sensitive Biomarker Detection System; коммерческая технология обнаружения биомаркеров | |
| Specific Protein Test Apolipoprotein B - APOB (100 det) COBAS C/CI | Roche Diagnostics | 3032574122 | |
| SuperSignal West Femto | Thermo Fisher | 34095 | Сверхчувствительный усиленный хемилюминесцентный (ECL) подложка HRP |
| Транс-Блот Турбо Трансфер | Система BioRad | 1704150 |
Ссылки
- Pathan, M., et al. Vesiclepedia 2019: a compendium of RNA, proteins, lipids and metabolites in extracellular vesicles. Nucleic Acids Research. 47, 516-519 (2019).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exo....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
