Этот протокол описывает подход к облегчению точного внесения изменений в эмбрионы рыбок данио с использованием технологии CRISPR-Cas9. Представлен конвейер фенотипирования, чтобы продемонстрировать применимость этих методов для моделирования варианта гена, связанного с синдромом удлиненного интервала QT.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
CRISPR-Cas9-опосредованные точные правки в сердцах рыбок данио
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR) на животных моделях позволяют проводить точные генетические манипуляции для изучения физиологических явлений. Рыбки данио использовались в качестве эффективной генетической модели для изучения многочисленных вопросов, связанных с наследственными заболеваниями, развитием и токсикологией на уровне всего органа и организма. Благодаря хорошо аннотированному и нанесенному на карту геному рыбки данио были разработаны многочисленные инструменты для редактирования генов. Тем не менее, эффективность генерации и простота обнаружения точных изменений с использованием CRISPR является ограничивающим фактором. Здесь описан подход на основе CRISPR-Cas9 с простым обнаружением точных изменений в гене, ответственном за реполяризацию сердца и связанном с электрическим расстройством, синдромом длинного QT (LQTS). Этот подход с двумя одноруковой РНК (sgRNA) иссекает и заменяет целевую последовательность и связывает генетически закодированный ген-репортер. Полезность этого подхода демонстрируется описанием неинвазивных фенотипических измерений электрической функции сердца у личинок рыбок данио дикого типа и генетически отредактированных. Такой подход позволяет эффективно изучать связанные с заболеванием варианты в целом организме. Кроме того, эта стратегия предлагает возможности для вставки экзогенных последовательностей по выбору, таких как репортерные гены, ортологи или редакторы генов.
Введение
Стратегии редактирования генов на основе CRISPR на животных моделях позволяют изучать генетически наследственные заболевания, развитие и токсикологию на уровне всего организма 1,2,3. Рыбки данио представляют собой мощную модель, которая ближе во многих физиологических аспектах к людям, чем мышиные или человеческие клеточные модели4. Обширный спектр генетических инструментов и стратегий был использован у рыбок данио как для прямого5, так и для обратного генетического скрининга6. Всест....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Исследования с использованием рыбок данио были проведены в соответствии с политикой и процедурами Комитета по уходу за животными Университета Саймона Фрейзера и Канадского совета по уходу за животными и были завершены в соответствии с протоколом No 1264K-18.
1. Проектирование компонентов CRISPR для точного редактирования
- Чтобы разработать двух сгРНК-направляющие, которые будут использоваться для иссечения последовательности, содержащей целевой сайт KI, сначала определите ортолог рыбок данио для интересующего гена.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлен краткий обзор шагов по проектир....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успешное использование этого подхода CRISPR с двумя сгРНК-экзонами подчеркивается введением и простым обнаружением точного редактирования для разработки LQTS-ассоциированного варианта, R56Q, в гене zkcnh6a у рыбок данио. На рисунке 6 показаны репрезентативные личинки 3 dpf, введенные на стадии одноклеточного эмбриона с компонентами CRISPR, как описано выше. На рисунке 6A показано наличие экспрессии гена репортера YFP mVenus в хрусталике глаза в качестве.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Разработка точных изменений генов с использованием CRISPR-Cas9 оспаривается низкой эффективностью механизмов HDR и их эффективным обнаружением. Здесь описан подход замены экзонов на основе CRISPR-Cas9 с двумя сгРНК, который производит точные изменения у рыбок данио с простым визуальным обнаружением положительных изменений. Эффективность этого подхода демонстрируется путем генерации точных правок в гене zkcnh6a . В этой статье показано, как функция сердца у генетически отредактированных личинок рыбок данио может .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Это исследование было поддержано грантом Канадского исследовательского проекта Института здравоохранения (T.W.C.) и грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады Discovery (T.W.C.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | Европейский институт | ||
| ImageJ | Национальные институты здравоохранения (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | Новая Англия Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-луночная пластина | VWR | ||
| 25 мм Чашка Петри | VWR | ||
| Blackfly USB3 Камера | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Термоамплификатор | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| Набор для экстракции геля EZNA Набор для экстракции | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Набор для транскрипции | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Инкубатор | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Набор для транскрипции | Invitrogen | ||
| ND1000 Спектрофотометр | Набор для | ||
| Qiagen | |||
| PLI 100A Пикоинъектор | Гарвардский аппарат | ||
| PowerPac Базовый источник питания | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Электрофорез Система электрофореза | Bio-Rad | ||
| ZebTec Dani fish Housing Система | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Genewiz | |||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Компетентные клетки | NEB | ||
| 10X ПЦР буфер | Qiagen | ||
| 100 мМ смесь нуклеотидов | ABM | ||
| ампициллин | сигма | ||
| бамHI эндонуклеаза с буфером | NEB | ||
| BsaI эндонуклеаза с буфером | NEB | ||
| DR274 плазмида (XL1 синий бактериальный агар стаб) | Addgene | ||
| EcoRI Эндонуклеаза с буфером | NEB | ||
| Glycerin | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease с буфером | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue | Адген | ||
| MS-222 (Трикаин) | Сигма | ||
| pKHR5 Плазмида (DH5&альфа; бактериальный агар стаб) | Адген | ||
| PmeI Эндонуклеаза с буфером | NEB | ||
| SalI Эндонуклеаза с буфером | NEB | ||
| Гидроксид натрия | Сигма | ||
| Т4 Лигаза с буфером | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Буфер | Sigma | ||
| Tris гидрохлорид | Sigma | ||
| XhoI Эндонуклеаза с буфером | NEB | ||
| strong>RECIPES | |||
| Solution | Компонент Поставщик | ||
| Буфер для отжига (pH 7,5-8,0) | 10 мМ Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Медиа (pH 7,2) | 5 мМ NaCl | Sigma | |
| 0,17 мМ KCl | Sigma | ||
| 0,33 мМ CaCl2 | Sigma | ||
| 0,33 мМ MgSO4 | Sigma | ||
| Инъекционный буфер (pH 7,5) | 20 мМ HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
Ссылки
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
