Методическая статья

Определение кишечной проницаемости с помощью люциферного желтого цвета в апикально-аутентоидной модели

DOI:

10.3791/64215

⸱

27 июля 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatric Surgery, Oklahoma Children's Hospital, 2Oklahoma University Health Sciences Center, 3Department of Surgery, University of Oklahoma Health Sciences Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол описывает метод, который использует желтый люцифер в апикально-энтероидной модели для определения кишечной проницаемости. Этот метод может быть использован для определения параклеточной проницаемости у энтероидов, которые моделируют воспалительные заболевания кишечника, такие как некротизирующий энтероколит.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Энтероиды являются новым исследовательским инструментом в изучении воспалительных заболеваний кишечника, таких как некротизирующий энтероколит (NEC). Они традиционно выращиваются в базолатеральной (BO) конформации, где апикальная поверхность эпителиальной клетки обращена к внутреннему просвету. В этой модели доступ к просветной поверхности энтероидов для лечения и экспериментов является сложной задачей, что ограничивает возможность изучения взаимодействий хозяина и патогена. Чтобы обойти это, была создана неонатальная апикальная модель (AO) для некротизирующего энтероколита. Поскольку изменения проницаемости эпителиальных клеток кишечника являются патогномоничными для NEC, этот протокол описывает использование люциферного желтого (LY) в качестве маркера параклеточной проницаемости. LY пересекает эпителиальный барьер кишечника через все три основных параклеточных пути: поры, утечки и неограниченные. Использование LY в модели AO позволяет более широко изучить проницаемость в NEC. После одобрения IRB и согласия родителей у недоношенных новорожденных человека были взяты хирургические образцы кишечной ткани. Кишечные стволовые клетки были собраны с помощью изоляции крипты и использовались для выращивания энтероидов. Энтероиды выращивали до зрелости, а затем трансформировали АО или оставляли в конформации БО. Их либо не лечили (контроль), либо лечили липополисахаридом (ЛПС) и подвергали гипоксическим состояниям для индукции НЭК in vitro . LY использовался для оценки проницаемости. Иммунофлуоресцентное окрашивание апикального белка zonula occludens-1 и базолатерального белка β-катенина подтвердило конформацию АО. Энтероиды AO и BO, получавшие ЛПС и гипоксию, продемонстрировали значительно повышенную параклеточную проницаемость по сравнению с контрольной группой. Энтероиды AO и BO показали повышенное поглощение LY в просвет обработанных энтероидов по сравнению с контрольной группой. Использование LY в энтероидной модели AO позволяет исследовать все три основных пути параклеточной проницаемости. Это также позволяет исследовать взаимодействия хозяин-патоген и то, как это может повлиять на проницаемость по сравнению с энтероидной моделью BO.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Энтероиды представляют собой трехмерные (3D) структуры, полученные из ограниченных органами стволовых клеток кишечника человека 1,2. Они полностью состоят из эпителиальной линии и содержат все дифференцированные типы эпителиальных клеток кишечника2. Энтероиды также поддерживают клеточную полярность, состоящую из апикальной просветной поверхности, образующей внутренний компартмент и базолатеральную поверхность, обращенную к окружающим средам. Энтероиды являются уникальной моделью в том смысле, что они сохраняют характеристики хозяина, из которого они были получены3. Таким образом, энтероиды, полученные от недоношенных человеческих детей, представляют собой модель, которая полезна для исследования заболеваний, которые в первую очередь влияют на эту популяцию, таких как некротизирующий энтероколит (NEC).

Традиционная энтероидная модель выращивается в базолатеральной (BO) конформации, где энтероид заключен в купол базальной мембранной матрицы (BMM). BMM побуждает энтероид поддерживать 3D-структуру с базолатеральной поверхностью снаружи. Энтероиды BO являются подходящей моделью для NEC, которая преодолевает разрыв между двумерными (2D) первичными клеточными линиями человека и in vivo животными моделями 2,4. NEC индуцируется у энтероидов путем размещения патогенов, таких как ЛПС или бактерии, в средах, окружающих энтероиды, с последующим воздействием гипоксических состояний 2,3. Проблема с энтероидной моделью BO NEC заключается в том, что она не позволяет эффективно изучать взаимодействия хозяин-патоген, которые происходят на апикальной поверхности in vivo. Изменения в кишечной проницаемости обусловлены этими взаимодействиями хозяина и патогена. Чтобы лучше понять, как проницаемость влияет на патофизиологическую основу заболевания, необходимо создать модель, которая включает в себя обработку апикальной поверхности.

Co et al. были первыми, кто продемонстрировал, что зрелые энтероиды BO могут быть индуцированы для формирования апикальной (AO) конформации путем удаления куполов BMM и повторного использования их в среде5. Эта статья продемонстрировала, что энтероиды АО поддерживали правильную эпителиальную полярность, содержали все типы клеток кишечника, поддерживали кишечный эпителиальный барьер и обеспечивали доступ к апикальной поверхности5. Использование энтероидов АО в качестве модели НЭК обеспечивает физиологическое воспроизведение процесса заболевания и изучение взаимодействий хозяин-патоген.

Одним из основных факторов, влияющих на патофизиологию НЭК, является повышенная кишечная проницаемость6. Несколько молекул были предложены в качестве способа проверки кишечной проницаемости in vitro7. Среди них люцифер желтый (LY) представляет собой гидрофильный краситель с пиками возбуждения и излучения при 428 нм и 540 нм соответственно8. Поскольку он пересекает все основные параклеточные пути, он был использован для оценки параклеточной проницаемости в различных приложениях, включая гематоэнцефалические и кишечные эпителиальные барьеры 8,9. Традиционное применение LY использует клетки, выращенные в монослоях на полупроницаемой поверхности10. LY наносится на поверхность апикального сустава и пересекает параклеточные плотные соединительные белки, чтобы собраться на базолатеральной стороне. Более высокие концентрации LY в базолатеральном компартменте указывают на снижение плотного соединения белков с последующим разрушением барьера эпителиальных клеток кишечника и повышением проницаемости10. Он также был описан в энтероидных моделях 3D BO, где LY был добавлен в среду, а отдельные энтероиды были изображены для поглощения LY в просвет11. Хотя это позволяет проводить качественный анализ с помощью визуализации поглощения LY, количественный анализ ограничен. Этот протокол описывает уникальную технику, которая использует LY для оценки параклеточной проницаемости с использованием энтероидной модели IN vitro NEC в энтероидах AO при сохранении 3D-ориентации. Этот метод может быть использован как для качественного, так и для количественного анализа проницаемости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящее исследование было выполнено в соответствии с одобрением Совета по институциональному обзору (IRB, #11610, 11611) в Университете Оклахомы. Перед сбором человеческих хирургических образцов требовалось согласие родителей в соответствии со спецификациями IRB. После одобрения IRB и согласия родителей ткань тонкой кишки человека была получена от младенцев (скорректированный гестационный возраст (GA) в диапазоне от 36-41 недели на момент отбора проб, все с историей преждевременных родов при предполагаемой ГА 25-34 недели, 2: 1 M: F), перенесших операцию по NEC или другую резекцию кишечника, такую как удаление остомии или восстановление атрезии. Энтероиды были получены из ткани, полученной либо из тощей кишки, либо из подвздошной кишки.

1. Энтероидные культуры, полученные от младенцев человека: выделение крипты и покрытие из целой ткани

  1. Подготовьте питательные среды, хелатирующий буфер No 1 и хелатирующий буфер No 2 (таблица 1) в соответствии с предыдущим отчетом4. Храните хелатирующие буферы при 4 °C и используйте их в течение 48 ч.
  2. Подготовьте человеческую минигутовую среду (табл. 1). Храните запасы при температуре −20 °C и нагревайте на водяной бане при температуре 37 °C перед использованием.
  3. Готовят 50% кондиционированную среду L-WRN (CM) (таблица 1). Хранить на складе при температуре 4 °C до 1 недели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 100% L-WRN база для кондиционированных сред описана в протоколе Miyoshi et al.12.
  4. Генерировать энтероиды из образцов тканей тонкой кишки, полученных из хирургических образцов после предыдущего отчета4. Пластинчат четыре лунки энтероидов в 24-луночную пластину из 0,75-2,5 г куска кишечной ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Энтероиды могут быть успешно получены из ткани, хранящейся в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 объемом 30 мл в конической трубке объемом 50 мл при 4 °C в течение 48 ч.
  5. Поместите 24-луночную пластину в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 вверх ногами в течение 15-20 мин, чтобы обеспечить полимеризацию куполов BMM4.
  6. Добавьте 500 мкл 50% L-WRN CM (как описано на этапе 1.3) с 0,5 мкл Y-27632, ингибитора ROCK (RI, см. Таблицу материалов) к каждой скважине. Через 2-3 дня заменить на 50% L-WRN CM без RI.

2. Генерация энтероидов АО

  1. Выращивайте энтероиды, встроенные в BMM в течение 7-10 дней с 50% L-WRN CM4.
  2. Извлеките носитель и добавьте 500 мкл раствора для восстановления клеток (CRS, см. Таблицу материалов) в одну лунку. Соскоблите купол, пипетку вверх и вниз несколько раз, затем добавьте раствор CRS / энтероид / BMM в следующую лунку.
  3. Соскоблите купол, пипетку вверх и вниз несколько раз и поместите раствор в микроцентрифужную трубку. Добавьте 500 мкл CRS во вторую лунку, пипетку вверх и вниз, затем добавьте ее в первую лунку. Переложите этот раствор в ту же микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  4. Повторите шаг 2.3, объединив две скважины в одну микроцентрифужную трубку до тех пор, пока все содержимое скважины не окажется в CRS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более двух скважин могут быть объединены в одну большую коническую трубу объемом 15 мл, если генерируются большие объемы энтероидов АО. Поддержание соотношения CRS 500 мкл на скважину важно для обеспечения полной солюбилизации BMM.
  5. Поместите микроцентрифужные трубки (стадия 2.3) с объединенным раствором CRS/энтероид/BMM на ротатор в течение 1 ч при 4 °C для солюбилизации BMM.
  6. Центрифугируют раствор при 200 х г в течение 3 мин при 4°С, затем удаляют супернатант с помощью микропипетки, оставляя гранулу позади.
  7. Повторно суспендируют энтероидную гранулу в 1 мл 50% L-WRN CM (как приготовлено на стадии 1.3) на микроцентрифужную трубку. Аккуратно пипетку 500 мкл повторно суспендированного раствора энтероидов/сред в каждую лунку ультранизкого прикрепления 24-луночных тканевых культуральных пластин (см. Таблицу материалов).
  8. Инкубировать при 37 °C с 5% CO2 в течение 3 дней до эксперимента.

3. Проверка конформации энтероидов АО с помощью полноразмерного иммунофлуоресцентного окрашивания

  1. После инкубации энтероидов в суспензии среды в течение 3 дней пипетку энтероидной/средовой суспензии из одной лунки в микроцентрифужную трубку.
  2. Центрифугировать энтероидную/среду суспензией при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант с помощью микропипетки.
  3. Повторное суспендирование энтероидов в 20 мкл BMM. Пипетка 10 мкл энтероидной суспензии на предметное стекло микроскопа и выкладывает ее тонким слоем примерно 1 см на 1 см квадрата. Повторить с оставшимися 10 мкл энтероидной суспензии на отдельной части того же слайда так, чтобы остались два мазка энтероидной/BMM суспензии.
  4. Дайте энтероидным/BMM мазкам затвердеть при комнатной температуре (RT) в течение 15 мин.
  5. Работая в вытяжном шкафу, поместите слайд в красильную банку и заполните 4% параформальдегидом, пока он не покроет мазок энтероида / BMM (~ 30 мл на один слайд, если используется стеклянная витражная банка с емкостью 10 слайдов). Дайте 30 мин (при комнатной температуре) для фиксации.
    ВНИМАНИЕ: 4% параформальдегид опасен и может вызвать повреждение глаз / раздражение, раздражение кожи и рак. Всегда работайте под вытяжным кожухом при его использовании. Надевайте защитные перчатки и средства индивидуальной защиты при обращении с ним. Утилизируйте его в утвержденный контейнер для удаления отходов.
  6. Выбросьте 4% параформальдегида в соответствующий контейнер для отходов. Добавьте 30 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в банку для окрашивания или до тех пор, пока PBS не покроет мазки энтероидов / BMM. Дайте ему постоять в течение 3 минут на RT, а затем выбросьте PBS в бутылку для отходов параформальдегида. Повторите этот шаг еще два раза, чтобы выполнить в общей сложности три стирки.
  7. Наполните новую банку окрашивания 30 мл 0,5% Triton X-100, разбавленного в PBS. Поместите слайд с энтероидными/BMM мазками в раствор Тритона и дайте ему проникнуть в течение 20 мин при RT.
  8. Откажитесь от 0,5% Triton X-100, разбавленного в PBS. Добавьте 30 мл PBS в банку для окрашивания и дайте ей постоять в течение 3 минут. Отбросьте PBS путем декантирования.
  9. Аккуратно протрите слайд вокруг энтероидных / BMM мазков, стараясь не нарушить их. Используя гидрофобную барьерную ручку (барьерная ручка PAP, см. Таблица материалов), нарисуйте круг вокруг каждого из энтероидных / BMM мазков. Делают 20% сыворотку, специфичную для животного, у которого было выращено вторичное антитело (см. Таблицу материалов).
  10. Положите слайд микроскопа на лабораторный стенд. Блокируйте слайд в течение 1 ч при 4 °C путем пипетирования 100 мкл определенной 20% сыворотки со стадии 3,9 на каждый из энтероидных/BMM мазков, окольцованных гидрофобной барьерной ручкой.
  11. Готовят раствор 100 мкл с 1:100 и 1:200 разведениями первичных антител β-катенина и ZO-1 соответственно, разведенных в PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое первичное антитело должно быть от другого животного, чтобы гарантировать, что они будут иметь различные иммунофлуоресцентные каналы при изображении. В настоящем исследовании используется мышиное β-катениновое антитело и кроличье антитело ZO-1 (см. Таблицу материалов).
  12. Нажмите на слайд на счетчике, чтобы удалить 20% сыворотку и аккуратно протрите насухо, стараясь не нарушить мазки энтероидов / BMM. Пипетка 100 мкл раствора первичного антитела β-катенин/ЗО-1 на один из мазков энтероидов/ВММ. Пипетка 100 мкл PBS без первичного антитела на другой энтероидный/BMM мазок в качестве отрицательного контроля.
  13. Выровняйте дно пластикового контейнера влажным бумажным полотенцем, чтобы создать увлажненный контейнер. Поместите слайд в контейнер, стараясь не нарушить растворы, покрывающие энтероидные / BMM мазки. Поместите крышку на контейнер для герметизации и храните при температуре 4 °C на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания горки. Убедитесь, что контейнер закрыт, чтобы избежать высыхания.
  14. Как только все будет готово к продолжению, нажмите на слайд на счетчике, чтобы удалить первичные антитела и PBS из мазков энтероидов / BMM.
  15. Выполните этап промывки, поместив слайд в банку для окрашивания и заполнив 30 мл PBS или до тех пор, пока PBS не покроет мазки энтероидов / BMM. Дайте постоять 3 мин при комнатной температуре. Отбросьте PBS и повторите этот шаг еще дважды, в общей сложности три промывки.
  16. Приготовьте 200 мкл вторичных антител для двух различных иммунофлуоресцентных каналов, причем каждое антитело имеет разведение 1:1000 в PBS (см. Таблицу материалов). Храните раствор вдали от света.
  17. Пипетка 100 мкл раствора вторичного антитела на каждый из мазков энтероида/BMM. Поместите его в темноту и дайте постоять в течение 1 часа в RT.
  18. Нажмите на слайд на счетчике, чтобы удалить вторичные антитела. Повторите шаги стирки, описанные в шаге 3.15, гарантируя, что все стирки выполняются в темноте.
  19. Добавьте каплю 4',6-диамидино-2-фенилиндола (фторошилд с DAPI, см. Таблицу материалов) монтажной среды к каждому из мазков энтероидов/BMM и нанесите крышку, чтобы убедиться, что оба мазка адекватно покрыты. Избегайте улавливания пузырьков под крышкой. Держите слайд в темноте до готовности к просмотру под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленная визуализация слайдов дает наиболее оптимальные результаты; однако слайды могут храниться в увлажненном контейнере при 4 °C и отображаться в течение 1 недели после добавления DAPI.

4. Индукция экспериментальной НЭК

  1. Убедитесь, что энтероиды АО находились в суспензии не менее 72 ч перед использованием.
  2. Аккуратно выложите всю энтероидную/среду-суспензию из каждой лунки в микроцентрифужную трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько скважин могут быть объединены в одну коническую трубу объемом 15 мл, если обработан большой объем скважин. Для этого протокола рекомендуется минимум три скважины на группу лечения.
  3. Центрифугу при 300 х г в течение 3 мин при РТ и удаляют супернатант.
  4. Добавьте 10 мкл 5 мг/мл липополисахарида (ЛПС, см. Таблицу материалов) к 500 мкл 50% ЛВРН СМ на скважину (конечная концентрация 100 мкг/мл ЛПС).
  5. Энтероиды ресуспенд АО назначают в качестве группы лечения в 50% LWRN + LPS и аликвоте 500 мкл суспензии на 24-луночную сверхнизкую пластину крепления. Энтероиды resuspend AO, обозначенные как необработанные контрольные в 500 мкл 50% LWRN CM на лунку. Aliquot 500 мкл этой суспензии на отдельную 24-луночную сверхнизкую крепежную пластину.
  6. Индуцировать гипоксию в энтероидах АО, обработанных ЛПС , через модульную камеру инкубатора (MIC) с 1% O2, 5% CO2 и 94%N2 в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Лечить энтероиды при гипоксии и ЛПС в течение 24 ч.
  7. Поместите необработанные и обработанные ЛПС + гипоксией культуры, все еще в камеру MIC, в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 24 ч.

5. Измерение параклеточной проницаемости с использованием LY

  1. Аккуратно выложите суспензию энтероида/среды из каждой лунки в микроцентрифужную трубку. Теплый DPBS и 50% LRWN CM на водяной бане 37 °C.
  2. Центрифугировать энтероидную/среду суспензией при 300 х г в течение 3 мин при РТ.
  3. Удалите носитель. Промыть энтероиды теплым 500 мкл DPBS.
  4. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин при RT. Удалите супернатант с помощью микропипетки.
  5. Повторите шаги 5.3-5.4 еще раз, в общей сложности два раза.
  6. После промывки добавьте 450 мкл теплого 50% LWRN CM (как подготовлено на этапе 1.3).
  7. Добавьте 50 мкл 2,5 мг/мл LY (конечная концентрация 0,25 мкг/мкл, см. Таблицу материалов) к каждой лунке и осторожно закрутите для смешивания. Поместите в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 2 ч.
  8. Аккуратно выложите суспензию энтероида/среды из каждой лунки в микроцентрифужную трубку.
  9. Центрифугу при 300 х г в течение 3 мин при РТ, затем удаляют супернатант, оставляя энтероидную гранулу позади.
  10. Промыть энтероиды 500 мкл теплым DPBS.
  11. Центрифугу при 300 х г в течение 3 мин при РТ, затем удаляют супернатант, оставляя энтероидную гранулу позади.
  12. Повторите шаги 5.10-5.11 еще три раза, чтобы выполнить в общей сложности четыре стирки.
  13. Повторно суспендируйте каждую гранулу с 1000 мкл холодного DPBS и энергично пипеткой вверх и вниз, чтобы диссоциировать энтероиды.
  14. Подготовьте стандарты для стандартной кривой LY, разбавленной в DPBS (100 нг/мл; 50 нг/мл; 25 нг/мл; 12,5 нг/мл; 6,25 нг/мл; 3,13 нг/мл; 1,57 нг/мл; 0 нг/мл).
  15. Пипетка 150 мкл каждого образца на скважину в трех экземплярах на 96-луночной пластине.
  16. Измерьте флуоресценцию при пике возбуждения 428 нм и пике излучения 536 нм на пластинчатом считывателе, способном считывать флуоресценцию (см. Таблицу материалов). Используя статистическое программное обеспечение (см. Таблицу материалов), рассчитайте концентрации путем интерполяции стандартной кривой и использования четырехпараметрической кривой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конформация АО
Энтероиды, суспендированные в 50% среде LWRN в течение 72 ч, предполагают конформацию AO (рисунок 1). Это было подтверждено иммунофлуоресцентным окрашиванием с использованием энтероидных целых маунтов апикального белка, zonula occludens-1 (ZO-1) и базолатерального белка, β-катенина (рисунок 1). Энтероиды AO показывают ZO-1 (зеленый) на наружной, апикальной поверхности энтероида, в то время как β-катенин (красный) нахо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кишечная проницаемость сложна и отражает функцию эпителиального барьера. Кишечный барьер содержит один слой эпителиальных клеток, который опосредует трансклеточный и параклеточный транспорт14. Параклеточная проницаемость зависит от плотного соединения белков, которые запечатывают пространство между эпителиальными клетками14. В этом параклеточном транспорте есть три различных пути, по которым молекулы могут пересекаться: поры, утечка и неограниченные15

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не сообщают о какой-либо имущественной или коммерческой заинтересованности в каком-либо продукте, упомянутом или концепции, обсуждаемой в этой статье.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Эшли Нельсон из Медицинского центра Университета Рочестера за ее инструментальную помощь с нашей энтероидной моделью. Мы также хотели бы поблагодарить отделение детской хирургии Университета Оклахомы за поддержку этого проекта. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Оклахомским центром исследований стволовых клеток для взрослых и грантом Пресвитерианского фонда здоровья No 20180587 присужден департаменту хирургии в Центре медицинских наук Университета Оклахомы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
[лей] 15-гастрин 1миллипор SigmaG9145-.1MG
100 &микро; m стерильное клеточное сетчатое фильтрCorning431752
100% LWRN кондиционированная средаИзготовлено на собственном производстве в соответствии с Miyoshi et al.12
24-луночный планшет для культуры тканейCorning3526
96-луночный черный, прозрачный нижний планшетGreiner Bio-One655090
A-83-01R& D Systems2939/10
Alexa Fluor 488 коза против кролика вторичная ab, 1:1000InvitrogenA-11034
Alexa Fluor 594 коза против мышей вторичная ab, 1:1000InvitrogenA-11032
Amphotericin BThermo Fisher Scientific15290026
Anti-zonula occludens-1 кролик первичный ab, 1:200Cell Signaling#D6L1E
Анти-&бета;-катенин мыши первичный ab, 1:100Cell Signaling#14-2567-82
B-27 добавка минус витамин АThermo Fisher Scientific17504-044
Barrier PAP penScientific Device Laboratory9804-02
BMM (Matrigel)CorningCB-40230C
Решение для восстановления клетокCorning354270
Ножницы
DMEMThermo Fisher Scientific11-965-118
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific11320-082
DPBSThermo Fisher Scientific14-190-144
Эпидермальный фактор роста (EGF)Millipore SigmaGF144
Этилендиаминтетрауксусный кислота (ЭДТА)Millipore SigmaEDS-500G
EVOS m7000 Система визуализацииInvitrogenAMF7000
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)Gemini Bio-Products100-525
Fluoroshield with DAPIMillipore SigmaF6057-20mL
Щипцы
гентамицинThermo Fisher Scientific15-750-060
Стеклянные покровные
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050-061
GraphPad Prism 9Dotmatics
ИнсулинThermo Fisher Scientific12585014
липополисахарид (ЛПС)Millipore SigmaL2630-25MG
Lucifer желтый CH, соль литияInvitrogenL453
Модульная камера инкубатораBillups Rothenberg Inc.MIC101
N-2 добавкаThermo Fisher Scientific17502-048
N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этан сульфоновая кислота (HEPES)Thermo Fisher Scientific15630-080
N-ацетилцистеинмиллипор SigmaA9165-5G
никотинамидмиллипор SigmaN0636-100G
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher Scientific15140-148
Охлаждаемая центрифуга
Холодильная настольная микроцентрифуга
RPMI 1640 СредняяThermo Fisher Scientific11875093
SB202190Millipore SigmaS7067-5MG
SpectraMax iD3 микропланшетный ридерМолекулярный устройства
Трубчатый револьверРотатор ThermoFisher Scientific88881001
Сверхнизкое вложение 24-луночный планшет для культивирования тканейCorning3473
Y-27632, ингибитор ROCK (RI)Tocris1254
для препарированиястеклас качающимся ведром

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492(2020).
  2. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761(2021).
  3. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  4. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194(2019).
  5. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  6. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  7. Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960(2017).
  8. Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186(2021).
  9. Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900(2019).
  10. Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
  11. Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383(2019).
  12. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  13. Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
  14. Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
  15. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
  16. Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677(2021).
  17. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  18. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871(2018).
  19. Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330(2021).
  20. Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи