Методическая статья

В городе Виво Широкоугольная и двухфотонная визуализация кальция с помощью мыши с помощью большого краниального окна

8.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64224

⸱

4 августа 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurophysiology, Faculty of Medicine, University of Yamanashi, 2Department of Neuropharmacology, Faculty of Medicine, University of Yamanashi, 3Yamanashi GLIA center, Interdisciplinary Graduate School of Medicine, University of Yamanashi, 4Department of Neurochemistry, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол описывает изготовление большого (6 х 3мм2) черепного окна с использованием пищевой пленки, прозрачного силикона и покровного стекла. Это краниальное окно позволяет проводить эксперименты in vivo с широкоугольной и двухфотонной визуализацией кальция на одной и той же мыши.

Аннотация

Широкоугольная визуализация кальция из неокортекса мыши позволяет наблюдать нейронную активность всей коры, связанную с различными функциями мозга. С другой стороны, двухфотонная визуализация может разрешать активность локальных нейронных цепей на уровне одной клетки. Крайне важно сделать большое краниальное окно для выполнения многомасштабного анализа с использованием обоих методов визуализации в одной мыши. Для этого необходимо удалить большой участок черепа и покрыть открытую кортикальную поверхность прозрачными материалами. Ранее для этой цели были разработаны стеклянные черепа и краниальные окна на полимерной основе, но эти материалы нелегко изготавливать. Настоящий протокол описывает простой способ изготовления большого черепного окна, состоящего из коммерчески доступной пленки из поливинилиденхлоридной (PVDC), прозрачной силиконовой пробки и покровного стекла. Для визуализации дорсальной поверхности целого полушария размер окна составлял примерно 6 х 3мм2. Сильные вибрации мозга не наблюдались независимо от такого большого окна. Важно отметить, что состояние поверхности мозга не ухудшалось более одного месяца. Широкопольная визуализация мыши, экспрессирующей генетически закодированный индикатор кальция (GECI), GCaMP6f, особенно в астроцитах, выявила синхронизированные ответы в нескольких миллиметрах. Двухфотонная визуализация той же мыши показала заметные реакции кальция в отдельных астроцитах в течение нескольких секунд. Кроме того, тонкий слой аденоассоциированного вируса был нанесен на пленку PVDC и успешно экспрессировал GECI в корковых нейронах над краниальным окном. Этот метод является надежным и экономически эффективным для создания большого черепного окна и облегчает исследование нейронной и глиальной динамики и их взаимодействий во время поведения на макроскопическом и микроскопическом уровнях.

Введение

Широкоугольная визуализация кальция эффективно исследует паттерн пространственно-временной активности на большой площади мозга животных 1,2,3. Широкоугольная визуализация широко используется для наблюдения за всей кортикальной поверхностью грызунов, поскольку их кора относительно плоская 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Трансгенные мыши или мыши, которым вводили аденоассоциированный вирус (AAV), которые специфически экспрессируют GECI в различных клетках, таких как нейроны и глиальные клетки, могут быть использованы для широкоугольной визуализации кальция 11,12,13. Однако пространственного разрешения этого метода обычно недостаточно для разрешения активности отдельных клеток in vivo14. Он также не подходит для визуализации клеток, расположенных в более глубоких слоях.

С другой стороны, двухфотонная кальциевая визуализация может наблюдать активность нескольких клеток одновременно с субклеточным пространственным разрешением, что позволяет наблюдать активность отдельных клеток даже в нейрональных дендритах и глиальных процессах 15,16,17,18,19,20,21,22. Он также может наблюдать клетки в более глубоких слоях коры головного мозга23,24. Хотя последние технологические достижения в области двухфотонной микроскопии позволяют получать изображения из областей коры шириной в миллиметр 25,26,27,28,29, все еще трудно наблюдать область, сопоставимую с широкоугольной визуализацией с помощью двухфотонной визуализации.

Чтобы понять физиологическую значимость активности мозга от одноклеточной к целой голове, важно преодолеть разрыв между активностью корковых областей по всей коре и активностью одноклеточных разрешений в локальных нейронных цепях. Поэтому комбинация широкоугольной и двухфотонной кальциевой визуализации, выполненной на одной и той же мыши, особенно эффективна. Чтобы реализовать это, необходимо создать широкое и стабильное черепное окно, в идеале в течение длительного периода.

Ранее было разработано несколько методов изготовления черепных окон, позволяющих выполнять широкоугольную и двухфотонную визуализацию в одной и той же мыши 30,31. Трапециевидной формы покрывают стеклянные окна (хрустальный череп), которые отливаются в форму кортикальной поверхности для замены удаленной кости, обеспечивают оптический доступ по всей коре32. Альтернативно, краниальные окна на полимерной основе могут быть изготовлены из полиэтилентерефталата (ПЭТ)33 или полиэтиленоксидного покрытия с аморфными фторполимераминанолиста 34. Было показано, что каждый метод поддерживает стабильное окно в течение более 1 месяца. Однако производить эти окна непросто, а используемые материалы и оборудование часто стоят дорого.

В настоящем исследовании описан новый метод изготовления большого черепного окна с использованием пленки PVDC (пластиковая пищевая пленка) (рисунок 1). Используя это окно, эксперименты in vivo с широкоугольной и двухфотонной визуализацией могут быть выполнены на одних и тех же мышах. Также было показано, что GECI могут быть экспрессированы в нейронах над широкой областью коры мышей, образуя тонкий слой пленки, содержащей частицы AAV на обертке.

Протокол

Экспериментальные процедуры были одобрены Экспериментальным комитетом на животных Университета Яманаси. В этом исследовании использовались дикие (C57BL/6J, Japan SLC) и трансгенные мыши, экспрессирующие мембранно-анкеровую GECI (Lck-GCaMP6f) в астроцитах. Трансгенные мыши были получены путем скрещивания мышей AldH1l1-CreERT2 [B6N. FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J, коммерчески полученный, см. Таблицу материалов] и мыши Flx-Lck-GCaMP6f [C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor/J, коммерчески полученные] мыши. Трансгенных мышей обрабатывали тамоксифеном (20 мг/мл) в течение 5 дней (0,05 мл/10 г веса тела, т..) для экспрессии GCaMP6f. Все используемые мыши были самцами и самками в возрасте не менее 4 недель. Схема окна показана на рисунке 1А, а хирургическая процедура обобщена на рисунке 1В.

1. Подготовка к операции на черепном окне

  1. Обезболивать мышей изофлураном (индукция: 3%, хирургическое вмешательство: 1%-1,5%, расход: 0,2-0,3 л/мин). Подтвердите глубину анестезии потерей рефлекса защемления хвоста или пальца ноги. Поддерживайте температуру тела с помощью грелки (36-38 °C). Нанесите глазную мазь ватным тампоном, чтобы глаза мышей не высохли под наркозом.
  2. Вводить 15% раствор маннитола (см. Таблицу материалов) внутрибрюшинно (3 мл/100 г массы тела). Закрепите головку мыши на стереотаксической рамке с ушными вкладышами. Удалите волосы с головы мыши с помощью бритвы и крема для удаления волос.
  3. Продезинфицируйте поверхность кожи повидоном-йодом и спиртом трижды. Применяют Лидокаин местно, чтобы обеспечить упреждающую анальгезию. Удалите кожу над интересующей областью хирургическими ножницами и обнажите череп (размер: 15 х 15 мм). Если кровотечение присутствует, используйте ватный тампон, чтобы остановить кровотечение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании кожа была удалена для наблюдения префронтальной коры к зрительной коре.
  4. Удалите надкостницу над обнаженным черепом с помощью микрокюретки и высушите поверхность черепа, чтобы прочно прикрепить головную пластину к черепу зубным цементом (см. Таблицу материалов) (рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовленная на заказ головная пластина создается с помощью 3D-принтера. Файл проекта депонируется в репозиторий Github (https://github.com/Satoshi-Manita/Head-plates).
  5. Прикрепите головную пластину с помощью зубного цемента (рисунок 2С). Подождите не менее 20 минут, пока цемент затвердеет. Закрепите головную пластину держателем35 головной пластины.

2. Изготовление краниального окна

  1. Удалите лишний цемент над черепом с помощью бормашины (см. Таблицу материалов). Будьте осторожны, чтобы не просверлить кость и не повредить мозг сверлением.
  2. Пометьте область, подлежащую вырезанию, ручкой и врежьте в кость скальпелем. Затушите кончик скальпеля, чтобы наконечник не проникал в череп (дополнительный рисунок 1). Обратитесь к атласу мозга, чтобы определить, где сделать окно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования было создано окно между -2 мм и +4 мм от брегмы в переднезадней оси и от сагиттального шва до +3 мм в медиолатеральной оси, включая двигательную, соматосенсорную и зрительную кору.
  3. Несколько раз соскоблите кость скальпелем, чтобы углубить бороздку, пока кость в области, подлежащей обрезке, не будет хорошо двигаться при легком прикосновении.
  4. Удалите разрезанную кость тонким пинцетом. Не проталкивайте костный лоскут в мозг, который может повредить мозг (рисунок 1Ba).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если кровотечение наблюдается после удаления кости, немедленно нанесите аспирацию и искусственную спинномозговую жидкость (ACSF, см. Таблицу материалов) и повторяйте этот процесс до тех пор, пока кровотечение не прекратится. В качестве альтернативы поместите гемостатическую желатиновую губку (около 3 мм квадратных кубиков), смоченную в ACSF, в точке кровотечения.
  5. Если длинная мозговая оболочка не удалена, перейдите к шагу 2.7.
  6. Удалите твердое тело, выполнив следующие действия.
    1. Удалите твердую мозговую оболочку, например, в следующих ситуациях; трансфекция с использованием фиброин-AAV пленочного метода36 и наблюдение за небольшими структурами, такими как дендритные шипы.
    2. Вырежьте твердую мозговую оболочку с помощью вытянутой стеклянной пипетки с коническим наконечником около 10 мкм. Чтобы распространить этот разрез на все окно, используйте U-образную иглу.
    3. Установите зум стереомикроскопа на 60-100x и удалите отрезанную твердую мозговую оболочку ультратонким пинцетом. Если удаление твердой мозговой оболочки вызывает кровотечение, промойте с помощью ACSF или используйте желатиновую губку, чтобы остановить кровотечение.
  7. Вырежьте оболочку PVDC.
    1. Стерилизуйте большой (например, 10 х 15 мм) кусок пленки PVDC (около 11 мкм, см. Таблицу материалов, рисунок 2Аа) автоклавированием и 70% этанолом.
    2. Под стереомикроскопом используйте пинцет и скальпель, чтобы вырезать обертку необходимого размера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер обмотки должен быть примерно на 10 мм больше, чем размер краниального окна, но меньше, чем отверстие головной пластины. Для краниального окна размером 6x 3 мм 2 подготовьте обертку 15 x 10 мм2 .
  8. Аккуратно поместите обертку, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Поместите обертку на поверхность мозга, оставив ACSF на поверхности. Высасывайте ACSF из края обертки, позволяя обертке прочно прилипать к поверхности мозга (рисунок 1Bb,c).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемое обертывание устойчиво к морщинам, поэтому простое размещение его на поверхности мозга почти не вызывает морщин.
    2. Обрежьте обертку скальпелем и пинцетом так, чтобы между краем краниального окна и обмоткой было поле примерно в 1 мм (рисунок 1Bd).
    3. Как только обертка будет на месте, приклейте край обертки к черепу биологическим клеем (см. Таблицу материалов, рисунок 2D). Дайте клею высохнуть около 30 минут.
  9. Нанесите прозрачный силиконовый эластомер.
    1. Нанесите коммерчески доступный прозрачный силиконовый эластомер (см. Таблицу материалов) поверх упаковки с помощью дозатора со смесительным наконечником (рисунок 1Be, 2A b-d) и поместите сверху покровное стекло (толщина 0,12-0,17 мм) (рисунок 2E).
    2. Запечатайте периметр покровного стекла водонепроницаемой пленкой, суперклеем или зубным цементом (рисунок 1Bf).
  10. После операции наблюдайте за мышью до тех пор, пока она не придет в сознание, чтобы сохранить стернальную лежачесть. После этого держите мышей по отдельности и позвольте им восстановиться в своей домашней клетке в течение не менее 7 дней.
    1. Чтобы уменьшить стресс и боль, вводят противовоспалительные и обезболивающие средства (например, дексаметазон и кетопрофен, по 5 мг/кг каждый, т..).
  11. Регулярно контролируйте мышей на предмет инфекции. Если инфекция подтверждена, вводят противомикробный препарат (например, 10% энрофлоксацин, 1,7 мкл / мл) в питьевую воду до тех пор, пока инфекция не будет устранена (обычно менее 4 недель).

3. Изготовление пленки AAV на полиэтиленовой пленке с использованием раствора фиброина

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 3 является необязательным.

  1. Готовят раствор фиброина из коконов тутового шелкопряда по ранее опубликованномуспособу 37.
    1. Вкратце, отварите коммерчески доступные обычные коконы тутового шелкопряда (5 г, см. Таблицу материалов) в растворе карбоната натрия (0,02 М, 2 л). Коконы вымойте в сверхчистой воде и высушите на ночь.
    2. Высушенные коконы растворяют в растворе бромида лития (9,3 М, 20% мас./об.миброина) при нагревании в духовке при 60 °С в течение 4 ч. Диализуют растворенный раствор кокона, центрифугу (дважды при 12 700 х г, при 4 °С в течение 20 мин)37 и собирают супернатант.
  2. Подготовьте фиброин-AAV пленку, выполнив следующие действия.
    1. Смешайте растворы фиброина и AAV20 в соотношении 1:4 в небольшой пробирке с помощью микропипетки. Капните аликвоту смешанного раствора фиброина-ААВ на полиэтиленовую пленку для черепного окна и высушите его не менее 3 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспрессии в области диаметром 3 мм применяют каплю раствора фиброина-ААВ объемом 5 мкл. Это соотношение определяет количество раствора для данной области.
    2. После высыхания нарежьте полиэтиленовую пленку на необходимый для окна размер (например, 10 х 15 мм) и поместите ее на поверхность мозга. Затем следуйте вышеупомянутому методу, начиная с шага 2.8.1 и далее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем поместить обертку на поверхность мозга, удалите ACSF на поверхности мозга как можно больше. Это связано с тем, что ожидается, что ACSF растворит фиброин-AAV пленку и уменьшит концентрацию частиц AAV.
    3. Подождите около 2-4 недель после создания окна, обработанного AAV, пока GECI не будут выражены в достаточной степени. Во время этого процесса регулярно проверяйте состояние мышей и окон.

4. Визуализация и анализ кальция

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о визуализации и анализе, пожалуйста, смотрите ранее опубликованные отчеты 1,2,38.

  1. Выполните широкоугольную визуализацию, выполнив следующие действия.
    1. Обездвижить мышь с помощью устройства фиксации головы под тандемным флуоресцентным макроскопом (см. Таблицу материалов).
    2. Освещайте кору головного мозга мышей светом возбуждения от светодиодного источника света 465 нм через фильтр возбуждения, дихроичное зеркало и объектив.
    3. Соберите флуоресцентные изображения коры головного мозга с помощью ПЗС-камеры через объектив (1,0x), дихроичное зеркало, эмиссионный фильтр и объектив изображения (2,0x). Комбинация этих линз дает общее увеличение около 0,5x.
    4. Получение изображений с частотой дискретизации 50 Гц. После сбора данных проанализируйте изображения с помощью программного обеспечения ImageJ. Выберите интересующий регион (ROI) вручную. Рассчитайте изменение флуоресценции в каждом ROI как ΔF/ F = (Ft - F0) / F0, где Ft - необработанное значение флуоресценции каждого кадра, а F0 - среднее значение флуоресценции, полученное из среднего изображения всех кадров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Макропрограмма для ImageJ депонируется в GitHub (https://github.com/Satoshi-Manita/ImageJ-macro), который вычисляет изображения ΔF / F по данным визуализации кальция.
  2. Выполните двухфотонную визуализацию, выполнив следующие действия.
    1. Обездвижите мышь под двухфотонным микроскопом с помощью устройства фиксации головы. Определите область, подлежащую изображению, с помощью микроскопа в режиме яркого поля с объективом с низким увеличением (5x).
    2. Переключитесь на двухфотонную визуализацию. Используйте объектив с большим увеличением (16x или 25x) и осветите лазер для двухфотонного возбуждения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленый Lck-GCaMP6f22 и красный XCaMP-R36 возбуждались сверхбыстрым лазером на длинах волн возбуждения 920 нм и 1070 нм соответственно.
    3. Получение флуоресцентных изображений с частотой 30 Гц. После сбора данных исправьте артефакты движения с помощью функции регистрации программного обеспечения suite2p39. Получение ROI и ΔF/F из изображений с использованием одного и того же метода для широкоугольной визуализации.
  3. Построение данных с помощью python со следующими библиотеками: NumPy, Matplotlib и Pandas (см. Таблицу материалов).

Результаты

Оценка большого краниального окна, выполненного методами обертывания PVDC
Сразу после операции успех или неудача могут быть проверены с первого взгляда состоянием кортикальной поверхности, таким как кровотечение и изменение цвета из-за повреждения или ишемии. В течение длительного времени после операции кортикальная поверхность может быть покрыта непрозрачной белой мембраной из-за инфекции, или кровь может покрывать окно из-за кровотечения (рисунок 2G). В этих случаях кора может быть не в здоровом состоянии, и визуализация может быть невозможна. Они могут быть вызваны частично разорванными обертываниями или недостаточной фиксацией обертывания клеем. Если инфекция наблюдается неоднократно, может быть эффективным применение антибиотиков, например, гентамицина сульфата (10 мкл, 50 мг/мл), над поверхностью мозга при размещении окна. Регенерация мозговых оболочек или костей также наблюдается, когда вертикальный зазор между кортикальной поверхностью и обертыванием большой. Чтобы предотвратить это, нанесение обертывания как можно плотнее на поверхность мозга во время подготовки окна имеет решающее значение. Этого можно достичь, поместив полиэтиленовую пленку на поверхность мозга и высасывая как можно больше ACSF. При отсутствии ACSF это можно сделать, просто поместив полиэтиленовую пленку на поверхность мозга. Мозг и кровеносные сосуды определяются как неповрежденные тем фактом, что цвет мозга не обесцвечен, а кровеносные сосуды не разорваны.

Долговечность окна во многом зависит от качества операции. Когда состояние хорошее, нет никаких признаков инфекции, кровотечения или регенерации более чем через 1 месяц после операции (рисунок 2F и рисунок 3B). У 8 из 10 мышей окно могло поддерживаться чистым до 10 недель или дольше. Окна у двух мышей не могли нормально поддерживаться из-за инфекции или кровотечения. Хотя большое окно может быть подвержено механическому воздействию или удару, разбитых или треснувших окон не наблюдалось.

Чтобы оценить качество изображения нового краниального окна с оберткой, силиконом и стеклом, функцию точечного распространения сравнивали под новым окном с функцией под обычным стеклянным окном путем визуализации флуоресцентных шариков размером 0,1 мкм в агаре (см. Дополнительный файл 1). Результаты не показали разницы в полной ширине при половинном максимуме (FWHM) для обоих условий. [Ось X (мкм): только стекло, 1,99 ± 0,07, обертка, 1,76 ± 0,13, ось Y (мкм): только стекло, 2,11 ± 0,27, обертка, 1,90 ± 0,15, ось Z (мкм): только стекло, 25,29 ± 0,71, обертка, 26,64 ± 1,02, N = 7 бусин, p > 0,05, тест Mann-Whitney U, дополнительный рисунок 2A, B]. Поэтому добавленные новые элементы (обертка и силикон) не ухудшали качество изображения.

Вибрационные артефакты, вызванные дыханием, сердцебиением и движением тела, присутствуют в широкоугольных и двухфотонных изображениях. Чтобы определить, насколько вибрирует новое краниальное окно, небольшую флуоресцентную частицу выбрали из данных двухфотонной визуализации in vivo и изучили, насколько ее изображение двигалось в течение 60 с. Было установлено, что стандартное отклонение центроида этой флуоресцентной частицы составляло около 0,3 мкм, что сопоставимо с таковым под обычным стеклянным окном (дополнительный рисунок 2C). Это указывает на то, что, поскольку мозг удерживался прозрачной силиконовой заглушкой и покровным стеклом, вибрации были сопоставимы с теми, которые наблюдались в обычных меньших окнах, а автономная регистрация изображения была достаточной для устранения вибрационных артефактов.

В широкоугольной визуализации кальция можно наблюдать распространение корковой активности по коре, индуцированной сенсорной стимуляцией (рисунок 3A-D, K-N). Двухфотонная визуализация позволила наблюдать одноклеточные флуоресцентные изображения, специфичные для нейронов и глиальных клеток (рисунок 3E, O). Флуоресцентные изменения, индуцированные сенсорной стимуляцией, могут наблюдаться в отдельных клетках (рисунок 3E-J, O-T).

Экспрессия генетически закодированных показателей кальция (GECI) в широкой области коры головного мозга с использованием обертывания PVDC и AAV
Оболочка PVDC для окна может быть применена для экспрессии функциональных белков в широкой области коры. Это достигается с помощью AAV и фиброина, компонентного белка коконов тутового шелкопряда, которые широко применяются в качестве биоматериалов37. Предыдущее исследование показало, что фиброин может быть смешан с AAV, образуя пленки, имплантированные в мозг для экспрессии функциональных белков, таких как фотоактивируемые опсины или GECI36. В настоящем исследовании AAV,экспрессирующие GECI и фиброин, были смешаны и высушены на обертке, а для черепного окна использовалась обертка с покрытием AAV. Это привело к экспрессии GECI над широкой областью коры через 2-4 недели после операции (рисунок 3K-M). Поскольку окно было большим, можно было визуализировать различные области коры одной и той же мыши (рисунок 3M-T).

Чтобы подтвердить эффективность экспрессии этого метода, количество клеток, экспрессирующих GECI, подсчитывали в фиксированном мозге (дополнительный рисунок 2D). Было обнаружено, что настоящая стратегия с использованием обертывания с фиброином-AAV привела к экспрессии GECI с эффективностью примерно 20% как в поверхностных, так и в более глубоких слоях (L2/3: 20,78%, экспрессирующая клетка XCaMP-R: 32 клетки, DAPI: 154 местоположения, L5: 20,08%, экспрессирующая клетка XCaMP-R: 51 клетка, DAPI: 254 места). Таким образом, этот метод экспрессировал GECI в клетках не только в поверхностных слоях, но и в более глубоких слоях.

Схема черепного окна крысы, показывающая установку для визуализации коры головного мозга с силиконом и покровным стеклом.
Рисунок 1: Концептуальная схема большого краниального окна. (А) Слева, схематический рисунок нового черепного окна. Он больше обычного окна (диаметр 3 мм). Справа, вид в поперечном сечении. Метод изготовления большого черепного окна использует пищевую пленку, прозрачный силиконовый эластомер и покровное стекло, что позволяет широкоугольную и двухфотонную визуализацию от одной и той же мыши. (B) Процедура изготовления черепных окон: а) Удаление кости. b) удаление АКФС под покровом. (c) Прикрепление обертывания к поверхности мозга путем удаления ACSF. d) удаление лишней пленки. е) нанесение прозрачного силикона. f) Прикрепление покровного стекла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Показана хирургическая процедура имплантации краниального окна с экспериментальным оборудованием и результатами.
Рисунок 2: Обзор хирургии черепного окна. (A) Материалы и оборудование, необходимые для краниального окна. а) пленка для обертывания поливинилиденхлорида (PVDC). b) дозатор прозрачного силиконового эластомера с смесительным наконечником. с) Закрывающее стекло. d) прозрачный силикон, помещенный между двумя кусками покровного стекла. (B) Фотография кожи головы мыши, вырезанной для обнажения черепа. Мышь была обезболена, а голова мыши была обездвижена с помощью ушных вкладышей. Затем голова была очищена, обработана местной анальгезией, а кожа была разрезана. С) Фотография после установки головной пластины. Головная пластина (изготовленная из смолы с 3D-принтера) была прикреплена к головке мыши зубным цементом. (D) Фотография краниального окна. Краниальное окно было создано в коре правого полушария мозга мыши. Твердая мозговая оболочка была удалена, а обертка приклеена на место. (E) Фотография окна, изготовленного из пленки с прозрачным силиконом и закрывающим стеклом сверху. (F) Типичный пример успешного окна (правое полушарие, через 7 недель после операции). (G) Пример неисправного окна (оба полушария, через 5 недель после операции). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Визуализация кальция у мышей с помощью ТГ, показывающая реакцию на затяжку воздуха; диаграммы и графики анализа данных ΔF/F.
Рисунок 3: Большое окно позволяет получать широкоугольную и двухфотонную визуализацию кальция от одной и той же мыши. (А) Кальциевая визуализация была выполнена у трансгенной мыши, экспрессирующей мембранно-закрепленный GECI (Lck-GCaMP6f) в астроцитах40. (B) Слева было создано большое окно с полиэтиленовой пленкой, прозрачным силиконом и закрывающим стеклом. Через это окно была выполнена широкоугольная визуализация. Справа, фотография была сделана через 79 дней после установки краниального окна. (C) При применении стимуляции воздухом к контралатеральным усам наблюдались флуоресцентные изменения. (D) Был построен временной ход изменения флуоресценции в соматосенсорной коре (красный квадрат в С). Красные и синие полосы обозначают время воздушной затяжки и время «до», «во время» и «после» в (C) соответственно. (E) Поле зрения (FOV 1 в C) двухфотонной визуализации кальция. Поскольку экспрессировалось, что GCaMP6f локализуется на мембране, области, представляющие интерес (белые квадраты), были вручную размещены для обнаружения местного ответа в процессах астроцитов. (F) Показаны изменения флуоресценции цветных квадратов в (E). (G) Показаны изменения флуоресценции во всех квадратах (E). Горизонтальная и вертикальная оси указывают время и номер ячейки соответственно. (Н-Дж) Показаны данные для FOV 2 (в зрительной коре) в (C). FOV 2 был сфотографирован после визуализации в FOV 1. (K) Красный GECI, XCaMP-R, был экспрессирован в нейронах методом фиброина-AAV у мыши дикого типа. (L) Фотография, сделанная через две недели после операции, в которой окно было создано с использованием фиброновой пленки. (M) Широкоугольная визуализация кальция была выполнена на этой мыши. (N) Изменение флуоресценции, вызванное стимуляцией усов, было построено из наиболее заметного участка (соматосенсорная кора, красный квадрат в (M)). Красные и синие линии обозначают время воздушной затяжки и время «до» и «во время» в (M) соответственно. (O) Поле зрения (соматосенсорная кора, FOV 1 in (M)) двухфотонной визуализации кальция на глубине 300 мкм. ROI вручную помещали в нейронные соматы. (P) Показаны изменения флуоресценции цветных квадратов в (O). (Q) Изменения флуоресценции во всех квадратах (O) отображаются цветом. (Р-Т) Показаны данные для FOV 2 в (M), расположенных в теменной коре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Наконечники для скальпелей. Кончик нового скальпеля (сверху) по сравнению со скальпелем, используемым для разрезания черепа с затупленным кончиком (снизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Валидация нового краниального окна и метода экспрессии фиброин-AAV. (A) Профиль интенсивности флуоресценции флуоресцентных шариков в агаре 0,1 мкм. Верхний ряд показывает данные из состояния, в котором только покровное стекло было помещено поверх флуоресцентных бусин, смешанных в агаре, а нижний ряд показывает данные из состояния, в которое были помещены обертка, прозрачный силикон и покровное стекло. Серые следы показывают соответствие Гаусса профилю интенсивности флуоресценции для каждой бусины, а красные следы показывают их средние значения (n = 7). (B) Резюме данных в пункте (А). Каждый график показывает полную ширину в половину максимума (FWHM) функции точечного спреда на оси XYZ. Серый график показывает данные для каждой бусины, а красный показывает их среднюю и стандартную ошибку. (C) Из 2000 кадров (запись 60 с) данных визуализации in vivo была выбрана небольшая флуоресцентная частица и изучено, насколько изображение двигалось в течение 60 с. Флуоресцентное изображение в центре представляет собой в среднем 2000 кадров. Изображения проецировались путем усреднения в направлениях осей X и Y. Гистограммы показывают распределение центроида в каждом кадре. Стандартными отклонениями центроида были X: 0,36 и Y: 0,315 мкм. (D) Пример экспрессии GECI методом фиброин-AAV. Слева: на срезе коры головного мозга применен метод экспрессии фиброин-AAV. Красный и синий обозначают флуоресценцию от XCaMP-R и DAPI соответственно; XCaMP-R экспрессировали не только в клетках слоя 2/3, но и в клетках слоя 5. По центру и справа. Увеличенные виды слоев 2/3 и 5 на левом рисунке (голубые квадраты) соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: (A) Эффективность экспрессии обертывания методом фиброин-AAV пленки и (B) Оценка функции точечного распространения во время двухфотонной визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

В данной статье представлен недорогой способ создания большого черепного окна с использованием полиэтиленовой пленки PVDC, прозрачного силикона и покровного стекла. Используя этот метод, мы показали, что широкоугольная визуализация кальция может быть выполнена над широкой областью коры головного мозга. Двухфотонная визуализация кальция может быть выполнена из нескольких различных областей коры у одной и той же мыши, которая подверглась широкоугольной визуализации. Кроме того, было показано, что фиброин-AAV пленка на пластиковой пленке, используемой для окна, может экспрессировать GECI над широкой областью коры.

Критические шаги
Важно избегать инфицирования и повреждения головного мозга при изготовлении черепных окон с использованием полиэтиленовой пленки. В этих условиях нейронная и глиальная активность не могут наблюдаться, а визуализация более глубоких областей невозможна. Повреждение кровеносных сосудов также приводит к кровотечению, что делает визуализацию невозможной из-за крови. Чтобы избежать инфекции, важно сделать поверхность мозга и обертку прикрепленной как можно плотнее, высасывая ACSF. Введение маннитола важно, чтобы избежать повреждения мозга и кровеносных сосудов, предотвращая повышенное давление в мозге во время операции. Это поддерживает пространство между поверхностью мозга и твердой мозговой оболочкой и предотвращает прикосновение к мозгу и кровеносным сосудам во время удаления черепа и твердой мозговой оболочки. Стереомикроскоп с большим увеличением и пинцет с острыми наконечниками также эффективны для точной операции.

В методе фиброин-ААВ важно использовать коконы из плоти шелкопряда, не замораживать раствор фиброина, достаточно сушить раствор фиброина-ААВ и наносить достаточный объем раствора (5 мкл на 3 мм диаметра). Когда использовались старые коконы, эффективность экспрессии была ниже. Это связано с тем, что фиброин из старых коконов может быть легко денатурирован. Когда раствор фиброина замораживали при -80 °C и размораживали во время использования, эффективность экспрессии была низкой. Это может быть связано с денатурацией белка из-за замораживания и оттаивания. Поскольку растворы фиброина, хранящиеся при 4 °C, могут быть эффективно использованы до гелеобразования, рекомендуется, чтобы растворы фиброина хранились в холодильнике и очищались от коконов снова после гелеобразования. Раствор фиброина-ААВ следует сушить в течение не менее 3 ч, так как экспрессия плохая менее чем через 3 ч. Наконец, область экспрессии зависит от количества используемого раствора фиброина-AAV. В примере на рисунке 3M количество было небольшим (5 мкл); таким образом, фиброин-AAV пленка покрывала только верхнюю половину окна, что приводило к неравномерному выражению над окном. Если используется достаточное количество фиброина-AAV, выражение будет равномерным по всему окну.

Модификации техники
Новый метод черепного окна позволяет исследовать макроскопическую активность корковых цепей и лежащую в их основе активность на уровне одной клетки у одной и той же мыши. Таким образом, метод может быть применен к различным исследованиям в области неврологии. Например, его можно использовать для наблюдения за активностью коры во время принятия решений, моторного обучения, а также в мышиных моделях черепно-мозговых травм и заболеваний. Мы также считаем, что метод может быть применен не только к грызунам, но и к нечеловеческим приматам.

В этой статье показано, что большое краниальное окно эффективно для визуализации трансгенных мышей и мышей, которым вводят AAV,экспрессирующие функциональные белки. В частности, показано, что фиброин-AAV пленка на обертке намного проще, чем обычный метод инъекции AAV для экспрессии GECI через широкую область коры. Используя смесь двух AAV, кодирующих GECI разных цветов41, корреляция между активностью нейронов и глиальных клеток может быть одновременно визуализирована на широкой области коры. Кроме того, метод фиброин-AAV пленки также может быть применен к другим генетически закодированным биосенсорам 42,43,44,45,46,47.

Также возможно большее краниальное окно, которое может отображать оба полушария. Двухфотонные микроскопы с гораздо более широким полем зрения (~25мм2) недавно были разработаны 25,26,27,28,29. Сочетание этого метода двухфотонной визуализации с однофотонной широкоугольной визуализацией с использованием широкого черепного окна, описанного здесь, позволит нам изучить взаимосвязь между активностью популяции и активностью одиночных клеток с беспрецедентных масштабов.

Ограничения
Пищевая обертка не пропускает никаких веществ. Это затрудняет использование метода для фармакологических экспериментов. Также трудно снять обертку, что делает невозможным вставку стеклянной пипетки или электрода. Поэтому трудно проводить эксперименты в сочетании с другими методами, такими как одновременная визуализация кальция и электрофизиологические записи, а также местное введение лекарств с использованием стеклянной пипетки. Возможным решением этих ограничений является использование обертывания и стеклянного окна с отверстием. Это позволяет получить доступ к мозгу через стеклянную пипетку или записывающий электрод, сохраняя при этом краниальное окно стерильным в течение длительного периода48.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A) «Glial Decoding» (JP21H05621 to SM), JSPS KAKENHI (JP19K06883 to SM, 15KK0340 to ES, JP22H00432, JP22H05160, JP17H06312 to HB и JP17H06313 to KK), Grant-in-Aid for Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/MINDS) (JP19dm02079h0002 to SM, JP19dm0207079 to HB и JP19dm0207080 to KK), Narishige Neuroscience Research Foundation (to SM), Грант для молодых исследователей из префектуры Яманаси (в SM) и Научного фонда Такэда (в SM) и частично поддерживается грантом Frontier Brain Research Grant от Университета Яманаси.

Мы благодарим Н. Ягути и К. Окадзаки за уход за животными и техническую помощь, а также членов лаборатории Китамура за полезные обсуждения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4% параформальдегидфосфатный буферный растворNACALAI TESQUE, Киото, ЯпонияTritonXЭкспрессия обертывания методом пленки фиброин-AAV
50 мл стакана
Программное обеспечение для сбораBrain visionBV_AnaДля широкопольной визуализации кальция GCaMP6f
Программное обеспечение для сбора данныхHamamatsu фотоника Программноеобеспечение для высокоскоростной записи: HSRДля широкопольной визуализации кальция XCaMP-R
Программное обеспечение для сбора данныхVibrio TechnologiesscanImageДля двухфотонной визуализации кальция
ACSF (искусственная спинномозговая жидкость)150 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 2 мМ CaCl<суб>2, 1 мМ MgCl<суб>2, pH = 7,4 с
помощью аспирационной иглы
1M NaOH ACSFАденоассоциированный вирусVectorBuilderизготовлен на заказAAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R
Клеи для биологического примененияDaiichi SankyoAron Alpha-A
Наркозный аппаратShinano seisakushoSN-487
АнестетикKyoritsu Seiyaku CorporationпентобарбиталЭкспрессия эффективности обертывания методом пленки фиброин-AAV
Вспомогательный Накладка для наушниковNarishigeEB-5N
CCD камераBrain visionMiCAM02-HRДля широкоугольной визуализации кальция GCaMP6f
Прозрачный винилполисилоксанGCExaclear
CMOS камераHamamatsu фотоникаORCA-sparkДля широкоугольной визуализации кальция XCaMP-R
Ватный тампон
Защитное стеклоМацунами18 x 18 No1Размер: 18 x 18 мм, Толщина: 0,13-0,17 мм, Боросиликатное стекло
DAPIThermo FisherD1306Эффективность сцеживания обертывания методом фиброин-AAV пленкой
Ddialysis кассета3,5K MWCO, Slide-A-LyzerThermoFisher
Dental адгезивная смола цементSUN MEDICALSuper-Bond
Стоматологическая бормашинаNakanishiVOLVERE Vmax
Цифровые весыDretecKS-243
ФильтрыBrain visionEM: BP466/40-25, DM: DM506, Ex: BP520/36-50
ФильтрыOlympusU-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ
Флуоресцентный микроскопKeyenceBZ-X810Эффективность экспрессии обертывания методом пленки фиброин-AAV
Флуоресцентные шарикиFluoresbrite YG Carboxylate Microspheres0.1 &; mОценка функции разброса точки при обычном и новом краниальных окнах в двухфотонной визуализации
ЩипцыFSTNo11252-20тонкоконцевые, для удаления твердой мозговой оболочки
ЩипцыKFIK-7, No.J 18-8для общего применения
Желатин для гемостазаJohnson & JohnsonSpongostan
Гентамицина сульфатIwaki seiyaku
Стеклянная пипеткана заказ
Средство для удаления волосReckitt JapanVeet
Head фиксирующее устройствозаказкраниотомия для кортикального напряжения-чувствительного красителя Визуализация у мышей. Судзуки, Т., и Мураяма, М. Биопротокол 2016 6:e1722.
Накладказаказиз алюминия или смолы, размер: 40 x 25 мм, толщина: 1,5 мм или 2 мм, отверстие в центре: 15 x 10 мм (head_plate_06 v3.f3d)
Грелка Программное
обеспечение для обработки изображений (для анализа данных визуализации кальция)ImageJhttps://imagej.net
IsofluranePfizer
Источник светаHayashi-repicLA-HDF108AA
Источник светаЗрение мозгаLEX2-LZ4-BДля широкопольной визуализации кальция GCaMP6f
Источник светаOlympusU-HGLGPSДля широкопольной визуализации кальция XCaMP-R
Раствор маннитола (15% с физиологическим раствором)Sigma-Aldrich (Merck)M4125
МикрокюреткаFSTNo10080-05
МикроскопЗрение головного мозгаДля широкопольной визуализации кальция GCaMP6f
Игла (30 г)
Полиэтиленовые споидыAS ONE1-4656-01
Пленка из поливинилиденхлорида (PVDC)Asahi KaseiAsahi Wrap (или Saran Wrap)
Повидон-йодMundipharmaIsodine
Python libraliesNumPyпакет для научных вычислений, https://numpy.org/doc/stable/index.html Библиотека #
Matplotlibдля визуализации, инструмент анализа
pandas, https://pandas.pydata.org
Бритва ScalpelKaiNo. 11
для животных
Силиконовые дозаторыGC
Кокон тутового шелкопрядаSatoyama Craft Newshttps://sato-yama.jp/
СтереомикроскопLEICAMZ6объектив объектив: 0,63x, окуляр: 25x
Поверхностно-активное веществоNACALAI TESQUETritonXЭкспрессия эффективности обертывания методом фиброин-AAV пленкой
Хирургические ножницыFSTNo91460-11
Шприц для маннита ИнъекцияTerumo1 мл
трансдермального анестетикаAstraZenecaLidocaine
Трансгенные мыши использовали для кальциевой визуализации астроцитовМышей получали следующим методом.
AldH1l1-CreERT2 мыши: B6N. FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (Лаборатория Джексона, штамм #: 031008)
Тамоксифен-индуцируемая экспрессия Cre-рекомбиназы, направленная на высоких уровнях на подавляющее большинство астроцитов
Flx-Lck-GCaMP6f мыши: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (Лаборатория Джексона, штамм #: 029626)
Cre-зависимая экспрессия GCaMP6f, нацеленного на плазматическую мембрану.
Мышь, рожденную от скрещивания, этих мышей обрабатывали тамоксифеном (20 мг/мл) в течение 5 дней ( 0,05 мл/10г массы тела, внутривенно) для выражения GCaMP6f.
Настраиваемые сверхбыстрые лазерыSpectra-PhysicsInSight X3Для двухфотонной визуализации кальция
Водонепроницаемая пленкаNichibanBFR5
Мыши дикого типаЯпония SLCC57BL/6JСамцы и самки, возраст >4 недели
данных на на Микроскоп Olympus MVX10 Для широкопольной визуализации кальция XCaMP-R Микроскоп Sutter Instruments MOM Для двухфотонной визуализации кальция Микрослайсер Dosaka EM DTK-1000N Эффективность экспрессии обертки методом пленки фиброин-AAV Смесительный наконечник GC и обработки данных https://matplotlib.org/stable/index.html#

Ссылки

  1. Ren, C., Komiyama, T. Wide-field calcium imaging of cortex-wide activity in awake, head-fixed mice. STAR Protocols. 2 (4), 100973(2021).
  2. Couto, J., et al. Chronic, cortex-wide imaging of specific cell populations during behavior. Nature Protocols. 16 (7), 3241-3263 (2021).
  3. Kauvar, I. V., et al. Cortical Observation by Synchronous Multifocal Optical Sampling Reveals Widespread Population Encoding of Actions. Neuron. 107 (2), 351-367 (2020).
  4. Clancy, K. B., Orsolic, I., Mrsic-Flogel, T. D. Locomotion-dependent remapping of distributed cortical networks. Nature Neuroscience. 22 (5), 778-786 (2019).
  5. MacDowell, C. J., Buschman, T. J. Low-dimensional spatiotemporal dynamics underlie cortex-wide neural activity. Current Biology. 30 (14), 2665-2680 (2020).
  6. Makino, H., et al. Transformation of cortex-wide emergent properties during motor learning. Neuron. 94 (4), 880-890 (2017).
  7. Murphy, T. H., et al. Automated task training and longitudinal monitoring of mouse mesoscale cortical circuits using home cages. eLife. 9, 559654(2020).
  8. Rynes, M. L., et al. Miniaturized head-mounted microscope for whole-cortex mesoscale imaging in freely behaving mice. Nature Methods. 18 (4), 417-425 (2021).
  9. Cardin, J. A., Crair, M. C., Higley, M. J. Mesoscopic imaging: Shining a wide light on large-scale neural dynamics. Neuron. 108 (1), 33-43 (2020).
  10. Ren, C., Komiyama, T. Characterizing cortex-wide dynamics with wide-field calcium imaging. The Journal of Neuroscience. 41 (19), 4160-4168 (2021).
  11. Hamodi, A. S., Martinez Sabino, A., Fitzgerald, N. D., Moschou, D., Crair, M. C. Transverse sinus injections drive robust whole-brain expression of transgenes. eLife. 9, 53639(2020).
  12. Michelson, N. J., Vanni, M. P., Murphy, T. H. Comparison between transgenic and AAV-PHP.eB-mediated expression of GCaMP6s using in vivo wide-field functional imaging of brain activity. Neurophotonics. 6 (2), 025014(2019).
  13. Oomoto, I., et al. Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection. STAR Protocols. 2 (4), 101007(2021).
  14. Fan, J. T., et al. Video-rate imaging of biological dynamics at centimetre scale and micrometre resolution. Nature Photonics. 13 (11), 809-816 (2019).
  15. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nature Neuroscience. 18 (12), 1713-1721 (2015).
  16. Grienberger, C., Chen, X., Konnerth, A. Dendritic function in vivo. Trends in Neurosciences. 38 (1), 45-54 (2015).
  17. Takahashi, N., et al. Locally synchronized synaptic inputs. Science. 335 (6066), 353-356 (2012).
  18. Kitamura, K., Hausser, M. Dendritic calcium signaling triggered by spontaneous and sensory-evoked climbing fiber input to cerebellar Purkinje cells in vivo. The Journal of Neuroscience. 31 (30), 10847-10858 (2011).
  19. Manita, S., et al. A top-down cortical circuit for accurate sensory perception. Neuron. 86 (5), 1304-1316 (2015).
  20. Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
  21. Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
  22. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the complexities of astrocyte calcium signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  23. Tischbirek, C., Birkner, A., Jia, H., Sakmann, B., Konnerth, A. Deep two-photon brain imaging with a red-shifted fluorometric Ca2+ indicator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11377-11382 (2015).
  24. Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLife. 6, 26839(2017).
  25. Demas, J., et al. cortex-wide volumetric recording of neuroactivity at cellular resolution using light beads microscopy. Nature Methods. 18 (9), 1103-1111 (2021).
  26. Ota, K., et al. cell-resolution, contiguous-wide two-photon imaging to reveal functional network architectures across multi-modal cortical areas. Neuron. 109 (11), 1810-1824 (2021).
  27. Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. eLife. 5, 14472(2016).
  28. Stirman, J. N., Smith, I. T., Kudenov, M. W., Smith, S. L. Wide field-of-view, multi-region, two-photon imaging of neuronal activity in the mammalian brain. Nature Biotechnology. 34 (8), 857-862 (2016).
  29. Yu, C. H., Stirman, J. N., Yu, Y., Hira, R., Smith, S. L. Diesel2p mesoscope with dual independent scan engines for flexible capture of dynamics in distributed neural circuitry. Nature Communications. 12 (1), 6639(2021).
  30. Barson, D., et al. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nature Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
  31. Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 2852-2866 (2016).
  32. Kim, T. H., et al. Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex. Cell Reports. 17 (12), 3385-3394 (2016).
  33. Ghanbari, L., et al. Cortex-wide neural interfacing via transparent polymer skulls. Nature Communications. 10 (1), 1500(2019).
  34. Takahashi, T., Zhang, H., Otomo, K., Okamura, Y., Nemoto, T. Protocol for constructing an extensive cranial window utilizing a PEO-CYTOP nanosheet for in vivo wide-field imaging of the mouse brain. STAR Protocols. 2 (2), 100542(2021).
  35. Suzuki, T., Murayama, M. Craniotomy for cortical voltage-sensitive dye imaging in mice. Bio-Protocol. 6 (3), 1722(2016).
  36. Jackman, S. L., et al. Silk fibroin films facilitate single-step targeted expression of optogenetic proteins. Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).
  37. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
  38. Jia, H., Rochefort, N. L., Chen, X., Konnerth, A. In vivo two-photon imaging of sensory-evoked dendritic calcium signals in cortical neurons. Nature Protocols. 6 (1), 28-35 (2011).
  39. Pachitariu, M., et al. Suite2p: beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , 061507(2017).
  40. Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
  41. Inoue, M., et al. Rational engineering of XCaMPs, a multicolor GECI suite for in vivo imaging of complex brain circuit dynamics. Cell. 177 (5), 1346-1360 (2019).
  42. Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
  43. Sun, F., et al. A genetically encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
  44. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  45. Feng, J., et al. A genetically encoded fluorescent sensor for rapid and specific in vivo detection of norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
  46. Piatkevich, K. D., et al. Population imaging of neural activity in awake behaving mice. Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).
  47. Sabatini, B. L., Tian, L. Imaging neurotransmitter and neuromodulator dynamics in vivo with genetically encoded indicators. Neuron. 108 (1), 17-32 (2020).
  48. Roome, C. J., Kuhn, B. Chronic cranial window with access port for repeated cellular manipulations, drug application, and electrophysiology. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 379(2014).

Перепечатки и разрешения

Теги

AAV
В городе Виво Широкоугольная и двухфотонная визуализация кальция с помощью мыши с помощью большого краниального окна
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.