Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка выхода соединений на пластине TLC с помощью метода сине-светодиодного освещения

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64230

⸱

6 октября 2022 г.

 , 
1Department of Marine Biotechnology and Resources, National Sun Yat-sen University, 2Doctoral Degree Program in Marine Biotechnology, National Sun Yat-sen University

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем протоколе разработан метод оценки выхода соединений на пластине TLC с использованием метода сине-светодиодного освещения. Преимущества такого подхода заключаются в том, что он безопасен, эффективен, недорог и позволяет исследователю измерять несколько образцов одновременно.

Аннотация

Тонкослойная хроматография (TLC) является доступным аналитическим методом, который широко используется в исследованиях органической химии для количественной оценки выхода неизвестных образцов. В настоящем исследовании был разработан эффективный, дешевый и безопасный метод оценки выхода образцов на пластине TLC с использованием синего светодиодного осветителя. Ловастатин, извлеченный из Aspergillus terreus , был примером соединения, используемого в настоящем исследовании. Регрессионные модели, основанные на стандарте ловастатина, были использованы для оценки выхода ловастатина. Сравнивались три метода: биоанализ, УФ-детектирование и сине-светодиодное освещение. Результат показал, что метод сине-светодиодного освещения значительно более эффективен по времени, чем методы обнаружения ультрафиолета и биоанализа. Кроме того, синее светодиодное освещение было относительно безопасным вариантом из-за обеспокоенности биологическими опасностями в методе биоанализа (например, микробная инфекция) и ультрафиолетовым воздействием в методе обнаружения ультрафиолета. По сравнению с дорогостоящими методами, требующими специализированных приборов и длительного обучения перед самостоятельной работой, такими как GC, HPLC и HPTLC, использование синего светодиодного осветителя было экономичным вариантом для оценки выхода образцов из пластины TLC.

Введение

Тонкослойная хроматография (ТЛК) широко используется как качественная и количественная методика в области органической химии 1,2,3. Основными преимуществами TLC являются то, что он обеспечивает быстрое обнаружение, гибкие требования к образцам и не требует специализированного оборудования4. На сегодняшний день, несмотря на то, что было установлено много передовых подходов, TLC по-прежнему является основным методом идентификации неизвестных образцов в смеси. Однако проблема этого подхода заключается в отсутствии безопасного и недорогого оборудования для количественной оценки выхода проб, особенно для развивающихся лабораторий с ограниченными бюджетами. Таким образом, настоящее исследование было направлено на разработку эффективного, безопасного и недорогого метода в сочетании с TLC для оценки выхода образцов.

В отличие от высокоэффективного TLC (HPTLC), высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и газовой хроматографии (GC) со строгими требованиями к образцам, трудоемкими и участием многоступенчатой для пробоподготовки 1,5, TLC показал ряд преимуществ. Во-первых, для пробоподготовки ВЭЖХ и ГК не могут обнаружить сырой экстракт, поскольку сырой экстракт может заткнуть колонну ВЭЖХ и ГХ. Во-вторых, когда образцы не подходят для УФ-излучения (важно для анализа ВЭЖХ) или с низкой летучестью (важно для анализа ГК), К этим образцам может быть применен TLC, а использование реагента визуализации делает изолированные образцы видимыми на тонких слоях 6,7,8. В-третьих, для обычных пользователей ВЭЖХ и ГК, как правило, требуют относительно длительного времени предварительной подготовки перед самостоятельной работой по сравнению с TLC. Кроме того, количественный анализ TLC, известный как высокопроизводительный TLC (HPTLC), может оцифровать информацию на пластине TLC с помощью высокочувствительного сканера. Однако стоимость системы ВЭЖХ относительно дорогая. Таким образом, разработка экономически эффективного и быстрого подхода к количественной оценке образцов на пластине TLC является важной темой.

Аналогичные методы были разработаны для количественной оценки урожайности TLC; Например, Джонсон9 сообщил о методе, который позволяет количественно оценить образцы на пластине TLC с помощью планшетного сканера, подключенного к компьютеру. В 2001 году El-Gindy et al.10 разработали TLC-денситометрический метод, который использовался для обнаружения соединения с оптической плотностью, и этот метод также был применен Elkady et al.11. В 2007 году Hess2 представил метод цифрового усовершенствования TLC (DE-TLC), применяемый для обнаружения выхода соединения на пластине TLC с использованием цифровой камеры в сочетании с ультрафиолетовым светом. Гесс также сравнил разницу в стоимости между методом HPTLC и DE-TLC и пришел к выводу, что метод DE-TLC может использоваться в лабораториях средней школы и колледжа из-за его доступной стоимости2. Тем не менее, стоимость TLC-денситометрического метода все еще была дорогой, и работа ультрафиолетового света требует адекватной предварительной подготовки на случай, если пользователи могут подвергнуться воздействию ультрафиолетового излучения. Поэтому, совместимый с TLC, желательно разработать эффективный, безопасный и недорогой метод количественной оценки выхода образца.

В настоящем исследовании описан протокол обнаружения образца на пластине TLC с использованием синего светодиодного осветителя и разработана регрессионная модель с высокой надежностью (высоким значением R-квадрата) для измерения размеров полос, а затем определения выхода соединения. Наконец, было установлено, что метод сине-светодиодного освещения является относительно безопасным (vs. Метод УФ-детектирования), дешевый (vs. GC, ВЭЖХ и ВЭЖХ) и эффективный (по сравнению с методом биоанализа) подход к количественной оценке урожайности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Настоящий протокол описан на примере ловастатина. Ловастатин был извлечен из недельного Aspergillus terreus.

1. Экстракция соединений

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об извлечении соединений см. Рисунок 1.

  1. Культура Aspergillus terreus на картофельный агар декстрозы (КПК, см. Таблицу материалов) в среде при 30 °C.
  2. Высушите культуру при 40 °C в течение 24 ч. Переложите высушенную культуру в 50 мл пробирку с помощью стерилизованного пинцета и добавьте 15 мл этилацетата.
  3. Смесь энергично встряхнуть вихрем в течение 1 мин и инкубировать в течение 1 ч при 40 °С с встряхиванием при 200 об/мин.
  4. Обжайте смесь ультразвуком с помощью ультразвуковой ванны 40 кГц (см. Таблицу материалов) при 40 °C в течение 1 ч.
  5. Центрифугируйте смесь при 5000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре и фильтруйте через фильтровальную бумагу 11 мкм.
  6. Экстрагировать фильтрат равным объемом стерильной воды в сепараторную воронку.
  7. После разделения фаз собирают органический слой, а затем испаряют во вращающемся испарителе (см. Таблицу материалов). Растворить остаток в 2 мл этилацетата.

2. Разделение сырого экстракта по адсорбционной колонне нормальной фазы (NP)

  1. Упакуйте колонку силикагелем NP в качестве стационарной фазы и используйте n-гексан:этилацетат:трифторуксусную кислоту (H:E:T; 80:20:0.1, v/v/v) в качестве подвижной фазы.
  2. Загрузите 2 мл экстракта (стадия 1) на колонну и добавьте растворитель подвижной фазы со скоростью потока 1 мл/мин для элюляции экстракта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока управлялась вручную с помощью запорного крана.
  3. Проверьте сточные воды с помощью TLC, чтобы подтвердить наличие ловастатина, а затем испарите во вращающемся испарителе при 45 °C до тех пор, пока растворитель не будет удален. Этот шаг занимает примерно 20-25 минут.
  4. Растворяют остаток в 1 мл этилацетата, а затем смешивают с равным объемом 1% трифторуксусной кислоты.
  5. Центрифугируйте смесь при 5000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре и соберите органический слой в новую стеклянную трубку.

3. Подготовка и загрузка пластин тонкослойной хроматограммы (TLC)

  1. Нанесите 5 мкл образцов и эталонов ловастатина (см. Таблицу материалов) на базовую линию пластины TLC с помощью капиллярной пипетки, оставив границу 1 см по бокам пластины TLC.
  2. Высушите пластину TLC в вытяжном шкафу в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Аккуратно поместите пластину щипцами в насыщенную стеклянную камеру, содержащую растворитель подвижной фазы. Накройте камеру стеклянной крышкой и дайте пластине полностью развиться.
  4. Снимите пластину из камеры, когда линия растворителя достигнет 1 см от верхней части пластины.

4. Анализ с помощью сине-светодиодного осветителя

  1. Пометьте линию растворителя карандашом. Высушите пластину в вытяжке в течение 10 мин при комнатной температуре.
  2. После высыхания сразу же замочите пластину в 10% растворителеH2SO4 , а затем высушите в вытяжке в течение 10 мин при комнатной температуре.
  3. Поместите пластину на нагревательную панель до появления коричневых пятен. Убедитесь, что пластина не перегревается, так как это может затруднить визуализацию ловастатина.
  4. Перенесите пластину на сине-светодиодный осветитель и отсканируйте с помощью совместимого бесплатного программного обеспечения (MiBio Fluo) (см. Таблицу материалов).

5. Оценка доходности по регрессионной модели

  1. Измерьте размеры полос с помощью программного обеспечения ImageJ (см. Таблицу материалов).
  2. Создание регрессионной модели с использованием программного обеспечения для анализа данных и построения графиков (см. Таблицу материалов) на основе нисходящих концентраций стандартов ловастатина, включая 1 мг/мл, 0,75 мг/мл, 0,5 мг/мл и 0,25 мг/мл.
  3. Примените регрессионную модель для оценки выхода образцов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании был представлен метод сине-светодиодного освещения для оценки выхода соединений, и этот метод был валидирован и сопоставлен с методами биоанализа и УФ-детектирования (таблица 1). Регрессионные модели были разработаны на основе размеров полос и концентрации эталонов для трех методов, соответственно, для прогнозирования выхода образцов. Во-первых, в результатах метода биоанализа R-квадрат между размерами зоны ингибирования и эталонами ловастатина составил 0,99, а выход образца составил ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящем исследовании описан новый подход, синий светодиодный осветитель, для количественной оценки соединений без использования дорогостоящего и специализированного оборудования, такого как метод ВЭЖХ, ВЭЖХ и ГК, и этот метод сравнивали с методами биоанализа и УФ-детектирования для оценки эффективности количественной оценки. В результате был сделан вывод о том, что метод сине-светодиодного освещения является относительно безопасным и эффективным протоколом, используемым для количественной оценки выхода целевых соедин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Министерством науки и технологий Тайваня (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Американский бактериологический AgarCondalab1802.00
Aspergillus terreus  ATCC 20542
Сине-светодиодный осветительMICROTEKBio-1000F
ЦентрифугаThermo Scientific HERAEUS Megafuge 8
Компактная УФ-лампаUVPUVGL-25
ЭтилацетатMACRONMA-H078-10
Фильтровальная бумага 125 ммADVANTEC60311102
ImageJNIHFreewarehttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Ловастатин стандартACROSA0404262
MiBio Флуо MICROTEKV1.04
n-HexaneC-ECHOHH3102-000000-72EC
OriginProOriginLab9.1https://www.originlab.com/origin
Картофельный отвар декстрозы HSTBIO MEDIA
Ротационный испарительEYELASB-1000
Серная кислотаFluka30743-2.5L-GL
TLC силикагель 60 F254MERCK1.05554.0001
Трифторуксусная кислотаAlfa Aesar10229873
Ультразвуковая вибрационная машинаDELTADC600
110533

Ссылки

  1. Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078(2014).
  2. Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
  3. Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
  4. Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography. Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).
  5. Duncan, J. D. Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC. Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).
  6. Sherma, J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).
  7. Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV. Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).
  8. Poole, C. F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).
  9. Rapid Johnson, M. E. simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner. Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).
  10. El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
  11. Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets. Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).
  12. Musharraf, S. G., Ul Arfeen,, Shoaib, Q., M, Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Оценка выхода соединений на пластине TLC с помощью метода сине-светодиодного освещения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.