Оценка выхода соединений на пластине TLC с помощью метода сине-светодиодного освещения

Тонкослойная хроматография (ТЛК) широко используется как качественная и количественная методика в области органической химии ^1,2,3. Основными преимуществами TLC являются то, что он обеспечивает быстрое обнаружение, гибкие требования к образцам и не требует специализированного оборудования⁴. На сегодняшний день, несмотря на то, что было установлено много передовых подходов, TLC по-прежнему является основным методом идентификации неизвестных образцов в смеси. Однако проблема этого подхода заключается в отсутствии безопасного и недорогого оборудования для количественной оценки выхода проб, особенно для развивающихся лабораторий с ограниченными бюджетами. Таким образом, настоящее исследование было направлено на разработку эффективного, безопасного и недорогого метода в сочетании с TLC для оценки выхода образцов.

В отличие от высокоэффективного TLC (HPTLC), высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и газовой хроматографии (GC) со строгими требованиями к образцам, трудоемкими и участием многоступенчатой для пробоподготовки ^1,5, TLC показал ряд преимуществ. Во-первых, для пробоподготовки ВЭЖХ и ГК не могут обнаружить сырой экстракт, поскольку сырой экстракт может заткнуть колонну ВЭЖХ и ГХ. Во-вторых, когда образцы не подходят для УФ-излучения (важно для анализа ВЭЖХ) или с низкой летучестью (важно для анализа ГК), К этим образцам может быть применен TLC, а использование реагента визуализации делает изолированные образцы видимыми на тонких слоях ^6,7,8. В-третьих, для обычных пользователей ВЭЖХ и ГК, как правило, требуют относительно длительного времени предварительной подготовки перед самостоятельной работой по сравнению с TLC. Кроме того, количественный анализ TLC, известный как высокопроизводительный TLC (HPTLC), может оцифровать информацию на пластине TLC с помощью высокочувствительного сканера. Однако стоимость системы ВЭЖХ относительно дорогая. Таким образом, разработка экономически эффективного и быстрого подхода к количественной оценке образцов на пластине TLC является важной темой.

Аналогичные методы были разработаны для количественной оценки урожайности TLC; Например, Джонсон⁹ сообщил о методе, который позволяет количественно оценить образцы на пластине TLC с помощью планшетного сканера, подключенного к компьютеру. В 2001 году El-Gindy et ^al.10 разработали TLC-денситометрический метод, который использовался для обнаружения соединения с оптической плотностью, и этот метод также был применен Elkady et ^al.11. В 2007 году Hess² представил метод цифрового усовершенствования TLC (DE-TLC), применяемый для обнаружения выхода соединения на пластине TLC с использованием цифровой камеры в сочетании с ультрафиолетовым светом. Гесс также сравнил разницу в стоимости между методом HPTLC и DE-TLC и пришел к выводу, что метод DE-TLC может использоваться в лабораториях средней школы и колледжа из-за его доступной стоимости². Тем не менее, стоимость TLC-денситометрического метода все еще была дорогой, и работа ультрафиолетового света требует адекватной предварительной подготовки на случай, если пользователи могут подвергнуться воздействию ультрафиолетового излучения. Поэтому, совместимый с TLC, желательно разработать эффективный, безопасный и недорогой метод количественной оценки выхода образца.

В настоящем исследовании описан протокол обнаружения образца на пластине TLC с использованием синего светодиодного осветителя и разработана регрессионная модель с высокой надежностью (высоким значением R-квадрата) для измерения размеров полос, а затем определения выхода соединения. Наконец, было установлено, что метод сине-светодиодного освещения является относительно безопасным (vs. Метод УФ-детектирования), дешевый (vs. GC, ВЭЖХ и ВЭЖХ) и эффективный (по сравнению с методом биоанализа) подход к количественной оценке урожайности.

Настоящий протокол описан на примере ловастатина. Ловастатин был извлечен из недельного Aspergillus terreus.

1. Экстракция соединений

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об извлечении соединений см. Рисунок 1.

1. Культура Aspergillus terreus на картофельный агар декстрозы (КПК, см. Таблицу материалов) в среде при 30 °C.
2. Высушите культуру при 40 °C в течение 24 ч. Переложите высушенную культуру в 50 мл пробирку с помощью стерилизованного пинцета и добавьте 15 мл этилацетата.
3. Смесь энергично встряхнуть вихрем в течение 1 мин и инкубировать в течение 1 ч при 40 °С с встряхиванием при 200 об/мин.
4. Обжайте смесь ультразвуком с помощью ультразвуковой ванны 40 кГц (см. Таблицу материалов) при 40 °C в течение 1 ч.
5. Центрифугируйте смесь при 5000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре и фильтруйте через фильтровальную бумагу 11 мкм.
6. Экстрагировать фильтрат равным объемом стерильной воды в сепараторную воронку.
7. После разделения фаз собирают органический слой, а затем испаряют во вращающемся испарителе (см. Таблицу материалов). Растворить остаток в 2 мл этилацетата.

2. Разделение сырого экстракта по адсорбционной колонне нормальной фазы (NP)

1. Упакуйте колонку силикагелем NP в качестве стационарной фазы и используйте n-гексан:этилацетат:трифторуксусную кислоту (H:E:T; 80:20:0.1, v/v/v) в качестве подвижной фазы.
2. Загрузите 2 мл экстракта (стадия 1) на колонну и добавьте растворитель подвижной фазы со скоростью потока 1 мл/мин для элюляции экстракта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока управлялась вручную с помощью запорного крана.
3. Проверьте сточные воды с помощью TLC, чтобы подтвердить наличие ловастатина, а затем испарите во вращающемся испарителе при 45 °C до тех пор, пока растворитель не будет удален. Этот шаг занимает примерно 20-25 минут.
4. Растворяют остаток в 1 мл этилацетата, а затем смешивают с равным объемом 1% трифторуксусной кислоты.
5. Центрифугируйте смесь при 5000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре и соберите органический слой в новую стеклянную трубку.

3. Подготовка и загрузка пластин тонкослойной хроматограммы (TLC)

1. Нанесите 5 мкл образцов и эталонов ловастатина (см. Таблицу материалов) на базовую линию пластины TLC с помощью капиллярной пипетки, оставив границу 1 см по бокам пластины TLC.
2. Высушите пластину TLC в вытяжном шкафу в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Аккуратно поместите пластину щипцами в насыщенную стеклянную камеру, содержащую растворитель подвижной фазы. Накройте камеру стеклянной крышкой и дайте пластине полностью развиться.
4. Снимите пластину из камеры, когда линия растворителя достигнет 1 см от верхней части пластины.

4. Анализ с помощью сине-светодиодного осветителя

1. Пометьте линию растворителя карандашом. Высушите пластину в вытяжке в течение 10 мин при комнатной температуре.
2. После высыхания сразу же замочите пластину в 10% растворителе_H2SO₄ , а затем высушите в вытяжке в течение 10 мин при комнатной температуре.
3. Поместите пластину на нагревательную панель до появления коричневых пятен. Убедитесь, что пластина не перегревается, так как это может затруднить визуализацию ловастатина.
4. Перенесите пластину на сине-светодиодный осветитель и отсканируйте с помощью совместимого бесплатного программного обеспечения (MiBio Fluo) (см. Таблицу материалов).

5. Оценка доходности по регрессионной модели

1. Измерьте размеры полос с помощью программного обеспечения ImageJ (см. Таблицу материалов).
2. Создание регрессионной модели с использованием программного обеспечения для анализа данных и построения графиков (см. Таблицу материалов) на основе нисходящих концентраций стандартов ловастатина, включая 1 мг/мл, 0,75 мг/мл, 0,5 мг/мл и 0,25 мг/мл.
3. Примените регрессионную модель для оценки выхода образцов.

В этом исследовании был представлен метод сине-светодиодного освещения для оценки выхода соединений, и этот метод был валидирован и сопоставлен с методами биоанализа и УФ-детектирования (таблица 1). Регрессионные модели были разработаны на основе размеров полос и концентрации эталонов для трех методов, соответственно, для прогнозирования выхода образцов. Во-первых, в результатах метода биоанализа R-квадрат между размерами зоны ингибирования и эталонами ловастатина составил 0,99, а выход образца составил 0,56 мг, предсказанный регрессионной моделью (рисунок 2). Во-вторых, в методе УФ-детектирования R-квадрат между стандартами ловастатина и размерностью полос на пластине TLC составлял 0,97, а выход образца, предсказанного регрессионной моделью, составлял 0,53 мг (рисунок 3). Примечательно, что края полосы были размытыми, и наблюдались относительно низкие полосы интенсивности сигнала (рисунок 3A). В-третьих, в методе сине-светодиодного освещения R-квадрат между стандартами ловастатина и размером полос на пластине TLC составлял 0,98, а выход образца составлял 0,54 мг, предсказанный регрессионной моделью (рисунок 4). Прогнозируемый выход с использованием синего светодиодного осветителя был ближе к методу биоанализа (установленному в качестве контрольного). Размер полосы был пропорционален количеству ловастатина, а прозрачные полосы были получены методом сине-светодиодной подсветки. Кроме того, рабочее время методов биоанализа, УФ-детектирования и синего светодиодного освещения составляло примерно 24 ч, 2 ч и 1 ч соответственно; (Примечание: рабочий час означает общее время, затраченное на экспертизу выхода ловастатина).

Рисунок 1: Рабочий поток протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Метод биоанализа. (А) Биоанализ ловастатина против Neurospora crassa (инкубируется в течение 24 ч при 30 °C). В конце испытания 90-миллиметровые агаровые пластины были сфотографированы при видимом свете. (B) Концентрации шести стандартов ловастатина составляли: No 1 (1 мг/мл), No 2 (0,75 мг/мл), No 3 (0,5 мг/мл) и No 4 (0,25 мг/мл). Образец No5 разбавляли до 0,25× (1:4). Образец No6 разбавляли до 0,5× (1:2). Размер зоны ингибирования (мм2) измеряли с помощью программного обеспечения для визуализации. С) была разработана регрессионная модель с использованием программного обеспечения для анализа данных и построения графиков на основе измерения зоны ингибирования стандартов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Пластина тонкослойной хроматограммы (TLC), подвергающаяся воздействию ультрафиолетового света. (A) Н-гексан:этилацетат (2:3 в/об) использовалась в качестве подвижной фазы в анализе TLC, а пластина TLC подвергалась воздействию ультрафиолетового света (365 нм) после замачивания в разработчике (10%H2SO4). (B) Концентрации шести стандартов ловастатина составляли: No 1 (1 мг/мл), No 2 (0,75 мг/мл), No 3 (0,5 мг/мл) и No 4 (0,25 мг/мл). Образец No5 разбавляли до 0,25× (1:4). Образец No6 разбавляли до 0,5× (1:2). Размер зоны ингибирования (мм2) измеряли с помощью программного обеспечения для визуализации. (C) Была разработана регрессионная модель с использованием программного обеспечения для анализа данных и построения графиков на основе размеров стандартных полос ловастатина на пластине TLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Пластина тонкослойной хроматограммы (TLC), отсканированная синим светодиодным осветителем. (A) Н-гексан:этилацетат (2:3 в/об) использовался в качестве подвижной фазы в анализе TLC, а пластина TLC сканировалась синим светодиодным осветителем. (B) Концентрации шести стандартов ловастатина составляли: No 1 (1 мг/мл), No 2 (0,75 мг/мл), No 3 (0,5 мг/мл) и No 4 (0,25 мг/мл). Образец No5 разбавляли до 0,25× (1:4). Образец No6 разбавляли до 0,5× (1:2). Размер зоны ингибирования (мм2) измеряли с помощью программного обеспечения для визуализации. (C) Была разработана регрессионная модель с использованием программного обеспечения для анализа данных и построения графиков на основе размеров стандартных полос ловастатина на пластине TLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Сравнение трех методов обнаружения, использованных в данном исследовании.

Таблица 2: Сравнение предыдущих методов и текущего исследования.

Дополнительный рисунок 1: Пластина тонкослойной хроматограммы (TLC) с ампициллином сканировалась методом сине-светодиодной подсветки. (A) Этилацетат:метанол (9:13 v/v) использовался в качестве подвижной фазы в анализе TLC, а пластина TLC сканировалась синим светодиодным осветителем. (B) Концентрация четырех эталонов ампициллина составляла: No 1 (100 мг/мл), No 2 (75 мг/мл), No 3 (50 мг/мл) и No 4 (25 мг/мл). Размер полос измерялся с помощью программного обеспечения для визуализации. С) Была разработана регрессионная модель с использованием программного обеспечения для анализа данных и построения графиков на основе размеров стандартных полос ампициллина на пластине TLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Пластина тонкослойной хроматограммы (TLC) с апрамицином, отсканированная методом сине-светодиодной подсветки. (A) Метанол:вода (6:5 v/v) использовался в качестве подвижной фазы в анализе TLC, а пластина TLC сканировалась синим светодиодным осветителем. (B) Концентрация четырех стандартов апрамицина составляла: No 1 (50 мг/мл), No 2 (40 мг/мл), No 3 (30 мг/мл) и No 4 (20 мг/мл). Размер полос измерялся с помощью программного обеспечения для визуализации. С) Была разработана регрессионная модель с использованием программного обеспечения для анализа данных и построения графиков на основе размеров стандартных полос апрамицина на пластине TLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.