Здесь мы описываем протокол для выделения достаточного количества единичных некардиомиоцитов с высокой жизнеспособностью из сердца мыши после инфаркта миокарда (ИМ). Это может быть использовано для последующего секвенирования отдельных клеток, анализа проточной цитометрии и первичной клеточной культуры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Получение некардиомиоцитарной клеточной суспензии для секвенирования одноклеточной РНК из сердца взрослой мыши после инфаркта миокарда
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Инфаркт миокарда (ИМ) является одним из наиболее распространенных сердечно-сосудистых заболеваний с ростом смертности во всем мире. Некардиомиоциты составляют более половины всей популяции сердечных клеток, и они способствуют адаптивной компенсации при повреждении миокарда, включая воспалительные реакции, восстановление тканей и образование рубцов. Для изучения микроокружения сердца после инфаркта миокарда широко используется секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) для идентификации различных типов сердечных клеток и межклеточных коммуникаций. Среди процедур подготовки образца scRNA-seq приготовление клеточной суспензии является одним из наиболее важных этапов, поскольку жизнеспособность клеток может повлиять на качество результатов scRNA-seq. Поэтому мы разработали экспериментальный протокол для получения суспензии некардиомиоцитарных клеток из сердец мышей после инфаркта миокарда с дополнительным акцентом на улучшение жизнеспособности клеток путем выбора мягких пищеварительных ферментов, контроля времени пищеварения и применения флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Наконец, мы выделили CD45+ клетки из суспензии некардиомиоцитарных клеток, полученной по этому протоколу, а затем провели секвенирование скРНК.
Введение
Инфаркт миокарда (ИМ) является одним из наиболее распространенных сердечно-сосудистых заболеваний, и смертность от него растет во всеммире1. Инфаркт миокарда вызван недостаточным кровоснабжением окружающего миокарда, что может быть результатом закупорки коронарной артерии, возникающей при разрыве атеросклеротической бляшки. Хотя чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ) снизило показатели смертности пациентов с острым инфарктом миокарда, высокая распространенность сердечной недостаточности после инфаркта миокарда остается проблемой2. Ключевой патофизиологией, лежащей в основе сердечной недостаточности после инфаркта миокарда, является компенсаторная реакция организма на сердечные повреждения, которая включает замену мертвой сердечной мышцы несократительными фиброзными рубцами. Эти адаптивные реакции в значительной степени зависят от местного воспаления, опосредованного взаимодействиями между несколькими типами клеток и клетками сердечной ткани, и это воспаление в настоящее время рассматривается как потенциальная терапевтическая мишень для уменьшения образования фиброзных рубцов и, таким образом, защиты от сердечной недостаточности после инфарктамиокарда 3,4. Интересно, что микроокружение в месте инфаркта испытывает зависящий от времени переход в инфильтрационных типах клеток и функционирует на разных стадиях ИМ 1,5. Многие исследования показали, что некардиомиоциты (например, иммунные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки) играют центральную роль в воспалении после инфаркта миокарда и восстановлении тканей 5,6. В последние годы секвенирование отдельных клеток широко используется в качестве мощного инструмента для выяснения вовлеченности и функций некардиомиоцитов в микросреде после инфарктамиокарда 7,8. Это дает представление о патофизиологии травмы и восстановления после инфаркта миокарда, а также о разработке потенциальных методов лечения сердечной недостаточности после инфаркта миокарда.
Высокопроизводительное секвенирование РНК (RNA-Seq) — это метод, используемый для подробного изучения целых транскриптомов с использованием секвенирования следующего поколения (NGS)7,8,9. В последнее время разработка scRNA-Seq произвела революцию в области биомедицинских исследований. По сравнению с обычным массовым секвенированием, scRNA-Seq анализирует профили экспрессии генов и гетерогенность транскрипции на уровне отдельных клеток 7,8. Этот метод значительно способствует исследованию клеточной патофизиологии ИМ 9,10 путем идентификации различных типов циркулирующих клеток в микроокружении после ИМ и выявления взаимодействия между кардиомиоцитами и некардиомиоцитами. Эти результаты также способствуют выявлению новых терапевтических целей для сердечной недостаточности после инфаркта миокарда. В целом, эксперимент после инфаркта миокарда на основе scRNA-seq включает три основных раздела: (1) создание модели животных после инфаркта миокарда; (2) приготовление клеточной суспензии; и (3) секвенирование образцов и анализ данных. Примечательно, что приготовление клеточной суспензии является наиболее важным этапом подготовки эксперимента scRNA-Seq, поскольку качество клеточной суспензии определяет точность результатов.
Этот протокол предназначен для извлечения суспензии некардиомиоцитарных клеток из сердечной ткани после инфаркта миокарда; Важно отметить, что включены конкретные детали для поддержания жизнеспособности и разрешения клеток. Между тем, оборудование, используемое в этом протоколе, такое как хирургические наборы для мышей, аппараты искусственной вентиляции легких грызунов и центрифуги, можно найти в большинстве экспериментальных центров на животных и биомедицинских лабораторий, и, таким образом, стоимость эксперимента по этому протоколу относительно низкая. Кроме того, если рассматривать временные моменты и места инфаркта в качестве переменных, этот протокол может быть применен для моделирования широкого спектра клинических сценариев, особенно для осложнений после ИМ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных в Чжэцзянском университете и были одобрены Консультативным комитетом по животным Чжэцзянского университета.
1. Операция по перевязке левой передней нисходящей коронарной артерии (перевязка LAD)
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве моделей использовались восьминедельные самцы мышей C57BL/6J. Сердца были собраны через 2 недели после инфаркта миокарда. Операция по перевязке левой передней нисходящей коронарной артерии была выполнена, как описано ранее и продемонстрировано11.
- Перед операцией продезинфицируйте хирургические инструменты 70% этанолом.
- Взвесьте мышь, а затем обезболите мышь внутрибрюшинными инъекциями 1% пентобарбитала натрия (50 мг / кг). Наблюдайте за рефлексом защемления пальцев ног и измеряйте частоту дыхания, чтобы оценить глубину анестезии во время процедуры.
- Поместите мышь на операционный стол с грелкой 37 °C. Используйте офтальмологическую мазь для предотвращения обезвоживания глаз.
- Проведите депиляцию левой прекардиальной груди и шеи кремом для депиляции и используйте ватные палочки для удаления волосков. Продезинфицируйте кожу йодофором, а затем 70% спиртом очистите область три раза.
- Выполните срединный разрез шейки матки (0,8-1,0 см) под микроскопом. Отделите кожу, мышцы и ткани, окружающие трахею, а затем вставьте канюлю 20G в трахею.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте при введении канюли в трахею под микроскопическим видом, чтобы убедиться, что трубка не вставлена в пищевод. - Подключите мышь к аппарату искусственной вентиляции легких грызунов, установленному на дыхательный объем 0,2 мл со скоростью 150 ударов в минуту.
- Надрежьте грудную клетку мыши наискось по среднеключичной линии стерильными ножницами. Рассеките подкожную клетчатку, чтобы обнажить ребра.
- Стерильными ножницами разрежьте кожу наискось вдоль левой среднеключичной линии (0,8-1,0 см). Выполните левую торакотомию, чтобы разделить третье и четвертое ребра, чтобы обнажить сердце. Используйте реберное втягивающее устройство для четкого обзора.
- Вскрывают перикард изогнутыми щипцами, а затем перевязывают левую переднюю нисходящую артерию (ниже придатка левого предсердия) с помощью шелкового шва 7-0. Бледная передняя стенка левого желудочка свидетельствует о том, что перфузия миокарда успешно прервана.
- Отпустите ретрактор ребра и сшивайте грудной разрез слоями шелковым швом 5-0, выталкивая воздух из грудной клетки. Зашить разрез шеи шовным шелковым швом 5-0.
- Удалите трахеальную трубку из мыши, как только ее спонтанное дыхание восстановится. Внутрибрюшинно вводят 0,5 мл предварительно подогретого стерильного физиологического раствора. Вводите бупренорфин (0,1 мг/кг) каждые 12 ч подкожно, чтобы свести к минимуму боль.
- Наконец, поместите мышь на грелку, чтобы дождаться реанимации. Следите за мышью, чтобы убедиться, что она не страдает от чрезмерной одышки или кровотечения с помощью визуального наблюдения.
- Верните мышь в клетку после того, как она проснется. В течение первой недели ежедневно наблюдайте за мышью, чтобы убедиться, что ее подвижность, уход и пищевые привычки адекватны. В соответствии с потребностями эксперимента, собирайте сердце в разные моменты времени после инфаркта миокарда.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе одноклеточная суспензия была приготовлена с сердцем через 2 недели после ИМ.
2. Приготовление сердечной одноклеточной суспензии
- Приготовление растворов и сред
- Буфер диссоциации сердечной ткани: смешайте 10 мг коллагеназы IV (600 ЕД / мл), 5 мг диспазы II (0,5 ЕД / мл) и 50 мкл ДНКазы I (100 мкг / мл) в 5 мл RPMI 1640. Перед употреблением предварительно подогрейте это средство до 37 °C на водяной бане.
- Буфер для промывки клеток: приготовьте 1% BSA или 10% FBS в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS, PH 7,4) и храните при температуре 4 ° C или на льду.
- Перфузионный раствор: предварительно охладить PBS (рН 7,4) в качестве перфузионного раствора.
- Буфер лизиса эритроцитов (эритроцитов): Используйте буфер лизиса эритроцитов, как указано производителем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Список реагентов и оборудования, использованных в этом исследовании, см. в Таблице материалов .
- Усыпьте мышь внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (150 мг / кг).
- Рассечение сердца
- Поместите мышь в положение лежа на спине, зафиксировав ее задние конечности на месте с помощью клейкой ленты.
- Сбрызните тело 70% этанолом, а затем разрежьте вертикально через кожу живота и мышцы, избегая прокалывания печени. Осторожно откройте грудную клетку, избегая прокола сердца.
- Используйте предварительно охлажденный PBS (рН 7,4) для перфузии левого желудочка до тех пор, пока не будет обнаружена бесцветная перфузионная жидкость (требуется примерно 15 мл PBS [pH 7,4]).
- Аккуратно поднимите сердце из грудной клетки щипцами и отрежьте лишнюю ткань, прикрепленную к внешней стороне сердца, с помощью офтальмологических ножниц. Поместите сердце в 1 мл предварительно охлажденного PBS (рН 7,4) в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Ферментативная диссоциация сердечной ткани
- Перенесите сердце мыши в одну лунку 24-луночной пластины со 150 мкл буфера диссоциации сердечной ткани, помещенного на лед, и разрежьте его на мелкие кусочки (~1 мм) ножницами.
- Переведите измельченную сердечную ткань в центрифужную пробирку объемом 15 мл с 5 мл буфера диссоциации тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый объем буфера диссоциации сердечной ткани составляет 5 мл / сердце. - Поместите центрифужную пробирку в электрически термостатический возвратно-поступательный шейкер при 125 об/мин на 1 ч при 37 °C. Пипетка тканевой суспензии вверх и вниз 10 раз каждые 20 мин.
- Отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр размером 70 мкм, чтобы удалить непереваренную ткань и комки. Добавьте 25 мл буфера для промывки клеток, чтобы промыть исходную пробирку, а затем перенесите ее для промывки клеточного фильтра. Затем отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр размером 40 мкм для дальнейшего удаления клеточных комков.
- Центрифугу суспензию отфильтрованных клеток при 300 х г в течение 5 мин при 4 °С. Выбросьте надосадочную жидкость, а затем ресуспендируйте образец клетки в буфере лизиса 1x эритроцитов в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
- Добавьте в четыре раза больший объем буфера для промывки клеток и центрифугу при 300 x g в течение 5 мин при 4 ° C.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 10 мл буфера для промывки клеток. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл буфера для промывки клеток.
- Смешайте 18 мкл клеточной суспензии с 2 мкл раствора для окрашивания акридина оранжевого (AO)/йодида пропидия (PI) (9:1) и добавьте 10 мкл смеси в предметное стекло счетной камеры. Оцените количество клеток и жизнеспособность с помощью автоматического счетчика ячеек.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Одноклеточная суспензия с высокой жизнеспособностью была получена путем реализации раздела 2 этого протокола. Тем не менее, фрагменты клеток все еще можно наблюдать (рис. 1А); следовательно, для дальнейшего улучшения качества была выполнена сортировка клеток, активированная флуоресценцией (FACS)16. После FACS средний размер клетки уменьшается с 9,6 мкм до 9,1 мкм ( таблица 1), что позволяет предположить, что доля фрагментов клеток может быть эффективн...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эта статья была направлена на описание протокола выделения единичных некардиомиоцитов из сердца мыши после ИМ. Протокол может быть применен для выделения различных типов клеток в микроокружении после инфаркта миокарда с высоким качеством, включая иммунные клетки, эндотелиальные клетки и фибробласты. Три основных фактора имеют решающее значение для получения высококачественной клеточной суспензии для секвенирования отдельных клеток. Во-первых, это настройка ферментативного пищеварения. Важно контролировать время пищеварен...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Фондами естественных наук провинции Чжэцзян (LQ22H020010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Акридин оранжевый / Йодид пропидиума Морилка | Логотипы биосистемы | F23001 | |
| Автоматизированные Cell Счетчик | Logos biosystems | L20001 | |
| Сыворотка крупного рогатого скота Альбумин | Servicebio | G5001 | Цитопротекторный эффект |
| Слайды для подсчета клеток | Logos biosystems | L12001 | |
| Коллагеназа типа IV | Gibco | 17104019 | Пищеварительные ферменты |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Пищеварительные ферменты |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Предотвратить комкование клеток |
| Falcon 40μ m Сетчатый фильтр | Falcon | 352340 | Удалить клеточные комки |
| Falcon 70μ m Клеточный фильтр | Falcon | 352350 | Удалить непереваренные ткани и комки |
| Проточный сортировщик клеток | Beckman Coulter | B25982 | |
| Иодофор | OU QING SI | ||
| Иглодержатель | FST | 12061-01 | |
| Офтальмологический щипцы | RWD | F14012-10 | |
| Офтальмологические ножницы | RWD | S11036-08 | |
| Фосфатно-солевой буфер | Servicebio | G4202-500ML | |
| Буфер для лизиса эритроцитов | Beyotime | C3702-120мл | Удаление эритроцитов |
| Реберный ретрактор | FST | 17005-04 | |
| Вентилятор для грызунов | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | растворитель раствор фермента |
| Стерильные ножницы | RWD | S14014-10 |
Ссылки
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).
- Gu, J., et al. Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727(2021).
- Frangogiannis, N. G. The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling. Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).
- Tzahor, E., Dimmeler, S. A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment. Science. 377 (6610), 4443(2022).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Massaia, A., et al. Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167(2018).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
- Jin, K., et al. Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction. Small Methods. 6 (3), 2100752(2022).
- Tombor, L. S., et al. Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction. Nature Communications. 12 (1), 681(2021).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581(2011).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).
- Gladka, M. M., et al. Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Garcia-Flores, V., et al. Preparation of single-cell suspensions from the human placenta. Nature Protocols. , (2022).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
- Hua, X., et al. Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis. Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14, 935-936 (2017).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
