Методическая статья

Человеческие микроглиоподобные клетки: дифференциация из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и анализ фагоцитоза живых клеток in vitro с использованием синаптосом человека

4.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64323

⸱

18 августа 2022 г.

 , 
1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Translation Science Program, Morningside Graduate School of Biomedical Sciences, University of Massachusetts Chan Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает процесс дифференцировки индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) в микроглиоподобные клетки для экспериментов in vitro . Мы также включили подробную процедуру генерации синаптосом человека из нижних двигательных нейронов, полученных из iPSC, которые могут быть использованы в качестве субстрата для анализов фагоцитоза in vitro с использованием систем визуализации живых клеток.

Аннотация

Микроглии являются резидентными иммунными клетками миелоидного происхождения, которые поддерживают гомеостаз в микроокружении мозга и стали ключевым игроком в многочисленных неврологических заболеваниях. Изучение микроглии человека в здоровье и болезнях представляет собой проблему из-за крайне ограниченного запаса человеческих клеток. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPSCs), полученные от людей, могут быть использованы для обхода этого барьера. Здесь показано, как дифференцировать человеческие ИПСК в микроглиоподобные клетки (iMG) для экспериментов in vitro . Эти iMG демонстрируют ожидаемые и физиологические свойства микроглии, включая микроглиоподобную морфологию, экспрессию надлежащих маркеров и активный фагоцитоз. Кроме того, предоставляется документация по выделению и маркировке субстратов синаптосом, полученных из нижних двигательных нейронов человека, полученных из iPSC (i3LMN). Продольный анализ визуализации живых клеток используется для мониторинга поглощения синаптосом человека, помеченных pH-чувствительным красителем, что позволяет исследовать фагоцитарную способность iMG. Протоколы, описанные в настоящем документе, широко применимы к различным областям, которые исследуют биологию микроглии человека и вклад микроглии в заболевание.

Введение

Микроглии являются резидентными иммунными клетками в центральной нервной системе (ЦНС) и играют решающую роль в развитии ЦНС. Микроглия также важна в мозге взрослого человека для поддержания гомеостаза и активного реагирования на травмы и болезненные процессы. Кумулятивные данные показывают, что микроглия является ключевым фактором патогенеза множественных заболеваний нервного развития и нейродегенеративных заболеваний 1,2. Хотя современные знания о биологии микроглии были в основном получены из мышиных моделей, недавние исследования выявили важные различия между мышиной и человеческой микроглией, подчеркнув необходимость разработки технологий для изучения генетики и биологических функций микроглии человека 3,4. Выделение микроглии из рассеченной первичной ткани может сильно модифицировать свойства микроглии5, потенциально смешивая результаты, полученные с такими клетками. Общей целью этого метода является дифференциация человеческих ИПСК в иМГ, тем самым обеспечивая систему клеточных культур для изучения микроглии человека в базальных условиях. Кроме того, анализ фагоцитоза с использованием полностью человеческой модельной системы включен в настоящий документ в качестве средства для изучения функциональности iMG, как в качестве меры контроля качества, так и для оценки дисфункции iMG в контексте заболевания.

Множественные протоколы дифференциации микроглии от ИПСК недавно появились в литературе 6,7,8,9,10. Потенциальные недостатки некоторых протоколов включают длительные или длительные периоды дифференциации, добавление нескольких факторов роста и/или сложные экспериментальные процедуры 6,9,10. Здесь продемонстрирован «удобный для пользователя» метод дифференцировки, который повторяет аспекты онтогенеза микроглии путем дифференцировки иПСК в клетки-предшественники, называемые примитивными предшественниками макрофагов (PMP)7,11. PMP генерируются, как описано ранее, с некоторыми оптимизациями, представленными здесь12. PMP имитируют MYB-независимые макрофаги, полученные из желточного мешка, которые порождают микроглию во время эмбрионального развития, вторгаясь в мозг до закрытия гематоэнцефалического барьера13. Чтобы окончательно дифференцировать PMP в iMG, мы использовали быстрый и упрощенный метод монокультуры, основанный на протоколах Haenseler et al. и Brownjohn et al., с некоторыми модификациями для создания эффективного метода дифференциации микроглии, в котором iMG надежно экспрессируют маркеры, обогащенные микроглией 7,8. Этот метод дифференциации может быть воспроизведен в лабораториях, обладающих опытом в культуре иПСК и с исследовательскими целями, направленными на изучение биологии микроглии с использованием системы моделей человека.

Микроглии, полученные из iPSC, представляют собой биологически значимый источник микроглии человека для экспериментов in vitro и являются важным инструментом для исследования канонических функций микроглии, включая фагоцитоз. Микроглии являются профессиональными фагоцитами мозга и ЦНС, где они очищают клеточный мусор, агрегированные белки и деградированный миелин14. Микроглия также функционирует в синаптическом ремоделировании путем поглощения синапсов и в защите от внешних инфекций через фагоцитоз патогенов15,16. В этом протоколе фагоцитоз iMGs оценивается с использованием синаптосом человека в качестве материала для поглощения iMG. С этой целью описано выделение синаптосом, полученных из человеческих i3ЛМН. Синаптосомы человека, полученные из i3LMN, помечены pH-чувствительным красителем, который позволяет количественно определять синаптосомы, локализованные в кислых компартментах во время обработки и деградации фагосом in vitro. Показан анализ фагоцитоза с использованием живоклеточной микроскопии для мониторинга динамического процесса поглощения микроглии в режиме реального времени. Этот функциональный анализ устанавливает основу для исследования возможных дефектов фагоцитоза микроглии в здоровье и болезни с использованием полной системы человека.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты, используемые в этом протоколе, должны быть стерильными, и все этапы должны выполняться в шкафу биобезопасности в стерильных условиях. Все линии iPSC, а также носители обслуживания и дифференциации описаны в Таблице материалов. Способ дифференцировки микроглии, проиллюстрированный ниже, основан на ранее опубликованных протоколах 7,8,12 с новыми модификациями, описанными в настоящем описании.

1. Дифференциация микроглии

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор протокола кратко изложен на рисунке 1.

  1. Индуцированная культура плюрипотентных стволовых клеток (iPSC)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию, описывающую методы культивирования iPSC, можно найти в другом месте17.
    1. Оттаивание и техническое обслуживание
      1. Подготовьте iPSC medium, аликвотируйте среду и храните при -20 °C до 6 месяцев. Разморозьте аликвоты на ночь при 4 °C и используйте их до 1 недели. Оставьте среду при температуре окружающей среды не менее чем на 1 ч перед использованием.
      2. Покрыть колодцы 6-луночной пластины путем добавления 1 мл 10 мкг/мл ламинина 521, разбавленного в DPBS, содержащих кальций и магний18. Храните пластины в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение не менее 2 ч или предпочтительно в течение ночи. После разбавления храните ламинин при 4 °C в течение 3 месяцев.
      3. Готовят 10 мМ ингибитора роназы Y27632 (ингибитор ROCK) стоковым раствором путем разведения в стерильной воде. Делают одноразовые аликвоты раствора ингибитора ROCK и хранят их при -20 °C до 1 года.
      4. Готовят 0,5 мМ ЭДТА путем разбавления исходного раствора 0,5 М ЭДТА в ДПБС.
      5. Чтобы разморозить флакон замороженных ИПСК, поместите флакон на водяную баню при 37 °C, пока он не будет в основном разморожен. Немедленно перенесите содержимое флакона в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл iPSC-среды. Центрифуга при 500 × г в течение 1 мин.
      6. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки, добавляя 1 мл среды iPSC , содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ, медленно к стенке трубки, чтобы избежать нарушения колоний.
      7. Добавьте 1,5 мл среды iPSC , содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ, в каждую из покрытых скважин и перенесите по каплям восстановленные колонии в скважины, содержащие среду.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 5-7 капель из шага 1.1.1.6 для поддержания культуры, но отрегулируйте оптимальную плотность посева для каждой линии iPSC.
      8. Равномерно распределите ячейки в колодцах, вручную перетасовывая пластину из стороны в сторону и назад спереди. Поместите клетки в инкубатор при 37 °C и 5% CO2. На следующий день полностью замените среду, добавив свежую среду iPSC без ингибитора ROCK.
      9. Для поддержания меняйте среду каждый день, пока клетки не достигнут 80% слияния.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут поддерживаться без изменения среды в течение 2 дней, если используемая среда iPSC позволяет гибкий график кормления. Рекомендуется ограничить это до одного раза за проход и только в том случае, если клетки менее 50% сливаются.
    2. Расщепление
      1. Аспирировать среду и промыть клетки 1 мл DPBS (без кальция и магния).
      2. Чтобы выбить клетки, добавляют 1 мл 0,5 мМ ЭДТА и инкубируют в течение 2-3 мин при комнатной температуре до тех пор, пока края клеточных колоний не поднимутся с поверхности лунки. Снова промыть клетки DPBS и добавить 1 мл iPSC среды.
      3. Диссоциируйте клеточные колонии, осторожно соскребая их с помощью клеточного лифтера. Соскребайте каждый участок колодца только один раз, чтобы не беспокоить колонии.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные методы вытеснения колоний из колодца можно найти в другом месте17.
      4. Используя наконечник пипетки объемом 1 мл, соберите ячейки и перенесите их капля за каплей в соотношении 1:6 (ячейки к среде) в предварительно покрытые лунки (как упоминалось на этапе 1.1.1.2), содержащие 1,5 мл среды iPSC.
  2. Дифференцировка iPSC в микроглиоподобные клетки (iMG)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Малые молекулы и факторы роста растворяются в стерильно-фильтрованном 0,1% бычьем сывороточном альбумине в DPBS до концентрации запаса в 1000 раз выше конечной концентрации. Рекомендуется дифференцировать ИПСК в иМГ во время ранних проходов. Рекомендуется регулярное кариотипирование линий iPSC.
    1. Приготовьте стандартный раствор для покрытия
      1. Разморозьте исходный раствор реагента для покрытия внеклеточного матрикса на льду при 4 °C в течение ночи.
      2. Трубки для микроцентрифуг Prechill и наконечники фильтрующих пипеток при 4 °C.
      3. Aliquot 250 мкл концентрированного экстраклеточного реагента покрытия внеклеточного матрикса вводят в каждую трубку и сразу же помещают на лед. Храните аликвоты при -20 °C.
      4. Для приготовления раствора покрытия разморозьте один из экстраклеточных матриксов покрытия реагентом аликот на льду при 4 °C в течение ночи.
      5. Добавьте 50 мл ледяной среды DMEM-F12, оптимизированной для роста эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (называемых DMEM-F12), в предварительно охлажденную коническую трубку и удерживайте ее на льду.
      6. Охладите наконечник пипетки объемом 1 мл, несколько раз пипетируя холодный DMEM-F12 вверх и вниз, а затем немедленно используйте наконечник пипетки для переноса 250 мкл реагента внеклеточного матричного покрытия в коническую трубку, содержащую среду DMEM-F12.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный раствор для покрытия можно хранить в течение 2 недель при температуре 4 °C.
    2. Формирование эмбриоидного тела (EB)
      1. Приготовьте EB среду , которую можно поддерживать при 4 °C в течение 4 дней.
      2. Как только ИПСК достигнут 80% конфюентности, диссоциируют колонии путем промывки 1 мл DPBS и добавления 1 мл диссоциационного реагента в течение 2 мин при 37 °C. Вытесняйте колонии с помощью клеточного лифтера, соскребая несколько раз, чтобы создать одноклеточную суспензию. Соберите клетки и переложите все в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 9 мл DPBS.
      3. Центрифугируют клетки при 500 × г в течение 1 мин, удаляют супернатант и повторно суспендируют клетки в 1 мл среды EB. Взять 10 мкл клеток и разбавить 1:1 трипаном синего. Подсчитайте клетки с помощью гемацитометра и, основываясь на количестве клеток, разбавьте клеточный запас до окончательного разбавления 10 000 клеток на 100 мкл. Для гальванических ячеек добавьте 100 мкл разбавленных ячеек на скважину в пластину с низким адгезией с круглым дном, 96 лунками.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 48 скважин из 96-луночной плиты могут быть получены из каждой 80% сливающейся скважины иПСК.
      4. Центрифугируют пластину при 125 × г в течение 3 мин и инкубируют при 37 °C и 5% CO2 в течение 4 дней. Выполните половинную смену среды на 2-й день, используя многоканальную пипетку и осторожно собрав 50 мкл старой среды, а затем добавив обратно 50 мкл свежей среды EB.
        ПРИМЕЧАНИЕ: На 4-й день иПСК образуют сферические клеточные структуры, называемые ЭБ, как описано в разделе результатов. Процесс дифференцировки EB при необходимости может быть продлен до 7 дней.
    3. Генерация примитивных предшественников макрофагов (PMP)
      1. Подготовьте базовую среду PMP, стерильно-фильтрующую, и храните ее при температуре 4 °C до 1 месяца.
      2. Покрывают колодцы 6-луночной пластиной, добавляя 1 мл ледяного раствора матригеля и инкубируют при 37 °C и 5% CO2 в течение по меньшей мере 2 ч или предпочтительно в течение ночи.
      3. На 4-й день дифференциации EB перенесите ЭБ в скважины, покрытые матригелем, собрав ЭБ с помощью наконечников пипетки объемом 1 мл (с использованием пипетки). Пипетка вверх и вниз один или два раза, чтобы выбить ЭБ из колодца. Держите плиту с 6 скважинами под наклонным углом, чтобы ЭБ располагались на краю скважины.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Девять или десять ЭБ могут быть покрыты на одно хорошо покрытое покрытие.
      4. После того, как все ЭБ успокоятся, аккуратно пипетку и удалите старую среду, используя наконечник пипетки 1 мл, сохраняя ЭБ на краю колодца. Добавьте в каждую лунку 3 мл свежеприготовленной полноценной среды ПМП . Равномерно распределите ячейки в колодцах, вручную перетасовывая пластину из стороны в сторону и назад спереди. Поместите пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
      5. Не беспокоить пластину в течение 7 дней, чтобы позволить ЭБ прикрепиться к дну колодца. По истечении этого времени выполните половинное изменение среды, используя полную среду PMP.
        ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе большинство ЭБ должны быть прикреплены к пластине. Любые плавающие ЭБ могут быть удалены.
      6. Через 5-7 дней осмотрите ЭБ под световым полевым микроскопом с 4-кратным увеличением, чтобы убедиться, что они прикреплены к дну скважин. Изменить среду, как описано в пункте 1.2.3.5. На 21-й день выполните полную смену среды с 3 мл полной среды PMP.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Миелоидные предшественники, плавающие в среде, могут быть очевидны в этот момент. Эти клетки должны быть выброшены во время изменения среды.
      7. На 28-й день найдите в супернатанте круглые ячейки, называемые PMP, и соберите среду, содержащую PMP, используя пипетку объемом 10 мл и автоматический пипеттор. Позаботьтесь о том, чтобы не беспокоить ЭБ. Перенесите PMP и среду в коническую трубку объемом 15 мл и действуйте в соответствии с описанием, описанным на этапе 1.2.4.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно PMP из одной и той же линии iPSC могут быть собраны из пяти скважин 6-луночной плиты и объединены вместе в одну коническую трубу объемом 15 мл.
      8. Добавьте 3 мл свежей полноценной среды PMP для дальнейшего поддержания ЭБ. Поскольку PMP непрерывно появляются из ЭБ в течение более 3 месяцев, собирайте их каждые 4-7 дней (не позволяйте среде изменять цвет на желтый тон), как описано в шагах 1.2.3.7 и 1.2.3.8.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя PMP могут собираться в течение нескольких месяцев, они могут со временем менять свой фенотип.
    4. Дифференциация по iMG
      1. Подготовьте базовый носитель iMG (Таблица материалов), стерильный фильтр и храните при 4 °C до 3 недель.
      2. После того, как PMP были собраны в коническую трубку объемом 15 мл, центрифугируйте их при 200 × г в течение 4 мин. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать PMP, используя 1-2 мл базальной среды iMG. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, взяв небольшую аликвоту и разбавляя 1:1 трипановым синим.
        ПРИМЕЧАНИЕ: 0,5-1,5 × 106 PMP обычно получают каждую неделю в зависимости от линии iPSC и возраста культуры EB.
      3. Центрифугируют остальные клетки снова при 200 × г в течение 4 мин. Разбавьте PMP до желаемой концентрации таким образом, чтобы клетки покрывались плотностью ~105/см2 на обработанных клеточными культурами пластинах с использованием свежеприготовленной полной среды iMG. Выполняйте половинную смену среды, используя свежеприготовленную полную среду iMG каждые 3-4 дня в течение 10-12 дней, чтобы обеспечить терминальную дифференциацию.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент клетки должны приобрести микроглиоподобную морфологию. Чтобы подтвердить приверженность PMP судьбе микроглии, проводится иммунофлуоресцентный анализ для подтверждения экспрессии обогащенных микроглией маркеров, таких как пуринергический рецептор P2RY12 и трансмембранный белок 119 (TMEM119)9.
      4. Чтобы сохранить здоровье и жизнеспособность клеток, выполните все эксперименты между 10 и 12 днями дифференцировки iMG.

2. Анализ фагоцитоза с использованием синаптосом человека, полученных из моторных нейронов

  1. Транскрипционный фактор-опосредованная дифференцировка нижних двигательных нейронов, полученных из iPSC (i3ЛМН)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для процесса дифференцировки использовалась линия WTC11 со стабильной вставкой индуцируемого hNIL-фактора транскрипционного фактора, содержащего нейрогенин-2 (NGN2), островок-1 (ISL1) и факторы транскрипции LIM homeobox 3 (LHX3), в локус безопасной гавани CLYBL, как описано ранее.17. Линия iPSC поддерживалась, как описано на этапе 1.1.1, но с условиями покрытия, описанными на этапе 1.2.1. Любой реагент покрытия внеклеточного матрикса может быть использован для культивирования иПСК, которые будут использоваться для дифференцировки нейронов, поскольку ламинин 521 не требуется. Все среды уравновешиваются до температуры окружающей среды в течение не менее 1 ч перед использованием.
    1. Покрыть 10 см посуду 5 мл стандартного раствора покрытия, как описано на этапе 1.2.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались 3-4 блюда по 10 см за дифференциацию.
    2. Подготовьте среду Induction Base, стерильный фильтр, и храните при 4 °C до 3 недель.
    3. Приготовьте среду Neuron, стерильно-фильтруйте, и храните ее при 4 °C до 2 недель.
    4. Приготовьте боратный буфер, смешав 100 мМ борной кислоты, 25 мМ тетрабората натрия и 75 мМ хлорида натрия в стерильной воде. Отрегулируйте рН до 8,5 и стерильно отфильтруйте его.
    5. Как только иПСК достигнут 80% слияния, промывайте клетки с DPBS и вытесняйте колонии, добавляя 0,5 мМ ЭДТА.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого 10-сантиметрового блюда обычно достаточно двух лунок.
    6. Инкубировать клетки в течение 4-5 мин при температуре окружающей среды. Удалите ЭДТА и добавьте 3 мл DMEM/F12 с HEPES в каждую лунку.
    7. Соскоблите ячейки с помощью подъемника и используйте пипетку 10 мл, чтобы удалить ячейки со дна колодца, осторожно пипетируя вверх и вниз 2-3x.
    8. Соберите клетки в коническую трубку объемом 15 мл и центрифугу по 300 × г в течение 3 мин.
    9. Повторно суспендируют клетки в 3 мл среды iPSC , содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ, и подсчитывают их с помощью гемацитометра.
    10. Пластина 1,5 × 106 iPSCs в предварительно покрытой 10 см посуде с 12 мл среды iPSC , содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ.
    11. На следующий день удалите среду и промыть клетки DPBS. Добавьте 12 мл свежеприготовленной среды Complete Induction , чтобы индуцировать экспрессию факторов транскрипции.
    12. На 2-й день обмазать 10 см посуду 5 мл раствора для покрытия нейронов, приготовленного с равными объемами 0,1 мг/мл поли-D-лизина и 1 мг/мл поли-L-орнитина, разведенного в боратном буфере. Инкубировать в течение ночи при 37 °C и 5% CO2.
    13. На 3-й день вымойте покрытую оболочкой посуду стерильной водой 3x, полностью аспирируйте воду и дайте посуде высохнуть, наклонив тарелки и оставив их частично непокрытыми внутри шкафа биобезопасности в течение не менее 1 ч при температуре окружающей среды.
    14. После того, как блюда полностью высохнут, покройте их 6 мл полной индукционной среды , дополненной 15 мкг/мл ламинина и 40 мкМ BrdU в течение не менее 1 ч при 37 °C и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение BrdU рекомендуется для устранения митотически активных клеток и, таким образом, для повышения чистоты нейронных культур. Влияние BrdU на здоровье нейронов минимально.
    15. Обработать дифференцирующие клетки 3 мл диссоциационного реагента на чашку 10 см и инкубировать в течение 3-4 мин при температуре окружающей среды.
    16. Добавьте 6 мл DPBS в пластину, не удаляя диссоциационный реагент, и пипетку клеток в растворе вверх и вниз 4-5x с пипеткой 10 мл для диссоциации клеток.
    17. Соберите клеточную суспензию и пропустите ее через клеточный ситечко 40 мкм в коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте 1 мл индукционной базовой среды для промывки ситечка.
    18. Центрифугируют клетки при 300 × г в течение 5 мин. Аспирировать среду и повторно суспендировать клетки в 3 мл полной индукционной среды , содержащей 40 мкМ BrdU.
    19. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Пластину приблизительно 2,5 × 106 ячеек на чашку размером 10 см в предварительно покрытую посуду путем разбавления клеток в 6 мл полной индукционной среды , содержащей 40 мкМ BrdU, без удаления раствора покрытия, добавленного на стадии 2.1.14.
    20. На 4-й день аспирируйте среду, промывайте клетки 1 раз DPBS и добавляйте свежую среду Complete Induction , содержащую 40 мкМ BrdU.
    21. На 6-й день аспирируйте среду, промывайте клетки 1 раз DPBS и добавляйте среду Neuron , дополненную 1 мкг/мл ламинина.
    22. На 9-й день измените 1/3-ю часть среды, заменив ее свежей средой Neuron , дополненной 1 мкг/мл ламинина.
    23. Поддерживайтеi 3ЛМН в течение дополнительных 25 дней, выполняя половинные изменения среды с нейронной средой , дополненной свежим 1 мкг / мл ламинина каждые 3-4 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент времени i3ЛМН должны представлять морфологию нейронов с длительными процессами. Нейроны также имеют тенденцию образовывать скопления или скопления клеток. Более подробное описание того, как проверить дифференциацию i 3 ЛМН,можно найти в другом месте17.
  2. Очистка и маркировка синаптосом
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте стерильные условия и выполняйте все шаги внутри шкафа биобезопасности.
    1. Мойтеi 3 ЛМН дважды с DPBS.
    2. Добавьте 2 мл ледяного клеточного лизиса реагента для выделения синаптосом, инкубируйте на льду в течение 2 мин и плотно соскоблите нейроны.
    3. Переложите лизат на несколько микротрубок по 2 мл (~1,5 мл лизата на пробирку) и центрифугу при 1 200 × г в течение 10 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте трубки на льду на протяжении всей этой процедуры.
    4. Собрать супернатант (отбросить гранулу) и центрифугу при 15 000 × г в течение 20 мин при 4 °C. Сохраните и повторно суспендируйте гранулы, содержащие синаптосомы с аналогичным объемом (как и исходный лизат) 5% DMSO в DPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синаптосомы могут быть немедленно помечены флуорофором или сохранены при -80 °C для будущего использования.
    5. Выполните анализ белка бицинхониновой кислоты (BCA) для всех трубок, чтобы оценить общий выход белка в препарате синаптосомы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения концентрации белка могут быть использованы другие анализы. Общий выход белка, полученного из различных препаратов, был включен в таблицу 1 в качестве эталона. Рекомендуется проводить вестерн-блоттинговый анализ препарата синаптосом для подтверждения наличия пресинаптических и постсинаптических белков. Здесь пресинаптический маркер, синаптофизин (SYP), и постсинаптический маркер, постсинаптический белок плотности 95 (PSD95), были выбраны для анализа вестерн-блоттинга, как описано ранее19.
    6. Приготовьте раствор бикарбоната натрия 100 мМ в воде, отрегулируйте рН до 8,5 и стерильно-фильтруйте.
    7. Солюбилизируйте 1 мг лиофилизированного порошка используемого рН-чувствительного красителя в 150 мкл ДМСО. Сделайте одноразовые аликвоты и храните их при -80 °C.
    8. Центрифугируют синаптосомы при 15 000 × г в течение 5 мин при 4 °C.
    9. Разводят до 1 мг синаптосом в 100 мкл раствора бикарбоната натрия 100 мМ.
    10. Чтобы маркировать синаптосомы, добавляют 1 мкл восстановленного pH-чувствительного красителя на 1 мг синаптосом и покрывают реакцию алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света. Встряхните при комнатной температуре в течение 2 ч с помощью шейкера для трубок.
    11. Добавьте в пробирку 1 мл DPBS и центрифугируйте меченые синаптосомы при 15 000 × г в течение 5 мин при 4 °C.
    12. Удалите супернатант и выполните четыре дополнительные промывки, как описано в шаге 2.2.11.
    13. После окончательной промывки и отжима удалите супернатант как можно больше, не нарушая гранулу, и повторно суспендируйте меченые синаптосомы с 5% DMSO в DPBS в объеме для желаемой концентрации (здесь используется 0,7 мкг/мкл). Приготовьте одноразовые аликвоты и храните при -80 °C. Обязательно избегайте воздействия света на меченые синаптосомы.
  3. Анализ фагоцитоза живых клеток
    1. Пластина 20-30 × 104 PMP в 96-луночные пластины в 100 мкл полной среды iMG и следовать процессу дифференцировки в течение 10 дней, как указано на этапе 1.2.4.
    2. В день анализа готовят раствор для ядерного окрашивания, добавляя 1 каплю ядерного пятна для живых клеток в 2 мл базальной среды iMG.
    3. Удалите 40 мкл среды на лунку 96-луночной пластины и добавьте 10 мкл раствора для ядерного окрашивания с помощью многоканальной пипетки. Инкубировать пластину при 37 °C и 5% CO2 в течение 2 ч.
    4. Разморозьте меченые синаптосомы на льду и аккуратно нанесите ультразвук с помощью водяного ультразвука в течение 1 мин. Немедленно перенесите синаптосомы обратно в лед. Разбавляют меченые синаптосомы в полной среде iMG в соотношении 1 мкл синаптосом на 50 мкл среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация синаптосом зависит от анализа и может потребовать оптимизации. Для поддержания относительно низкого процента (т.е. 0,1% или менее) ДМСО в среде рекомендуется не добавлять более 2 мкл синаптосом на лунку.
    5. В качестве отрицательного контроля предварительно обработайте некоторые скважины цитохалазином D для ингибирования полимеризации актина и, следовательно, фагоцитоза. Готовят раствор 60 мкМ цитохалазина D в полной среде iMG. Добавляют 10 мкл этого раствора в каждую лунку для конечной концентрации 10 мкМ и инкубируют при 37 °C и 5% CO2 в течение 30 мин.
    6. Выньте пластину из инкубатора и инкубируйте при 10 °C в течение 10 мин. Выдержите пластину на льду и добавьте 50 мкл среды, содержащей синаптосомы, приготовленные, как описано на этапе 2.3.4.
    7. Центрифугируйте пластину при 270 × г в течение 3 мин при 10 °C и держите пластину на льду до получения изображения.
  4. Получение и анализ изображений
    1. Вставьте пластину в считыватель изображений живых клеток и выберите скважины для анализа.
    2. Выберите объектив 20x .
    3. Отрегулируйте фокусировку, интенсивность светодиодов (LED), время интеграции и усиление яркого поля и синего (4',6-диамидино-2-фенилиндол [DAPI]) каналов. Флуоресценция синаптосом должна быть незначительной в начальной точке времени. Чтобы сфокусироваться на красном (RFP) канале, используйте канал яркого поля в качестве эталона. Время интеграции и коэффициент усиления могут варьироваться в зависимости от эксперимента; используйте следующие начальные настройки для красного канала: LED: 4, время интеграции: 250 и коэффициент усиления: 5.
    4. Выберите количество отдельных плиток, которые будут приобретены при монтаже на скважину (приобретите 16 плиток в центре скважины, тем самым получив визуализацию примерно 5% от общей площади скважины). Установите температуру на 37 °C и требуемый интервал времени для визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения были получены каждые 1 - 2 ч в течение 16 ч в этом исследовании.
    5. Откройте программное обеспечение для анализа.
      1. Откройте эксперимент, содержащий изображения. Щелкните значок Сокращение данных.
      2. В меню выберите Imaging Stitching в разделе Обработка изображений , чтобы создать полное изображение из 4 x 4 отдельных плиток в монтаже с параметрами, описанными в таблице 2.
      3. После создания сшитых изображений определите порог интенсивности , используя каналы DAPI и RFP для этих изображений. Откройте изображение и нажмите « Анализировать»; в разделе Анализ выберите Клеточный анализ, а в разделе Канал обнаружения выберите сшитое изображение в каналах DAPI или RFP. Перейдите на вкладку Основная маска и счетчик и установите пороговое значение и значения размера объекта , которые правильно выбирают ядра ячеек в канале DAPI или сигнал синаптосомы в канале RFP. Повторяйте процесс с различными изображениями до тех пор, пока не будут оптимизированы параметры, которые могут быть применены ко всему эксперименту.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемые значения приведены в таблице 2.
      4. Чтобы подсчитать количество ядер, перейдите в меню «Уменьшение данных» и в разделе «Анализ изображений» выберите «Клеточный анализ». Перейдите на вкладку Основная маска и счетчик и в разделе Канал выберите сшитые изображения DAPI и используйте параметры, описанные в таблице 2.
      5. Перейдите на вкладку Вычисляемые метрики и выберите Количество ячеек. Чтобы получить площадь сигнала синаптосомы, перейдите в меню «Уменьшение данных» и в разделе «Анализ» выберите «Клеточный анализ».
      6. Перейдите на вкладку Основная маска и счетчик и в разделе Канал выберите Сшитые изображения RFP и используйте параметры, описанные в таблице 2.
      7. Перейдите на вкладку Вычисляемые метрики и выберите Область суммы объектов. На вкладке Data Reduction нажмите OK и позвольте программному обеспечению проанализировать все полученные изображения.
      8. Экспортируйте значения «Площадь суммы объектов» и «Количество ячеек» для каждой точки времени. Разделите площадь суммы объектов на количество ячеек, чтобы вычислить нормализованную площадь за точку времени. При сравнении нескольких методов лечения или генотипов рассчитайте индекс фагоцитоза, используя уравнение (1):
        figure-protocol-1 (1)
      9. Сохраните результаты и интегрируйте данные.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для генерации iMG с использованием этого протокола важно начать с недифференцированных iPSCs, которые показывают компактную колониальную морфологию с четко определенными ребрами (рисунок 2A). Диссоциированные ИПСК, поддерживаемые, как описано в разделе формирования ЭБ, будут образовывать сферические агрегаты, называемые ЭБ, которые будут расти в размерах до 4-го дня дифференциации (рисунок 2В). Как только ЭБ собираются и покрываются в соответствующих условиях дл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол дифференцировки, описанный здесь, обеспечивает эффективный метод получения микроглиоподобных клеток, полученных из iPSC, за ~ 6-8 недель с высокой чистотой и с достаточным выходом для проведения экспериментов по иммунофлуоресценции и других анализов, требующих большего количества клеток. Этот протокол дал до 1 × 106 iMG за 1 неделю, что позволяет экстракцию белка и РНК и соответствующие последующие анализы (например, RNASeq, qRT-PCR, вестерн-блоттинг, масс-спектрометрию). Тем не менее, ограничение это...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Авторы благодарят Майкла Уорда за предоставление линии WTC11 hNIL iPSC для дифференцировки моторных нейронов и Лаборатории Джексона за поставку клона KOLF2.1J WT линии B03 iPSC, используемой для дифференцировки микроглии. Мы также благодарим Дороти Шафер за ее поддержку во время внедрения протоколов, Энтони Джампетруцци и Джона Ландерса за их помощь с системой визуализации живых клеток, а также Хейдена Гэдда за его технический вклад во время пересмотра и Джонатана Юнга за его сотрудничество в этом исследовании. Эта работа была поддержана Фондом неврологии Дэна и Дианы Риччио из Медицинской школы UMASS Chan и Angel Fund, Inc.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильные>антитела для иммунофлуоресцентного анализа
анти-IBA1 антитела кроликаWako Chemical СШАNC9288364 1:350 разведение
анти-P2RY12 антитела кроликаSigma-AldrichHPA0145181:50
разведение против TMEM119 антитела кроликаSigma-AldrichHPA051870разведение
1:100<сильные>Антитела для вестернблоттинг
анти-&бета;-тубулин антитела кроликаAbcamab60461:500
разведение анти-синаптофизина (SYP) антителакролика AbclonalA63441:1,000 разведение
анти-PSD95 антитела мышиMilliporeMAB1596разведение 1:500
<сильно>боратный буфер компоненты
борная кислота (100 мМ)SigmaB6768
Бикарбонат натрия (NaHCO3) BioXtraSigma-AldrichS6297-250G
Sodium chloride (75 mM)Sigma  S7653
Тетраборат натрия (25 мМ)Sigma221732
Материалы для клеточных культур
6-луночные планшетыGreiner Bio-One657160
40 μ m Клеточные фильтры  Falcon352340
100 мм x 20 мм Обработанный культурой тканейCELLTREAT229620
Клеточный подъемник, двусторонний, плоское лезвие и Узкое лезвие, стерильноеCELLTREAT229305
низкоадгезионным круглым дном 96-луночная пластинаCorning7007
Primaria 24-луночная плоскодонная поверхность модифицированная многолуночная клеточная культуральная пластинаCorning353847,Primaria
6-луночная клеточная прозрачная плоскодонная модифицированная многолуночная культуральная пластинаCorning353846
Primaria 96-луночная прозрачная плоская плоская Нижняя микропластинаCorning353872
Клеточная диссоциация реагентов
Accutase  Реагенты диссоциации Corning25058CIдля снижения дифференцировки моторных нейронов
Реагент TrypLELife Technologies12-605-010диссоциационные реагенты для дифференцировки микроглии
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020
Coating реагенты для клеточных культур
Matrigel GFR Мембранная матрицаCorning™354230Относится к реагенту для покрытия внеклеточного матрикса
CellStick Laminin-521STEMCELL Technology77004Относится к ламинину 521
Poly-D-лизинуSigmaP7405Восстанавливается до 0,1 мг/мл в боратном буфере
Poly-L-орнитинSigma  P3655Восстановите до 1 мг/мл в боратном буфере
<сильный>Компоненты среды iPSC
  mTeSR Plus KitSTEMCELL Technology100-0276Для приготовления iPSC среды смешали компоненты до 1x
Компоненты EB среды
BMP-4Fisher ScientificPHC9534конечная концентрация 50 нг/мл
iPSC средыконцентрация 1x
Ингибитор ROCK Y27632Fisher ScientificBD 562822конечной концентрации 10 M
SCFPeproTech300-07конечная концентрация 20 нг/мл
VEGFPeproTech100-20Aконечная концентрация 50 нг/мл
Компоненты базовой среды PMP
GlutaMAXGibco35050061конечная концентрация 1x
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)Gibco15140122конечная концентрация 100 Ед/мл
X-VIVO 15Lonza12001-988конечная концентрация 1x
Компоненты PMP полная среда
55 mM 2-меркаптоэтанолGibco21985023конечная концентрация 55 &; M
IL-3PeproTech200-03конечная концентрация 25 нг/мл
M-CSFPeproTech300-25конечная концентрация 100 нг/мл
PMP основная средаконцентрация 1x
Компоненты iMG базовая среда
Advanced DMEM/F12Gibco12634010конечная концентрация 1x
GlutaMAXGibco35050061конечная концентрация 1x
N2 добавка, 100xGibco17502-048конечная концентрация 1x
пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Gibco15140122конечная концентрация 100 ЕД/мл
<сильный>Компоненты iMG полная среда
55 мМ 2-меркаптоэтанолGibco21985023конечной концентрацией 55 &; M
IL-34PeproTech или Biologend200-34 или 577904конечная концентрация 100 нг/мл
iMG базовая средаконечная концентрация 1x
M-CSFPeproTech300-25конечная концентрация 5 нг/мл
TGF-βPeproTech100-21конечная концентрация 50 нг/мл
Компоненты индукционной основной среды
DMEM/F12 с HEPESGibco11330032конечной концентрацией 1x
GlutaMAXGibco35050061конечной концентрацией 1x
N2 добавка, 100xGibco17502-048конечная концентрация 1x
заменимые аминокислоты (NEAA), 100xGibco11140050конечная концентрация 1x
Компоненты полной индукционной среды
Compound ECalbiochem565790конечная концентрация 0,2 μ М и восстановите стоковый реагент до 2 мМ в 1:1 этаноле и ДМСО
ДоксициклинСигмаД9891в конечной концентрации 2 мкм; г/мл и восстановите стоковый реагент до 2 мг/мл в DPBS
Induction base mediaконцентрация 1x
ингибитор ROCK Y27632Fisher ScientificBD 562822конечной концентрации 10 мкм; M
Components of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture SystemGibcoA3653401конечной концентрации 1x для сред и добавок
GlutaMAXGibco35050061конечной концентрации 1x
N2 добавки, 100xGibco17502-048конечной концентрации 1x
Заменимые аминокислоты (NEAA), 100xGibco11140050конечной концентрацией 1x
iPSC линии, использованные в этом исследовании
KOLF2.1J: клон WT B03The Jackson Laboratories
WTC11 hNILNational Institute of Health
Synaptosomion isolation reagents
Набор для анализа белка BCAThermo Scientific Pierce23227
диметилсульфоксид (ДМСО)SigmaD2650
Syn-PER Реагент для экстракции синаптического белкаThermo Scientific87793Относится к реагентам для лизиса клеток для выделения синаптосом
<сильный>Фагоцитоз красители
Реагент NucBlue Live ReadyInvitrogen  R37605
pHrodo Red, сукцинимидиловый эфирThermoFisher Scientific  P36600Относится к pH-чувствительному красителю
<сильному>Другим реагентам для клеточных культур
Трипановый синий, 0,4% растворAMRESCO INCK940-100ML
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma22144-77-0
BrdUSigmaB9285Восстановите до 40 мМ в стерильной воде
Цитохалазин DSigmaконечная концентрация 10 & микро;
M DPBS с кальцием и магниемCorning21-030-CV
DPBS без кальция и магнияCorning21-031-CVОтносится к DPBS
KnockOut  DMEM/F-12Gibco12660012Относится к DMEM-F12, оптимизированному для роста человеческих эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
Ламинин Мышиный белок, натуральныйGibco23017015Относится к ламинину
<сильному>программному обеспечению и оборудованию
центрифугаEppendorfModel 5810R
Cytation 5 для визуализации живых клеток СчитывательBiotek
Gen5 Microplate Reader and Imager SoftwareBiotekversion 3.03
Multi-Therm Heat-ShakeBenchmarkотносится к трубочному вибростенду
Water sonicatorElmaMode Transsonic 310
конечная конечная конечная

Ссылки

  1. Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254(2021).
  2. Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065(2021).
  3. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  4. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  5. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  6. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  7. Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
  8. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  9. McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
  10. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  11. Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
  12. Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098(2013).
  13. Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486(2015).
  14. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144(2018).
  15. Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545(2015).
  16. Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138(2014).
  17. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51(2018).
  18. Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808(2020).
  19. Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  20. Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
  21. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи