Трехмерные сердечные ткани, биоинженерные с использованием кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, стали многообещающими моделями для изучения здорового и больного миокарда человека in vitro , повторяя ключевые аспекты нативной сердечной ниши. В данной статье описывается протокол изготовления и анализа высокосодержательных инженерных тканей сердца, полученных из индуцированных плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток человека.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Проектирование биореактора для улучшения сбора данных и моделирования пропускной способности инженерных тканей сердца
В этой статье
Уведомление об исправлении
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Краткое содержание
Аннотация
Сердечная недостаточность остается основной причиной смерти во всем мире, что создает острую потребность в более совершенных доклинических моделях человеческого сердца. Тканевая инженерия имеет решающее значение для фундаментальных научных исследований в области сердца; Культура клеток человека in vitro устраняет межвидовые различия животных моделей, в то время как более тканеподобная 3D-среда (например, с внеклеточным матриксом и гетероцеллюлярным сопряжением) моделирует условия in vivo в большей степени, чем традиционная двумерная культура на пластиковых чашках Петри. Однако для каждой модельной системы требуется специализированное оборудование, например, специально разработанные биореакторы и устройства функциональной оценки. Кроме того, эти протоколы часто являются сложными, трудоемкими и страдают от отказа маленьких, нежных тканей.
В данной работе описывается процесс создания надежной системы моделирования инженерной ткани сердца человека (hECT) с использованием индуцированных плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, для лонгитюдного измерения функции тканей. Шесть hECT с линейной геометрией полосы культивируются параллельно, при этом каждый hECT подвешивается к паре чувствительных к силе стойкам из полидиметилсилоксана (PDMS), прикрепленных к стойкам PDMS. Каждый пост увенчан черным трекером стабильных постов PDMS (SPoT), новой функцией, которая повышает простоту использования, пропускную способность, удержание тканей и качество данных. Форма позволяет надежно оптически отслеживать прогибы столбов, обеспечивая улучшенную трассировку силы подергивания с абсолютным активным и пассивным натяжением. Геометрия колпачка исключает разрушение тканей из-за соскальзывания hECT со стоек, а поскольку они включают в себя второй этап после изготовления стойки PDMS, SPoT могут быть добавлены к существующим конструкциям на основе стоек PDMS без существенных изменений в процессе изготовления биореактора.
Система используется для демонстрации важности измерения функции hECT при физиологических температурах и показывает стабильную функцию тканей во время сбора данных. Таким образом, мы описываем современную модельную систему, которая воспроизводит ключевые физиологические условия для повышения биоточности, эффективности и строгости инженерных сердечных тканей для применения in vitro .
Введение
Инженерные модели сердечной ткани имеют различную геометрию и конфигурацию для повторения различных аспектов нативной сердечной ниши, которые трудно получить с помощью традиционной двумерной клеточной культуры. Одной из наиболее распространенных конфигураций является линейная тканевая полоса с гибкими анкерами на каждом конце, чтобы вызвать самосборку ткани и обеспечить ткани определенный предварительный натяг и считывание результирующих сил подергивания 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
В этом протоколе использовалась обезличенная линия ИПСК SkiPS 31.3 (первоначально перепрограммированная с использованием дермальных фибробластов здорового 45-летнего мужчины)47 и, таким образом, он был освобожден от специального одобрения Институционального наблюдательного совета, в соответствии с руководящими принципами комитета по этике исследований на людях. Выполняйте все манипуляции с клетками и hECT в асептических условиях в шкафу биологической безопасности класса II с фильтрацией HEPA или на рабочем столе с ламинарным потоком. Стерилизуйте все нестерильные растворы путем фильтрации через фильтр 0,22 мкм и поддерживайте все клетки и hECT ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В соответствии с вышеприведенным протоколом, кардиомиоциты были получены из здоровой линии ИПСК, ранее использовавшейся нашей группой 9,15, и изготовлены в hECT через 8-61 день в культуре. На рисунке 9A показаны репрезентативные изображения hECT снизу, которые были созданы без (вверху) и с (внизу) SPoT. Функциональные измерения проводили при комнатной температуре (23 °C) и при физиологической температуре (36 °C) в период от 37 до 52 .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В литературе опубликовано множество линейно-инженерных моделей сердечной ткани, некоторые из которых описаны в таблице 1. Некоторые модели предполагают непосредственное измерение силы в тканях, но они, как правило, требуют переноса конструкции в отдельную мышечную ванну38. Большинство моделей спроектированы с тканями, постоянно прикрепленными к обоим концам, чаще всего к стойкам PDMS 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
K.D.C. является соучредителем и главным научным сотрудником Novoheart, а также владеет долей в холдинговой компании Medera Biopharmaceutical. Компания Novoheart не принимала участия в финансировании, планировании или проведении этого исследования; тем не менее, результаты исследования потенциально могут оказать финансовое влияние на Novoheart и Medera. Другие авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Благодарности
Авторы выражают признательность доктору Тимоти Кэшману за предыдущую работу над этим методом. Это исследование было поддержано финансированием Национальных институтов здравоохранения (NIH) (R01-HL132226 и K01 HL133424) и Международной программы передового опыта Фонда Ледюка (CURE-PLaN).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Проволока из нержавеющей стали диаметром 0,25 мм 304 McMaster | Carr | 6517K61 | |
| 0,25% трипсин-ЭДТА | Gibco | 25200056 | |
| 1,7 мл Микропробирки | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 см посуды (высота 20 мм) | Corning | 353003 | |
| 10 мл Серологическая пипетка | Drummond | 6-000-010 | |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | развести 1:10 в стерильной дистиллированной воде |
| 10X Модифицированный Eagle Medium | Sigma Aldrich | M0275 | |
| 20 - 200 μ L Микропипетка | Eppendorf | 3123000055 | |
| 200 μ L Наконечники для микропипеток | VWR | 76322-150 | |
| 5 мл Серологическая пипетка | Drummond | 6-000-005 | |
| 50 мл Конические центрифужные пробирки | Falcon | 352070 | |
| 6 см Чашка Петри | Corning | 353002 | |
| 6 Вт Светодиод Двойной осветитель на гусиной шее | AmScope | LED-6W | |
| 6-луночные пластины | Corning | 353046 | |
| угловое зеркало 90 градусов | Edmund Optics | 45-594 | |
| Акриловый клей для склеивания | SCIGRIP | #4 | |
| Регулируемый 10 см x 10 см Джек | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
| Алюминий 6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
| A-Plan 10X Объектив | ZEISS | 1020-863 | |
| Автоклавные пакеты | Propper | 21002 | |
| B-27 добавка | ThermoFisher | 17504044 | |
| B-27 добавка (без инсулина) | ThermoFisher | A1895601 | |
| Настольная центрифуга | Eppendorf | 5810 R Черный | |
| ABS | Ultimaker | 2,85 мм ширина | |
| Говядина Коллаген I | Gibco | A1064401 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| Класс II Кабинет биобезопасности | Labconco | 3430009 | |
| прозрачным акриловым листом | estreetplastics | 1002502436 | толщиной 6,25 мм |
| Вертикальный фрезерный станок | с ЧПУ Haas | VF-1 | |
| Проводящие графитовые стержни | McMaster Carr | 1763T33 | |
| Диссекционный микроскоп | Olympus | SZ61 | |
| Модифицированный Eagle Medium от Dulbecco/Ham's F-12 Питательная смесь | ThermoFisher | 11330032 | |
| этанолом | Fisher Scientific | A4094 | Разведение до 70% в воде |
| Автоматический счетчик клеток EVE | NanoEntek | E1000 | |
| Предметное стекло EVE Cell Slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Life Technologies | 10438026 | |
| Тонкие изогнутые щипцы | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Forma Series II CO2-инкубатор с водяной рубашкой | Thermo Electron Corporation | 3110 | AKA "инкубатор". С фильтром HEPA class 100 |
| программное обеспечение Fusion360 от | Autodesk | aka "CAD software" | |
| Стеклогемоцитометр | Reichert | 1475 | глубиной 0,1 мм |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| hESC квалифицированная матрица | Corning | 354277 | также известная как "базальная мембранная матрица". Хранить в замороженных аликвотах |
| Высокоскоростная ПЗС-камера | PixelLINK | P7410 | |
| Инвертированный микроскоп | Carl Zeiss Werk | Axiovert 40 CFL | 10X фазовый контрастный объектив |
| IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
| LabView Программное обеспечение | National Instruments | 2016 | |
| Ламинарный поток чистый скамейка | NuAire | NU-201-330 | необходим для функционального анализа hECT |
| Ноутбук | AsusTek | Strix | Intel Core i& процессор, процессор 2,8 ГГц, 16 ГБ ОЗУ |
| Станок для лазерной резки | Epilog | Helix 24 | |
| Увеличение | гарнитуры ExcelBlades | 70020 | Рекомендуется для шагов, требующих тонких манипуляций |
| Matlab | Mathworks | Version 2019b или более поздней | версии AKA «анализ данных» программное обеспечение" |
| Ножницы Micro Vannas, лезвие 3 мм | WPI Instruments | 501839 | |
| микроскоп Стенд для стрелы | Olympus | SZ2-STU1 | |
| Пенициллин-стрептомицин стоковый раствор | ThermoFisher | 15140122 | 10 000 МЕ/мл пенициллина; 10 000 мкм; г/мл стрептомицин |
| Фосфатно-солевой буфер без двухвалентных катионов | Sigma Aldrich | P3813 | Разведенный в дистиллированной воде до концентраций 1X и 10X |
| Контроллер пипетки | Drummond | 4-000-100 | |
| PixelLINK Capture OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | AKA "Camera Software" |
| Полисульфон | McMaster Carr | 86735K73 | полупрозрачный янтарный цвет |
| политетрафторэтилен (ПТФЭ) | McMaster Carr | 8545K176 | Черный, формованный |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | AKA "iPSC dissociation media" |
| Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media | ThermoFisher | 11875135 | |
| Силиконовая пленка | SMI производство | глянцевая, 0,02 дюйма, твердость 40 | |
| Размер 10/0 Синий, зеленый, красный и желтый стеклянные бисерные бусины | Цвет Майкла | должен выдержать автоклаватор | |
| Шпатель Fisher | Scientific | 14-373 | используется для смешивания PDMS |
| Square Pulse Stimulator | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
| Нержавеющая сталь Razoblades | GEM | 62-0179-CTN | предпочтительнее ненержавеющей стали из-за более низкой твердости |
| Stemflex | ThermoFisher | A3349401 | также известный как "iPSC питательные среды" |
| Стерильная дистиллированная вода | ThermoFisher | 5230 | |
| Sylgard 170 - Силиконовый эластомер Инкапсулянт черный 0,9 кг Комплект | Dow | DOWSIL 170 2LB KIT | AKA черный Полидиметилсилоксан (черный PDMS) |
| Sylgard 184 - Силиконовый эластомер прозрачный 1 фунт Kit | Dow | DC 184 SYLGARD 0,5 кг 1,1 фунта | Комплект AKA Полидиметилсилоксан (PDMS) |
| Нагреваемый столик с регулируемой температурой | Okolab | H401-HG-SMU | Высота набора до 10 см |
| Термопластичный 3D-принтер | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
| Тиазовивин | Selleck Chem | S1459 | |
| Трипан синий | NanoEntek | EBT-001 | |
| Вакуумная камера | Bel-Art Parts | F42027-0000 | |
| Мини-ленточная пила с регулируемой скоростью | Micro-Mark | 82203 | |
| Миниатюрный сверлильный станок с регулируемой скоростью | Micro-Mark | 82959 | |
| Вибрация Изоляционный стол | Labconco | 3618000 | |
| Весовые лодки | VWR | 10803-140 | |
| Цилиндр когтя Настольный зажим | VWR | 97035-528 | AKA винтовой зажим |
Ссылки
- Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Engineering. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
- Turnbull, I. C., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Исправление
Formal Correction: Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
Posted by JoVE Editors on 1/10/2024. Citeable Link.
An erratum was issued for: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues. The title was corrected from:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues
to:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
