Выделение регенерирующих гепатоцитов после частичной гепатэктомии у мышей

Краткое содержание

Липидные гепатоциты присущи регенерации печени, но обычно теряются при центрифугировании с градиентом плотности. Здесь мы представляем оптимизированный протокол выделения клеток, который сохраняет стеатотические гепатоциты, давая репрезентативные популяции регенерирующих гепатоцитов после частичной гепатэктомии у мышей.

Аннотация

Частичная гепатэктомия широко используется для исследования регенерации печени у мышей, но выделение высоких выходов жизнеспособных гепатоцитов для последующих одноклеточных применений является сложной задачей. Заметное накопление липидов в регенерирующих гепатоцитах наблюдается в течение первых 2 дней нормальной регенерации печени у мышей. Этот так называемый преходящий стеатоз, связанный с регенерацией (TRAS), является временным, но частично перекрывает основную пролиферативную фазу. Очистка с градиентом плотности является основой большинства существующих протоколов выделения первичных гепатоцитов. Поскольку градиентная очистка зависит от плотности и размера клеток, она отделяет нестеатотические популяции гепатоцитов от стеатоза. Поэтому жировые гепатоциты часто теряются, образуя нерепрезентативные фракции гепатоцитов.

Представленный протокол описывает простой и надежный метод выделения in vivo регенерирующих гепатоцитов независимо от содержания в них липидов. Гепатоциты самцов мышей C57BL/6 выделяют через 24-48 ч после гепатэктомии классическим двухэтапным подходом к перфузии коллагеназы. Стандартный перистальтический насос нагнетает нагретые растворы через катетеризированную нижнюю полую вену в остаток, используя метод ретроградной перфузии с оттоком через воротную вену. Гепатоциты диссоциируют коллагеназой для их высвобождения из капсулы Глиссона. После промывки и тщательного центрифугирования гепатоциты можно использовать для любых последующих анализов. В заключение, в этой статье описывается простой и воспроизводимый метод выделения репрезентативной популяции регенерирующих гепатоцитов после частичной гепатэктомии у мышей. Метод также может помочь в изучении жировой болезни печени.

Введение

Печень может регенерировать себя даже после значительной потери ткани. Эта уникальная регенеративная способность наглядно иллюстрируется экспериментальной моделью частичной (70%) гепатэктомии, впервые описанной на крысах Хиггинсом и Андерсоном в 1931 году¹. В этой модели 70% печени удаляется хирургическим путем у животных путем отсечения более крупных долей печени. Затем оставшиеся доли растут за счет компенсаторной гипертрофии, чтобы восстановить первоначальную массу печени в течение примерно 1 недели после операции, хотя и без восстановления исходной архитектуры печени ^2,3. Были разработаны дополнительные гепатэктомии с различным количеством удаления тканей, такие как гепатэктомия с удлинением 86%, когда остаток печени слишком мал для восстановления, что в конечном итоге приводит к печеночной недостаточности после гепатэктомии (PHLF) и последующей смерти у 30-50% животных ^4,5,6. Эти модели позволяют изучать нормальную и неудачную регенерацию печени в зависимости от количества резецированной ткани (рис. 1).

Хотя мышиные модели гепатэктомии успешно использовались в течение многих лет, только недавно появились более продвинутые аналитические методы, позволяющие глубже понять на уровне отдельных клеток. Однако для большинства из этих методов наличие отдельных гепатоцитов является основной предпосылкой. Большинство протоколов выделения первичных гепатоцитов основаны на двухступенчатой методике перфузии коллагеназы и последующей градиентной очистке плотности для отделения жизнеспособных гепатоцитов от мусора и непаренхиматозных, а также мертвых клеток ^7,8,9. Этот метод был впервые описан Берри и Френдом в 1969 году¹⁰ и адаптирован Сегленом и его коллегами в 1972 году^11,12. Однако, поскольку градиентное центрифугирование зависит от плотности и размера клеток, насыщенные липидами гепатоциты часто теряются во время стандартной очистки. Хотя такая потеря может быть незначительной для многих исследовательских вопросов, она является важным аспектом для ранней регенерации печени. В течение первых 2 дней гепатоциты в регенерирующей печени мыши накапливают липиды, тем самым увеличиваясь в размерах и уменьшаясь в плотности. Этот транзиторный регенеративный стеатоз (TRAS) служит для обеспечения регенеративного топлива и является временным, но частично перекрывает основную пролиферативную фазу и неравномерно распределен в дольках печени - функциональных единицах печени^13,14. Однако после расширенной 86%-гепатэктомии TRAS также возникает, но сохраняется, потому что регенерация останавливается, а липиды не окисляются¹⁴. Следовательно, градиентная очистка гепатоцитов после 70% или 86%-гепатэктомии даст нерепрезентативные фракции, поскольку большинство липидных гепатоцитов теряется из-за их низкой плотности¹⁵.

В этом модифицированном протоколе изоляции гепатоциты мышей C57BL/6 выделяют через 24-48 ч после гепатэктомии классическим двухэтапным подходом к перфузии коллагеназы. Обычно канюляция и перфузия остатка для выделения клеток проводятся через воротную вену. Тем не менее, портоваскулярное сопротивление в небольших остатках, оставшихся после большой резекции, составляет¹⁶, и, таким образом, перфузия является деликатной. Поскольку полая вена остается незатронутой гепатэктомией, перфузия может быть легко выполнена в ретроградном направлении путем канюляции полой вены. Стандартный перистальтический насос подает нагретые растворы через катетеризированную нижнюю полую вену в остаток печени, используя ретроградную перфузию с оттоком через воротную вену (дополнительный рисунок S1). Гепатоциты диссоциируют коллагеназами и высвобождаются из капсулы Глиссона. После промывки и тщательной обработки жизнеспособных гепатоцитов путем ступенчатой изоляции с использованием низкоскоростного центрифугирования гепатоциты можно использовать для любых последующих анализов.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Федеральными правилами Швейцарии по животным и одобрены Ветеринарным управлением Цюриха (No 007/2017, 156/2019), обеспечивая заботу о человеке. Самцов мышей C57BL/6 в возрасте 10-12 недель держали в 12-часовом дневном цикле со свободным доступом к пище и воде. Каждая экспериментальная группа состояла из шести-восьми животных. Подробную информацию обо всех материалах, оборудовании и реагентах, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .

1. Частичная гепатэктомия у мышей

1. При стандартной гепатэктомии (70%) перевязывают и резецируют левую боковую долю, правую часть срединной доли и левую часть срединной доли (рис. 1B). При расширенной гепатэктомии (86%)⁴ также удаляют хвостатые доли и правую переднюю долю (рис. 1C).
2. ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная гепатэктомия - это процедура, которая уже много лет используется в исследованиях регенерации печени. Доступны протоколы для этой процедуры^3,17, включая видеопротокол Митчелла и Вилленбринга ¹⁸. Более подробную информацию о методах, используемых здесь для гепатэктомии, можно найти в дополнительном файле 1.

Рисунок 1: Стандартная (70%) и расширенная (86%) гепатэктомия у мышей. (A) Пять долей печени мыши и их соответствующий вклад в общую массу печени. (B) Схематическая иллюстрация 70%-ной гепатэктомии у мышей. Темные доли представляют собой будущий остаток печени. (C) Схематическая иллюстрация 86%-ной гепатэктомии у мышей. Темные доли представляют собой будущий остаток печени. (D) Точный объем резецированной ткани после 70% и 86% гепатэктомии. (E) Живот мыши сразу после 70%-ной гепатэктомии; (F) живот мыши сразу (слева) и через 48 ч (справа) после 86%-ной гепатэктомии. Обратите внимание на бледный цвет стеатотического остатка (белая стрелка). n = 6-7/группа. Сокращения: sHx = стандартная гепатэктомия; eHx = расширенная гепатэктомия; LW = вес печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Приготовление перфузионных растворов

1. Подготовьте буферы для перфузии, сбраживания и консервации (см. Таблицу 1).
   1. Отрегулируйте рН всех буферных растворов при 37 °C, добавляя гидроксид натрия (NaOH) или хлористый водород (HCl) по мере необходимости. Оптимальный рН для буферов составляет 7,4.
   2. Поместите буфер сохранения и Medium E Уильямса на лед.
2. Подготовьте буфер для проточной цитометрии и храните его на льду.

Таблица 1: Растворы и буферы, используемые для переваривания и очистки гепатоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

3. Подготовка перфузионного оборудования

1. Нагрейте водяную баню до 42 °C и поместите буфер для перфузии (50 мл) и буфер для сбраживания (10-20 мл) на водяную баню. Пока не добавляйте коллагеназу в буфер пищеварения.
2. Подготовьте перистальтический насос и вставьте трубку. Полная настройка перфузии показана на рисунке 2.
   1. Подсоедините канюлю 26 G IV к выходному концу трубки с помощью соединителя замка Luer. Вставьте входной конец трубки в предварительно подогретую буферную трубку для перфузии на водяной бане. Промойте трубку 70% этанолом, а затем 50 мл стерильного хлорида натрия (NaCl 0,9%). Заправьте трубку теплым перфузионным буфером (скорость насоса 3 мл/мин).
3. Успокаивайте мышей с помощью ингаляционной анестезии изофлурана (800 мл / мин O 2, 3% -5% изофлурана для индукции и₂% для поддержания во время процедуры). Храните изофлуран под лабораторным колпаком и обеспечьте достаточную вентиляцию.
4. Вводят бупренорфин подкожно за 30 мин до операции в дозировке 0,1 мг/кг массы тела.
5. Чтобы предотвратить переохлаждение, поместите успокоенную мышь на грелку и положите свернутую ткань под верхнюю часть живота, чтобы поднять печень над другими органами и облегчить доступ к нижней полой вене.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте слишком толстую ткань, так как возможно перегиб сосудов и это повлияет на эффективность перфузии.
6. Добавьте глазную мазь, чтобы предотвратить повреждение роговицы.
7. Перед началом операции убедитесь, что животное находится под адекватной анестезией, проверив рефлекс отвода педали (ущипните подушечку стопы на обеих задних лапах). В случае ответа предоставьте дополнительную анестезию и повторите тест перед началом процедуры.
8. Очистите живот 70% этанолом.
   1. Снова откройте разрез по средней линии, разрезав шов и осторожно раздвинув края раны. Если гепатэктомия старше 24-48 часов, снимите шов и разрежьте кожу ножницами.
   2. Зафиксируйте полипропиленовый шов 5-0 к грудине, натяните его краниально и зафиксируйте в таком положении. Используйте ретрактор или простые зажимы, чтобы держать живот открытым. Брюшная полость должна быть максимально открыта, чтобы оптимизировать доступ и визуализацию.
9. Переместите кишечник вправо с помощью ватных тампонов, чтобы открыть воротную вену и полую вену. Используйте влажную ткань, чтобы сохранить кишечник.
10. Поместите тяжелый предмет высотой около 2 см (например, силиконовое утяжеляющее кольцо для объемных колб) рядом с задними лапами мыши (дополнительный рисунок S2A). Поместите трубку с подключенной канюлей 26 G IV на объект и осторожно поместите иглу поверх полой вены. Отрегулируйте длину трубки.
11. Поместите приготовленный исходный раствор коллагеназы в предварительно подогретую буферную пробирку для разложения. Добавьте 250 мкл исходного раствора в 10 мл буфера для разложения. Приготовьте 10-20 мл буфера для переваривания на животное. Для более крупных животных или перфузии цельной печени приготовьте до 30 мл буфера для пищеварения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется добавлять исходный раствор коллагеназы в подогретый буфер для разложения примерно за 30 минут до начала процесса сбраживания.
    
    Рисунок 2: Обзор перфузионной установки. (A) Хирургический стол с оборудованием, необходимым для перфузии. (B) Материалы, необходимые для подготовки печени, а также для экстракции и выделения гепатоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Канюляция и перфузия

1. Отрегулируйте скорость насоса до 3 мл/мин и включите насос. Дайте предварительно подогретому буферу перфузии достичь иглы. Откажитесь от первых 2-3 мл перфузионного буфера.
2. Выполняют канюляцию нижней полой вены.
   1. Пока буфер проходит через иглу, вставьте канюлю 26 G IV под небольшим углом в полую вену под почкой. Убедитесь, что скос иглы направлен вверх.
   2. С помощью ватного тампона осторожно потяните полую вену каудально ниже места прокола, чтобы обеспеченное натяжение облегчило введение канюли в вену. Ищите кровь в камере вспышки катетера, когда игла входит в просвет.
   3. Продвинуте иглу еще на 2-3 мм, чтобы убедиться, что кончик пластикового катетера также вошел в вену.
   4. Наденьте пластиковый катетер на иглу и в полую вену еще на 5 мм. Извлекайте иглу медленно и очень осторожно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксировать канюлю лигатурой не рекомендуется. Этот шаг занимает много времени, так как для этого необходимо сначала вскрыть сосуд. Если канюля свободно расположена и поддерживается каким-либо предметом, дальнейшая фиксация не требуется (см. настройку перфузии на дополнительном рисунке S2). Чтобы стабилизировать место канюляции и предотвратить обратный поток, на место канюляции можно добавить одну каплю мономерного н-бутилцианоакрилата.
3. Когда кровь выпадет из канюли, заполните ее теплым перфузионным буфером с помощью шприца.
4. Снова прикрепите трубку к канюле, продолжая работать со скоростью насоса 3 мл / мин. Пусть буфер перфузии попадет в печень.
5. Через 2-3 с обратите внимание на белые пятна, образующиеся в печени и/или расширение/отек воротной вены, которые указывают на то, что буфер перфузии протекает через печень и попадает в дольки печени из центральной вены (рис. 3).
6. Дождитесь заметного отека воротной вены в течение 1-2 с после появления белых пятен на поверхности печени. Разрежьте воротную вену ножницами как можно дальше от печеночного жила. Используйте зажим для микрососуда, чтобы пометить (не закрыть) место резки (рис. 3B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это упрощает оценку потока через печень во время процесса перфузии. Печень мгновенно очищается от крови и становится желто-белой в течение нескольких секунд (рис. 3C). Дополнительный разрез кожи с правой стороны брюшного отверстия облегчает отток крови, а также перфузионного раствора (рис. 3B и дополнительный рисунок S2B, C).
7. Увеличьте поток до 4-7 мл / мин в зависимости от веса животного, размера печени и степени предшествующей гепатэктомии.
8. Зажмите воротную вену пинцетом или сосудистым зажимом на 7-10 с. Убедитесь, что жидкость не проходит.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Печень заметно набухает во время зажима и расслабляется при освобождении. Это имеет решающее значение для промывания всей печени и очистки ее от оставшейся крови.
9. Выполните второй зажим примерно через 30 секунд и убедитесь, что печень набухает и расслабляется. Продолжайте промывать животное до тех пор, пока буфер, вытекающий из воротной вены, не станет чистым, но не менее 3-4 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость насоса зависит от трубки, а также от размера печени. Его необходимо оценивать индивидуально.
10. На этом этапе процедуры эвтаназия должна была произойти вторично по отношению к обескровливанию. Подтвердите, что системное кровообращение остановлено (нет сердцебиения или мерцания сердца). Чтобы обеспечить смерть, на этом этапе процедуры проводится двусторонний пневмоторакс как вторичный физический метод эвтаназии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Немного уменьшите скорость помпы, если системное кровообращение остановилось (нет сердцебиения или мерцания сердца).

Рисунок 3: Процесс перфузии от канюляции до пищеварения. (A) Анатомия печени мыши с нижней полой веной (белая стрелка) и воротной веной (желтая стрелка). (B) Канюляция нижней полой вены. Канюля закрепляется лигатурой (белая стрелка), а место оттока через открытую воротную вену отмечается (не зажимается) зажимом микрососуда. (C) Обратите внимание на появление пятнистых структур до того, как буфер перфузии очистит печень от всей оставшейся крови (белая стрелка). Кожа надрезается (желтая стрелка) и помещается ватный тампон для обеспечения дренажа крови и перфузионной жидкости. Прерывистый зажим может быть выполнен сосудистым зажимом или пинцетом. (D) Печень должна быть очищена от всей крови (*). После того, как коллагеназсодержащий буфер пищеварения попадет в печень, он больше не будет расслабляться после пережатия, и доли печени увеличатся в размерах. (E) Через некоторое время на поверхности печени может наблюдаться появление пузырьков (*). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Пищеварение

1. Приостановите работу перфузионного насоса и быстро перенесите впускную трубку из перфузионного буфера в предварительно подогретый буфер для сбраживания. Перезапустите насос.
2. До того, как буфер пищеварения достигнет печени, зажмите воротную вену еще раз на 3-4 часа. Убедитесь, что печень расслабляется при снятии зажима, а перфузионная жидкость остается чистой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для разложения содержит феноловый красный цвет и легко отличим от прозрачного перфузионного буфера. Это позволяет легко отслеживать внутри трубы.
3. Как только буфер пищеварения достигнет печени, снова зажмите воротную вену зажимом для микрососудов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При зажиме печень набухает, но не расслабляется при отпускании зажима. Это нормально.
4. Чтобы облегчить процесс пищеварения, закройте верхнюю полую вену сосудистым зажимом непосредственно под диафрагмой, чтобы буфер пищеварения мог пройти от нижней полой вены к печени к оттоку через открытую воротную вену.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот зажим обеспечивает обход системного кровообращения и предотвращение ненужного контакта с остаточными компонентами/ингибиторами крови. Этот шаг не является обязательным, так как трудно подойти к верхней полой вене за увеличенной тканью печени после фиктивной операции, но доступ намного проще у мышей, подвергшихся гепатэктомии.
5. Варить в течение примерно 4 мин при скорости потока 5 мл/мин. По мере того, как пищеварение прогрессирует, ищите признаки начала набухания печени и небольшие прозрачные / прозрачные участки на поверхности печени. Кроме того, обратите внимание, что печень приобретает текстуру влажного куска ткани и выглядит почти мокрой (рис. 3E). Прощупайте консистенцию, осторожно прикоснувшись к влажной ватной палочке.
6. Продолжайте перфузию до тех пор, пока не будет наблюдаться заметная разница в текстуре поверхности печени. Обратите внимание, что печень приобретает очень светлый цвет и пузырчатый вид (рис. 3E), а капсула Глиссона (т.е. печеночный мешок) отделяется от паренхимы. Остановите процесс пищеварения, как только печень приобретет эти свойства, так как чрезмерное переваривание может повредить гепатоциты. Извлеките иглу до того, как воздух попадет в печень.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно для достижения достаточного пищеварения требуется 10-20 мл буфера для пищеварения. Это зависит от размера животного, степени гепатэктомии, настройки трубок и качества раствора коллагеназы. При необходимости увеличьте время перфузии, а не скорость перфузии. Слишком большое давление в сосудистой системе может привести к разрыву печени, и жидкость для перфузии / пищеварения может быть потеряна в забрюшинном пространстве.

6. Подготовка печени

1. Аккуратно извлеките печень из брюшной полости. Будьте очень осторожны, так как сейчас он очень хлипкий и хрупкий.
2. Возьмитесь за центральную соединительную ткань между долями с помощью щипцов и слегка приподнимите ее вверх, используя в качестве опорной точки.
3. Перережьте все связи печени с другими органами, удалите желчный пузырь и поместите печень в ледяной буфер для сохранения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале экстракция гепатоцитов и дальнейшая обработка должны происходить немедленно, чтобы поддерживать жизнеспособность гепатоцитов. Однако при необходимости печень можно хранить в течение короткого времени при температуре 4 °C (например, для транспортировки). Эта задержка не должна превышать 30-40 мин.

7. Экстракция гепатоцитов

1. Переложите печень в чашку Петри диаметром 10 см и добавьте 10 мл ледяного Williams' Medium E.
2. Разорвите капсулу Глиссона пинцетом с тонким наконечником в нескольких местах вдоль поверхности печени. Захватите центральную часть (например, соединительную ткань в печени) двумя парами пинцета и медленно раздвиньте их, позволяя капсуле разорваться, не повреждая гепатоциты. Освободите клетки, осторожно встряхнув капсулу (дополнительный рисунок S3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале печень легко разрывается на части и высвобождает клетки. Не применяйте силу. Клеточный скребок может помочь полностью удалить все клетки и увеличить выход клеток. Не режьте печень на кусочки ножницами.
3. Отфильтруйте 5 мл пульпы печени через клеточное ситечко 100 мкм в пробирку объемом 50 мл. Промойте фильтр 10 мл свежей ледяной среды. Оставшиеся 5 мл мякоти процедите через клеточный фильтр.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте серологическую пипетку объемом 25 мл для переноса пульпы печени с диссоциированными гепатоцитами (рис. 4A). Меньшие пипетки с меньшими отверстиями увеличивают напряжение сдвига и необратимо повреждают гепатоциты.
4. Добавьте в общей сложности 30 мл холодной среды, чтобы промыть чашку Петри, отфильтровать ее и добавить суспензию в пробирку объемом 50 мл, пока она не заполнится. Все изолированные клетки в настоящее время находятся во взвешенном состоянии (рис. 4B).

Рисунок 4: Очистка щадящим центрифугированием . (A) Гомогенат печени, оставшийся после стадии экстракции. b) микроскопический вид (20-кратное увеличение) гомогената; Обратите внимание на отмеченное загрязнение мусором. (C) этапы центрифугирования очистки и (D) микроскопические виды надосадочных веществ, подлежащих отбраковке. (E) Микроскопический вид очищенной фракции гепатоцитов. Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

8. Выделение гепатоцитов

1. Отжим при 50 × g в течение 5 мин при 4 °C (минимально возможное ускорение и минимальное торможение).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гепатоциты плотнее, чем непаренхиматозные клетки печени. Из-за низкой силы центрифугирования гранулируются только гепатоциты, в то время как другие клетки (например, иммунные клетки, эритроциты и синусоидальные клетки) остаются в надосадочной жидкости.
2. Аспирируйте большую часть надосадочной жидкости, оставляя 1 мл для ресуспендирования клеток, осторожно закручивая трубку.
3. Добавьте 40 мл холодной среды Е Вильямса и снова вращайте при 50 × г в течение 10 минут при 4 ° C (низкое ускорение, низкое торможение) для дальнейшего удаления мертвых гепатоцитов и клеточного остатка, а также жизнеспособных и жирных гепатоцитов гранул (рис. 4C).
4. Откажитесь от большей части надосадочной жидкости, оставив 1 мл для ресуспендирования клеток, вращая трубку.
5. Добавьте 40 мл холодной среды Williams' E и снова вращайте при 50 × g в течение 5 минут при 4 ° C (низкое ускорение, низкое торможение).
6. Аспирируйте большую часть надосадочной жидкости, оставляя 1 мл для ресуспендирования клеток, осторожно закручивая трубку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не останавливайте этот процесс до тех пор, пока ячейки не будут зафиксированы или проанализированы. Гепатоциты очень хрупкие, и любая задержка в процессе перфузии, пищеварения и очистки может повредить клетки.
7. Определите конечную концентрацию клеток после добавления трипанового синего, используя улучшенную Нойбауэром счетную камеру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство обломков и непаренхиматозных клеток в настоящее время удалены, в результате чего после 70%-гепатэктомии остается чистая гранула примерно 10-15 ×^10-6 гепатоцитов.
8. В зависимости от желаемой концентрации, добавьте еще ледяную среду. Используйте суспензию гепатоцитарных клеток для любого последующего анализа или инициируйте первичную культуру клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе в суспензии остается лишь несколько иммунных и непаренхиматозных клеток (<5%). Если требуется дальнейшая очистка, выполните отрицательный отбор клеток CD31+ и CD45⁺ с помощью магнитной или флуоресцентной сортировки клеток (MACS/FACS). На сегодняшний день не существует надежного и надежного поверхностного маркера паренхиматозных клеток печени.

9. Подготовка выделенных гепатоцитов к проточной цитометрии

1. Центрифугируют гепатоциты по 100 × г в течение 5 мин.
2. Откажитесь от надосадочной жидкости и добавьте желаемое количество буфера проточной цитометрии в зависимости от концентрации клеточной суспензии.
3. Добавьте 1 мл клеточной суспензии в проточную цитометрическую пробирку. Центрифугу в течение 5 мин при 100 × г и выбросьте надосадочную жидкость.
4. Добавьте в клетки 100-200 мкл разбавленного зеленого красителя Alexa Fluor 488 Zombie (концентрация 1:400) и осторожно встряхните их. Осторожно ресуспендируйте гепатоциты ручным встряхиванием или с помощью вихревого миксера на низкой скорости (максимум 2-3) в течение 2 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте маленькие наконечники пипеток для ресуспендирования клеток. Они очень хрупкие, и приложенное напряжение сдвига вызывает повреждение и снижает жизнеспособность клеток. Если пипетки невозможно избежать, используйте пипетку объемом 1000 мкл после отрезания мельчайшей части от наконечника, чтобы увеличить диаметр, и очень медленно пипетируйте клетки.
5. Поместите тюбики на лед или храните их при комнатной температуре, в зависимости от желаемого окрашивания. Инкубируйте клетки в течение 20-30 мин в темноте.
6. Добавьте 2 мл буфера для проточной цитометрии и промойте клетки 3 раза. Центрифугируйте клетки после каждого этапа промывки по 100 × г в течение 5 мин.
7. Добавьте 2 мл фиксирующего буфера (1:1, 4% PFA и PBS). Осторожно ресуспендируйте гепатоциты ручным встряхиванием или с помощью вихревого миксера на низкой скорости (максимум 2-3) в течение 2 с.
8. Зафиксируйте клетки на 30 мин.
9. Центрифугу при 100 × г еще 5 мин, выбросьте надосадочную жидкость и добавьте буфер для проточной цитометрии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно хранить в буфере проточной цитометрии до анализа до 72 ч после выделения.

10. Анализ гепатоцитов методом проточной цитометрии

1. Проанализируйте гепатоциты с помощью фотосепаратора, активируемого флуоресценцией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывайте относительно большой размер гепатоцитов и регулируйте напряжения. Начните с низкого напряжения и не превышайте 350 В для прямого рассеяния (FSC) и 220 В для бокового рассеяния (SSC).
   1. Отрегулируйте напряжения для FSC и SSC в соответствии с предполагаемым большим размером ячеек. Определите популяцию гепатоцитов и запишите все события с помощью SSC-A и FSC-A (рис. 5A).
   2. Обратите внимание, что дебрисы и непаренхиматозные клетки отображаются в левом нижнем углу графика плотности FSC и SSC и исключаются (рис. 5A).
   3. Поскольку дублетные ячейки могут влиять на анализ, постройте график плотности высоты бокового рассеяния (SSC-H) и площади бокового рассеяния (SSC-A), чтобы исключить дублеты, как показано на рисунке 5B.
   4. Выберите окончательную популяцию гепатоцитов путем стробирования клеток CD31- (эндотелиальный маркер) и CD45^- (иммунный маркер) (рис. 5C).

Результаты

TRAS достигает пика через 16 ч после гепатэктомии и постепенно исчезает через 32-48 ч после стандартной гепатэктомии, но сохраняется более 48 ч после расширенной гепатэктомии. Макроскопически TRAS хорошо виден в виде бледного цвета лица остатка печени (рис. 1F) и может наблюдаться у мышей, подвергшихся гепатэктомии, между 16 и 48 часами после операции.

Предполагаемый конечный выход составляет 10-15 × 10 6 гепатоцитов после 70%-гепатэктомии и 4-9 ×^10,6 п...

Обсуждение

Опубликованный протокол обеспечивает надежный и простой метод выделения высокого выхода нормальных и стеатотических мышиных гепатоцитов для одноклеточного последующего анализа или массового анализа клеток после сортировки FACS. Явное преимущество перед очисткой с градиентом плотности заключается в том, что содержание клеточных липидов практически не влияет на эффективный выход гепатоцитов. Таким образом, фракция стеатотических гепатоцитов будет сохранена и включена в последующие анализы. Это не только важно для изучения ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<сильный>Реагенты
Alexa Fluor 488 Zombie green	BioLegend	423111	аминоспособный краситель жизнеспособности
Attane Isoflurane ad us. vet. 99,9%	Provet AG	QN01AB06	ВНИМАНИЕ: требуется вентиляция
ЭДТА раствор	Sigma-Aldrich	E8008-100ML-этанол
	Sigma-Aldrich	V001229	Разведите с водой до 70%
Фетальная бычья сыворотка (FCS)	Gibco		A5256701-Hanks
' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, феноловый красный	Sigma-Aldrich	H9269-6x600ML	Для пищеварения/консервации
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), без Ca2+, без Mg2+, без фенола красного	Sigma-Aldrich	H6648-6x500ML	Для перфузионного буфера
раствор HEPES, 1 М	Sigma-Aldrich	83264-100ML-F-Гистакриловый
тканевый клей (бутил-2-цианоакрилат)	B. Braun	1050052	Для стабилизации места канюляции
Hoechst 33258 Раствор красителя	Abcam	ab228550	-
Liberase Research Grade	Roche	5401119001	Лиофилизированные коллагеназы I/II
NaCl 0,9% 500 мл Ecotainer	B. Braun	123-Paralube
Vet Omazment	Dechra	17033-211-38-Phosphate
Buffered Salt (PBS)	Gibco	A1286301-Sudan
IV – Окрашивание липидов	Sigma-Aldrich		V001423-темгезик
(Бупренорфина гидрохлорид), раствор для инъекций 0,3 мг/мл	Indivior Europe Ltd.	345928	Наркотики. Храните в надежном месте.
Трипановый синий, 0,4%, стерильно-фильтрованный	Sigma-Aldrich	T8154	Для подсчета клеток
Вильямса Medium E	Sigma-Aldrich	W4128-500ML-
Materials
25 мл серологическая пипетка, Greiner Cellstar	Merck	P7865-50
мл Falcon пробирки	TPP	-	-
BD Neoflon, Pro IV катетер 26 г	BD Falcon		391349-Cell
скребок, вращающееся лезвие шириной 25 мм	TPP	99004-Falcon
Cell Сетчатый фильтр 100 & микро; m Нейлон	BD Falcon	352360-Фенестрированная
стерильная хирургическая простыня		-	Многоразовый тканевый материал
Наполнительная насадка для трубки размера 16# (ID 3,1 мм)	Drifton	FILLINGNOZZLE#16	Для ввода в трубки
проточные цитометрические трубки, 5 мл	BD Falcon	352008-Male
Luer to Barb, Трубка ID 3,2 мм	Drifton	LM41	Соединительная трубка к шприцу
чашки Петри, 96 x 21 мм	TPP	93100-Prolene
5-0	Ethicon	8614H	Для втягивания грудины
Prolene 6-0	Ethicon	8695H	Для кожного шва
Prolene 8-0	Ethicon	EH7470E	Лигатура для желчного пузыря
Трубка 16#, WT 1,6 мм, внутренний диаметр 3,2 мм, наружный диаметр 6,4 мм	Drifton	SC0374T	перфузионная трубка
Equipment
BD LSRFortessa Анализатор клеток Проточный цитометр	BD	-	-
Isis Бритва для грызунов	Aesculap	GT421-Isofluran
station	Provet	-	-
Низкоскоростная центрифуга – Scanspeed 416	Labogene	-	-
Улучшенная счетная камера Neubauer	Marienfeld	-	-
Концентратор кислорода – EverFlo	Philips	1020007	0 – 5 л/мин
Pipetboy – Пипетка Turbo-Fix	TPP	94700-Shenchen
перфузионный насос – YZ1515x	Shenchen	YZ1515x-Хирургический
микроскоп – SZX9	Olympus	-	-
ThermoLux согревающий коврик	Thermo Lux		-
Vortex Genie 2, 2700 UpM	NeoLab	7-0092-Водяная
баня – Прецизионный GP 02	Thermo	scientific-Adjust	на 42 ° С