Липидные гепатоциты присущи регенерации печени, но обычно теряются при центрифугировании с градиентом плотности. Здесь мы представляем оптимизированный протокол выделения клеток, который сохраняет стеатотические гепатоциты, давая репрезентативные популяции регенерирующих гепатоцитов после частичной гепатэктомии у мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение регенерирующих гепатоцитов после частичной гепатэктомии у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Частичная гепатэктомия широко используется для исследования регенерации печени у мышей, но выделение высоких выходов жизнеспособных гепатоцитов для последующих одноклеточных применений является сложной задачей. Заметное накопление липидов в регенерирующих гепатоцитах наблюдается в течение первых 2 дней нормальной регенерации печени у мышей. Этот так называемый преходящий стеатоз, связанный с регенерацией (TRAS), является временным, но частично перекрывает основную пролиферативную фазу. Очистка с градиентом плотности является основой большинства существующих протоколов выделения первичных гепатоцитов. Поскольку градиентная очистка зависит от плотности и размера клеток, она отделяет нестеатотические популяции гепатоцитов от стеатоза. Поэтому жировые гепатоциты часто теряются, образуя нерепрезентативные фракции гепатоцитов.
Представленный протокол описывает простой и надежный метод выделения in vivo регенерирующих гепатоцитов независимо от содержания в них липидов. Гепатоциты самцов мышей C57BL/6 выделяют через 24-48 ч после гепатэктомии классическим двухэтапным подходом к перфузии коллагеназы. Стандартный перистальтический насос нагнетает нагретые растворы через катетеризированную нижнюю полую вену в остаток, используя метод ретроградной перфузии с оттоком через воротную вену. Гепатоциты диссоциируют коллагеназой для их высвобождения из капсулы Глиссона. После промывки и тщательного центрифугирования гепатоциты можно использовать для любых последующих анализов. В заключение, в этой статье описывается простой и воспроизводимый метод выделения репрезентативной популяции регенерирующих гепатоцитов после частичной гепатэктомии у мышей. Метод также может помочь в изучении жировой болезни печени.
Введение
Печень может регенерировать себя даже после значительной потери ткани. Эта уникальная регенеративная способность наглядно иллюстрируется экспериментальной моделью частичной (70%) гепатэктомии, впервые описанной на крысах Хиггинсом и Андерсоном в 1931 году1. В этой модели 70% печени удаляется хирургическим путем у животных путем отсечения более крупных долей печени. Затем оставшиеся доли растут за счет компенсаторной гипертрофии, чтобы восстановить первоначальную массу печени в течение примерно 1 недели после операции, хотя и без восстановления исходной архитектуры печени 2,3. Были разра....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Федеральными правилами Швейцарии по животным и одобрены Ветеринарным управлением Цюриха (No 007/2017, 156/2019), обеспечивая заботу о человеке. Самцов мышей C57BL/6 в возрасте 10-12 недель держали в 12-часовом дневном цикле со свободным доступом к пище и воде. Каждая экспериментальная группа состояла из шести-восьми животных. Подробную информацию обо всех материалах, оборудовании и реагентах, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .
1. Частичная гепатэктомия у мышей
- При стандартной гепатэктомии (70%) перевязывают и резециру....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
TRAS достигает пика через 16 ч после гепатэктомии и постепенно исчезает через 32-48 ч после стандартной гепатэктомии, но сохраняется более 48 ч после расширенной гепатэктомии. Макроскопически TRAS хорошо виден в виде бледного цвета лица остатка печени (рис. 1F) и может наблюдаться у мышей, подвергшихся гепатэктомии, между 16 и 48 часами после операции.
Предполагаемый конечный выход составляет 10-15 × 10 6 гепатоцитов после 70%-гепатэктомии и 4-9 ×10,6 п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Опубликованный протокол обеспечивает надежный и простой метод выделения высокого выхода нормальных и стеатотических мышиных гепатоцитов для одноклеточного последующего анализа или массового анализа клеток после сортировки FACS. Явное преимущество перед очисткой с градиентом плотности заключается в том, что содержание клеточных липидов практически не влияет на эффективный выход гепатоцитов. Таким образом, фракция стеатотических гепатоцитов будет сохранена и включена в последующие анализы. Это не только важно для изучения .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано Швейцарским национальным фондом (грант проекта 310030_189262).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильный>Реагенты | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | аминоспособный краситель жизнеспособности |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99,9% | Provet AG | QN01AB06 | ВНИМАНИЕ: требуется вентиляция |
| ЭДТА раствор | Sigma-Aldrich | E8008-100ML-этанол | |
| Sigma-Aldrich | V001229 | Разведите с водой до 70% | |
| Фетальная бычья сыворотка (FCS) | Gibco | A5256701-Hanks | |
| ' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, феноловый красный | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | Для пищеварения/консервации |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), без Ca2+, без Mg2+, без фенола красного | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | Для перфузионного буфера |
| раствор HEPES, 1 М | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F-Гистакриловый | |
| тканевый клей (бутил-2-цианоакрилат) | B. Braun | 1050052 | Для стабилизации места канюляции |
| Hoechst 33258 Раствор красителя | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Лиофилизированные коллагеназы I/II |
| NaCl 0,9% 500 мл Ecotainer | B. Braun | 123-Paralube | |
| Vet Omazment | Dechra | 17033-211-38-Phosphate | |
| Buffered Salt (PBS) | Gibco | A1286301-Sudan | |
| IV – Окрашивание липидов | Sigma-Aldrich | V001423-темгезик | |
| (Бупренорфина гидрохлорид), раствор для инъекций 0,3 мг/мл | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Наркотики. Храните в надежном месте. |
| Трипановый синий, 0,4%, стерильно-фильтрованный | Sigma-Aldrich | T8154 | Для подсчета клеток |
| Вильямса Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML- | |
| Materials | |||
| 25 мл серологическая пипетка, Greiner Cellstar | Merck | P7865-50 | |
| мл Falcon пробирки | TPP | - | - |
| BD Neoflon, Pro IV катетер 26 г | BD Falcon | 391349-Cell | |
| скребок, вращающееся лезвие шириной 25 мм | TPP | 99004-Falcon | |
| Cell Сетчатый фильтр 100 & микро; m Нейлон | BD Falcon | 352360-Фенестрированная | |
| стерильная хирургическая простыня | - | Многоразовый тканевый материал | |
| Наполнительная насадка для трубки размера 16# (ID 3,1 мм) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | Для ввода в трубки |
| проточные цитометрические трубки, 5 мл | BD Falcon | 352008-Male | |
| Luer to Barb, Трубка ID 3,2 мм | Drifton | LM41 | Соединительная трубка к шприцу |
| чашки Петри, 96 x 21 мм | TPP | 93100-Prolene | |
| 5-0 | Ethicon | 8614H | Для втягивания грудины |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | Для кожного шва |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Лигатура для желчного пузыря |
| Трубка 16#, WT 1,6 мм, внутренний диаметр 3,2 мм, наружный диаметр 6,4 мм | Drifton | SC0374T | перфузионная трубка |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Анализатор клеток Проточный цитометр | BD | - | - |
| Isis Бритва для грызунов | Aesculap | GT421-Isofluran | |
| station | Provet | - | - |
| Низкоскоростная центрифуга – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| Улучшенная счетная камера Neubauer | Marienfeld | - | - |
| Концентратор кислорода – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 л/мин |
| Pipetboy – Пипетка Turbo-Fix | TPP | 94700-Shenchen | |
| перфузионный насос – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x-Хирургический | |
| микроскоп – SZX9 | Olympus | - | - |
| ThermoLux согревающий коврик | Thermo Lux | - | |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092-Водяная | |
| баня – Прецизионный GP 02 | Thermo | scientific-Adjust | на 42 ° С |
Ссылки
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
