Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Клеточная культура IDG-SW3 в трехмерном внеклеточном матриксе

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64507

⸱

13 ноября 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Shanghai Key Laboratory for Prevention and Treatment of Bone and Joint Diseases, Shanghai Institute of Traumatology and Orthopaedics, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол культивирования клеток IDG-SW3 в трехмерном (3D) внеклеточном матриксе.

Аннотация

Остеоциты считаются непролиферативными клетками, которые терминально дифференцируются от остеобластов. Остеобласты, встроенные в костный внеклеточный матрикс (остеоид), экспрессируют ген Pdpn с образованием клеточных дендритов и превращением в преостеоциты. Позже преостеоциты экспрессируют ген Dmp1 , способствуя минерализации матрикса и, таким образом, превращаясь в зрелые остеоциты. Этот процесс называется остеоцитогенезом. IDG-SW3 — хорошо известная клеточная линия для исследований остеоцитогенеза in vitro . Во многих предыдущих методах коллаген I использовался в качестве основного или единственного компонента культивируемого матрикса. Однако, помимо коллагена I, остеоид также содержит основное вещество, которое является важным компонентом, способствующим клеточному росту, адгезии и миграции. Кроме того, матричное вещество прозрачно, что повышает прозрачность коллагенового геля I-образного типа и, таким образом, помогает исследовать образование дендритов с помощью методов визуализации. Таким образом, в данной работе подробно описан протокол создания 3D-геля с использованием внеклеточного матрикса вместе с коллагеном I для выживания IDG-SW3. В данной работе были проанализированы дендритообразование и экспрессия генов в процессе остеоцитогенеза. Через 7 дней остеогенного культивирования под флуоресцентным конфокальным микроскопом отчетливо наблюдалась обширная дендритная сеть. ПЦР в реальном времени показала, что уровни мРНК Pdpn и Dmp1 непрерывно повышались в течение 3 недель. На 4-й неделе стереомикроскоп показал непрозрачный гель, заполненный минеральными частицами, что соответствовало рентгенофлуоресцентному анализу (XRF). Эти результаты свидетельствуют о том, что данный культуральный матрикс успешно способствует переходу от остеобластов к зрелым остеоцитам.

Введение

Остеоциты представляют собой терминально дифференцированные клетки, полученные из остеобластов 1,2. После того, как остеобласт погребен остеоидом, он подвергается остеоцитогенезу и экспрессирует ген Pdpn для образования преостеоцитов, ген Dmp1 для минерализации остеоида и гены Sost и Fgf23 для функционирования в качестве зрелого остеоцита в костной ткани3. Здесь используется система 3D-культивирования для выявления удлинения дендритов и экспрессии генов-маркеров в процессе остеоцитогенеза.

Клетки IDG-SW3 представляют собой иммортализированную первичную клеточную линию, полученную от трансгенных мышей, и могут расширяться или реплицировать остеобласт до поздней дифференцировки остеоцитов при культивировании в различных средах4. По сравнению с MLO-A5, MLO-Y4 и другими клеточными линиями, профиль экспрессии функциональных белков, способность выполнять отложение солей кальция и реакция на различные гормоны в клетках IDG-SW3 с большей вероятностью будут такими же, как у первичных остеоцитов в костной ткани4.

По сравнению с 2D-системами, 3D-системы культивирования более способны имитировать среду клеточного роста in vivo, включая градиент питательных веществ, низкую механическую жесткость и окружающий механический диапазон (Таблица 1). Большинство предыдущих методов культивирования остеобластических клеток в 3D-системе использовали коллаген I в качестве уникального компонента в рецептурах 4,5,6, поскольку волокна коллагена I служат местом отложения кальция и фосфора. Тем не менее, незаменимый компонент остеоида, внеклеточный матрикс, содержит большую группу клеточных факторов, которые способствуют клеточному росту, адгезии и миграции 7,8 и является прозрачным и удобным для визуализирующего наблюдения. Таким образом, в этом протоколе используется Matrigel (далее именуемый матрицей базальной мембраны) в качестве вторичного компонента для исследования остеоцитогенеза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол подходит для культивирования клеток в четырех лунках 24-луночных планшетов. При подготовке нескольких образцов или планшетов количество реагентов должно быть соответственно увеличено.

1. Приготовление коллагеновой смеси I

ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген I и матриксный гель базальной мембраны быстро схватываются при комнатной температуре. Поэтому с коллагеном следует обращаться со льдом (от 2 °C до 8 °C). Все используемые наконечники и трубки должны быть предварительно охлаждены, если не указано иное. Все процедуры следует выполнять в защитном кожухе.

  1. Поместите все реагенты и центрифужные пробирки на лед.
  2. Медленно закапывают пипеткой 0,48 мл коллагена I (5 мг/мл) и 0,1 мл 10-кратного минимума эссенциальной среды (МЭМ) (с фенольным красным) в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл, хранящуюся на льду. Хорошо перемешайте, осторожно пипетируя вверх и вниз.
  3. В соответствии с цветовой палитрой индикатора фенолового красного используйте соответствующий объем 7,5% (w/v) NaHCO3 (примерно 0,2 мл), чтобы настроить индикатор фенолового красного на оранжевый, что указывает на то, что значение pH находится в диапазоне 7,0-7,4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от рН среды используется объем NaHCO3 для доведения рН примерно до 7,0-7,4. Кроме того, NaOH используется для нейтрализации pH.
  4. Доведите окончательный объем смеси до 1 мл, добавив соответствующий объем ddH2O. Хорошо перемешайте, осторожно пипетируя пипеткой вверх и вниз, чтобы подготовиться к использованию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный объем ddH2O будет зависеть от количества NaHCO 3 или NaOH, использованного на этапе1.3 .

2. Приготовление клеточно-матричной смеси

  1. Медленно выпипетка 0,9 мл матрицы базальной мембраны в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл на льду.
  2. Культивирование клеток IDG-SW3 в колбе T25 с 4 мл полной среды (альфа-МЭМ, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки [FBS]) с добавлением 50 ЕД/мл INF-γ при 33 °C.
  3. Как только клетки IDG-SW3 достигнут 90% слияния, удалите среду и промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS, pH 7,4 по всему протоколу) с помощью пипетки. Расщепляют клетки 0,5 мл 0,25% трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при 37 °C в течение 30 с.
  4. Инактивируйте трипсин, добавив 3,5 мл полной среды (альфа-МЭМ, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки [FBS]). Перелейте клеточную суспензию объемом 4 мл в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
  5. Отжим клеточную суспензию при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл полной среды на льду.
  6. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и отрегулируйте конечную плотность клеток с полной средой до 4 × 105 клеток/мл. Добавьте 0,1 мл приготовленной клеточной суспензии к 0,9 мл внеклеточного матрикса с шага 2.1. Хорошо перемешайте, осторожно пипетируя вверх и вниз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходим бесклеточный контроль, добавьте 0,1 мл полной среды к 0,9 мл внеклеточного матрикса в качестве отрицательного контроля.

3. Нанесение клеточно-гелевой смеси

  1. Аккуратно хорошо перемешайте две смеси из шагов 2,6 и 1,4 до 2 мл, пипетируя вверх и вниз по льду. Пипетку по 0,5 мл готовой смеси в каждую лунку (четыре лунки 24-луночного планшета). Инкубируют при 37 °C в течение 1 ч до образования клеточно-гелевой смеси.
  2. Добавьте 0,5 мл остеогенной среды (полная среда, содержащая 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 4 мМ β-глицерофосфата, также известного как остеогенная индукционная среда)4 в клеточно-гелевую смесь в каждой лунке, чтобы начать остеогенную дифференцировку при 37 °C. Считайте, что это День 0.
  3. Каждые 2 дня заменяйте половину среды свежей остеогенной средой при температуре 37 °C. Продолжайте культивирование в течение 35 дней.

4. Определение жизнеспособности клеток и клеточных дендритов с помощью конфокального микроскопа

  1. Окрашивание клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ацетиметиловый эфир кальцеина (кальцеин AM) - это краситель, который можно использовать для определения жизнеспособности клеток. Ethidium homodimer-I (EthD-1) не проникает через мембрану интактных/жизнеспособных клеток9. Таким образом, кальцеин AM/EthD-1 может быть использован для определения жизнеспособности клеток и клеточных дендритов.
    1. На 1-й и 7-й день культивирования извлеките из морозильной камеры исходный раствор кальцеина AM (4 мМ в ДМСО) и исходный раствор EthD-1 (2 мМ в ДМСО/Ч2O 1:4 [v/v]) и дайте им нагреться до комнатной температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минерализованный матрикс имеет сильный сигнал автофлуоресценции, поэтому стадия преостеоцитов без экспрессии Dmp1 в течение 7 дней после культивирования4 больше подходит для наблюдения за окрашиванием клеток.
    2. Добавьте 4 мкл 2 мМ исходного раствора EthD-1 и 5 мкл 4 мМ кальцеинового раствора AM к 2 мл фосфатно-солевого буфера Dulbecco (D-PBS) и хорошо перемешайте. Это дает приблизительно 2 мкМ кальцеина AM и 4 мкМ EthD-1 в качестве рабочих растворов.
    3. Пипетку 0,5 мл рабочего раствора в лунки в 24-луночном планшете. Инкубировать 30-45 мин при комнатной температуре для окрашивания клеточно-гелевого матрикса.
    4. После инкубации добавьте примерно 0,5 мл свежего D-PBS в новую чашку для культур со стеклянным дном диаметром 35 мм. Накройте посуду крышкой, чтобы предотвратить загрязнение или высыхание образцов.
    5. С помощью щипцов с локтевым наконечником осторожно перенесите окрашенный клеточно-гелевый матрикс с шага 4.1.3 в 35-миллиметровую культуральную чашку с шага 4.1.4. Избегайте повреждения или сдвига клеточно-гелевой матрицы.
    6. Просмотр меченых клеток под лазерным конфокальным флуоресцентным микроскопом.
  2. Набор для сканирования микроскопа
    1. Поставьте блюдо диаметром 35 мм на сцену. Выберите области клеточно-гелевой матрицы для сканирования через окуляр с помощью 10-кратного объектива. Объективы с большим увеличением не рекомендуются из-за размера удлиненных дендритов.
    2. Выберите оптические фильтры. Кальцеин можно рассматривать как зеленый с помощью стандартного полосового фильтра флуоресцеина, а EthD-1 можно рассматривать как красный с фильтрами для йодида пропидия или красителя Texas Red. Выберите «линейный режим» для сканирования и установите «точечное отверстие» на 2 мкм.
    3. Выберите глубину данных 8 бит и разрешение изображения 1 024 x 1 024 пикселя.
    4. Изображение с помощью последовательного линейного сканирования с оптимальными настройками лазера и детектора (сохраняйте минимальную энергию лазера, чтобы избежать потенциального фотообесцвечивания).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная настройка детектора зависит от конечных сигналов флуоресценции.
  3. Сбор "z-стека" изображений
    1. В соответствии с сигналом зеленого канала определите верхнее и нижнее положения матрицы клетка-гель для сканирования, фокусируясь через образец при непрерывном сканировании, .
    2. После того, как верх и низ образца определены, выберите нужную рамку сканирования. Запустите сканирование. Образец будет отсканирован сверху вниз с настройками, выбранными из шага 4.2, в результате чего будет создана галерея изображений.
  4. Идентификация жизнеспособности клеток.
    1. Выберите один срез из шага 4.3. Зеленый и красный каналы обозначают живые и мертвые клетки соответственно.
  5. Идентификация клеточных дендритов.
    1. Выберите один зеленый канал для создания 3D-реконструкций с помощью программного обеспечения для получения изображений. Информация о глубине отображается в виде серии радужных псевдоцветных изображений. Дендриты, расположенные в нижней части геля, отображаются красным цветом, а те, что в верхней части, отображаются синим цветом.

5. Идентификация внешности с помощью стереомикроскопа

  1. На 1-й, 7-й, 21-й и 35-й день культивирования удалите питательную среду и дважды промойте гели в планшете с помощью D-PBS. Добавьте 0,5 мл 4% (v/v) параформальдегида в D-PBS в лунку, чтобы зафиксировать клеточно-гелевую матрицу в планшете в течение 10 мин при комнатной температуре.
  2. Удалите параформальдегид в лунку и промойте клеточно-гелевую матрицу еще два раза D-PBS в планшете. Оставьте 0,5 мл D-PBS в каждой лунке для визуализации.
  3. Поместите пластину на столик и выберите оптимальное положение через окуляр с помощью объектива 0,5x. Изобразите полнопольный вид матрицы cell-gel в пластине по отдельности с помощью «автоматической экспозиции» под светлым полем.

6. Идентификация минеральных отложений с помощью рентгенофлуоресцентного анализа

  1. На 35 день культуры проверьте, достаточно ли жидкого азота. Запустите систему РФА. Откройте комнату для образцов и перенесите гели с помощью щипцов с локтевыми концами с пластины на середину предметного столика инструмента. Перед использованием закройте помещение для образцов и подождите 30 минут, чтобы дать инструменту остыть.
  2. Установите «Время экспозиции» на 35 мс, «Диапазон спектра» на 0-40 кэВ и «Электрический ток» на 770 мкА для настройки сбора.
  3. Выберите от трех до пяти участков сканирования для анализа, перемещая предметный столик.
  4. Выберите элементы (Ca и P) для обнаружения. Запустите обнаружение и экспортируйте результаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ca и P являются наиболее распространенными элементами в гидроксиапатите.

7. Идентификация функциональной экспрессии генов

  1. На 1-й, 7-й, 21-й, 28-й и 35-й день культивирования удалите питательную среду и дважды промойте клеточно-гелевый матрикс ледяным D-PBS в планшете.
  2. Перенесите гели с помощью локтевых щипцов из планшета в пробирку объемом 2,0 мл (в зависимости от времени культивирования матрица клетка-гель постепенно уменьшится примерно до 0,1 мл на 35-й день). Убедитесь, что один гель помещен в один тюбик. Добавьте в каждую пробирку 1 мл фенол-хлороформа и две стерильные бисеринки из нержавеющей стали (4 мм, в качестве лизирующей матрицы). Поместите пробирки симметрично в отверстие для предварительно охлажденного образца механического гомогенизатора.
  3. Установите частоту взбивания 55 Гц и амплитуду 1 см в каждую 1 минуту механического взбивания с паузой 10 с, всего шесть циклов. Приступайте к взбиванию бисера.
  4. Выделите общую РНК из матрикса клетка-гель с помощью метода фенол-хлороформ-изоамилахохол. Обратная транскрибация 2 мкг общей РНК в кДНК с помощью случайных гексамерных праймеров.
  5. Разработка праймеров, нацеленных на β-актин, Pdpn, Dmp1, Sost и Fgf23 для ПЦР в реальном времени (табл. 2). β-актин — это ген домашнего хозяйства, используемый для нормализации. Гены Pdpn10 и Dmp1 11 в основном экспрессируются в преостеоцитах и минерализованных остеоцитах, тогда как Sost12 и Fgf23 13 в основном экспрессируются в зрелых остеоцитах.
  6. Поместите пробирку в амплификатор с нагретой крышкой на 105 °C и выполните амплификацию ПЦР, используя следующие настройки цикла ПЦР: 95 °C в течение 5 с и 60 °C в течение 30 с в течение 35 циклов с начальной стадией денатурации при 95 °C в течение 5 минут и заключительной стадией расширения при 60 °C в течение 30 секунд. Проанализируйте изменения сгиба с помощью метода ΔΔCt.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После окрашивания живых/мертвых клеток клетки визуализировали с помощью конфокального лазерного микроскопа. Все клетки были кальцеин-AM-положительными (зеленый цвет), а EthD-1-положительных клеток (красный цвет) в полевых условиях почти отсутствовали, что указывает на то, что гелевая система, полученная этим методом, очень пригодна для остеоцитогенеза (рис. 1А, слева). Для лучшего определения пространственного распределения клеток было выбрано псевдоцветное изображение для отображения клеточ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критическим моментом в этом протоколе является то, что шаги 1 и шаг 2 должны выполняться на льду, чтобы предотвратить спонтанную коагуляцию. В этом методе конечная концентрация коллагена I составила 1,2 мг/мл. Таким образом, оптимальный объемddH2Oдолжен быть рассчитан в соответствии с различными коллагенами от разных производителей.

In vivo остеоцитогенез включает полярное движение остеобластов от поверхности к внутренней части трабекулярной кости14....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Линду Ф. Боневальд за предоставленную клеточную линию IDG-SW3. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82070902, 82100935 и 81700778) и Шанхайским парусным проектом «Научно-технические инновации» (21YF1442000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% трипсин-этилендиаминтетрауксусная кислотаГиклонSH30042,01
15 мл пробиркиCorning, NY, США 4307917,5
% (по объему) Бикарбонат натрияSigma-Aldrich, MO, СШАS8761
аскорбиновая кислотаSigma-Aldrich, MO, СШАA4544
Collagen IThermo Fisher ScientificA10483-01 
фетальная бычья сывороткаThermo Fisher Scientific10099141
гомогенизаторBiHeng  Биотехнология, Шанхай, Китайлазерная
Карл  Zeiss, Oberkochen, ГерманияLSM 800
Набор для визуализации живых/мертвых клетокThermo Fisher ScientificR37601
матрица MatrigelCorning, Нью-Йорк, США356234
MEM (10X), без глутаминаThermo Fisher Scientific21430079
параформальдегидSigma-Aldrich, MO, США 158127
фосфатный буферный растворГиклонSH30256.
стереомикроскопCarl  Zeiss, Оберкохен, ГерманияZeiss Axio ZOOM. V16
ТризолТермо Фишер Научный15596026
рентгенофлуоресцентныйЭДАК, СШАИГЛ III
&бета;-глицерофосфатСигма-Олдрич, Миссури, СШАG9422
конфокальная флуоресцентная микроскопия SKSI ФС

Ссылки

  1. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  2. Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The osteocyte: An endocrine cell ... and more. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
  3. Bonewald, L. F. The role of the osteocyte in bone and nonbone disease. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).
  4. Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
  5. Wang, J. S., et al. Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin. Nature Communications. 12 (1), 6271(2021).
  6. Chicatun, F., et al. Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels. Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).
  7. Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).
  8. Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
  9. Papadopoulos, N. G., et al. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).
  10. Staines, K. A., et al. Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).
  11. Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
  12. Winkler, D. G., et al. Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist. EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).
  13. Riminucci, M., et al. FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting. Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).
  14. Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).
  15. Robin, M., et al. Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis. Bone. 88, 146-156 (2016).
  16. Chen, K., et al. High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

клетки IDG-SW3трехмерный матриксостеоцитогенезгель коллагена Iформирование дендритовкультивирование в экстрацеллюлярном матриксеостеогенная дифференцировкаконфокальная микроскопияПЦР в реальном времениXRF-анализ
Клеточная культура IDG-SW3 в трехмерном внеклеточном матриксе
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.