Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ пустоты в реальном времени

3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64621

⸱

10 февраля 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описывается новый метод изучения поведения мышей при мочеиспускании путем включения видеомониторинга в обычный анализ пятен пустоты. Этот подход предоставляет временную, пространственную и объемную информацию о событиях мочеиспускания и деталях поведения мышей во время светлых и темных фаз дня.

Аннотация

Нормальное мочеиспускание является результатом скоординированной функции мочевого пузыря, уретры и сфинктеров уретры под надлежащим контролем нервной системы. Чтобы изучить поведение произвольного мочеиспускания на мышиных моделях, исследователи разработали анализ пятен пустот (VSA), метод, который измеряет количество и площадь пятен мочи, нанесенных на фильтровальную бумагу, выстилающую пол клетки животного. Несмотря на то, что технически этот анализ прост и недорог, он имеет ограничения при использовании в качестве конечного анализа, включая отсутствие временного разрешения событий мочеиспускания и трудности с количественной оценкой перекрывающихся пятен мочи. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали VSA с видеомониторингом, который мы называем VSA В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ (RT-VSA), и который позволяет нам определять частоту мочеиспускания, оценивать объем мочеиспускания и характер мочеиспускания, а также проводить измерения в течение 6-часовых временных окон как в темную, так и в светлую фазы дня. Метод, описанный в этом отчете, может быть применен к широкому спектру исследований на мышах, которые изучают физиологические и нейроповеденческие аспекты произвольного мочеиспускания при состояниях здоровья и болезнях.

Введение

Хранение мочи и мочеиспускание координируются центральной схемой (центральной нервной системой), которая получает информацию о состоянии наполнения мочевого пузыря через тазовый и подчревный нервы. Уротелий, эпителий, который выстилает мочевыводящие пути от почечной лоханки до проксимального отдела уретры, образует плотный барьер для продуктов метаболизма и патогенов, присутствующих в моче. Это неотъемлемый компонент сенсорной сети, которая ощущает и сообщает о состоянии наполнения мочевого пузыря подлежащим тканям и афферентным нервам 1,2. Нарушение уротелиального барьера или изменения в путях механотрансдукции уротелия могут привести к дисфункции мочеиспускания наряду с симптомами нижних мочевыводящих путей, такими как частота, срочность, никтурия и недержание мочи 3,4,5,6,7. Точно так же известно, что старение, диабет, инфекции нижних мочевыводящих путей, интерстициальный цистит и другие болезненные процессы, которые влияют на мочевой пузырь или связанную с ним схему, контролирующую его функцию, вызывают дисфункцию мочевого пузыря 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Лучшее понимание нормального и ненормального поведения при мочеиспускании зависит от разработки методов, которые могут надежно различать различные модели мочеиспускания.

Традиционно поведение мышей при произвольном мочеиспускании изучалось с использованием анализа пятен мочеиспускания (VSA), разработанного Дежарденом и его коллегами 20 и получившего широкое распространение благодаря своей простоте, низкой стоимости и неинвазивному подходу 8,21,22,23,24. Этот анализ обычно проводится в виде конечного анализа, при котором мышь проводит определенное количество времени в клетке, выстланной фильтровальной бумагой, которая впоследствии анализируется путем подсчета количества и оценки размера пятен мочи, когда фильтровальная бумага помещается под ультрафиолетовый (УФ) свет (пятна мочи флуоресцируют в этих условиях)20. Несмотря на эти многочисленные преимущества, традиционная VSA имеет некоторые серьезные ограничения. Поскольку мыши часто мочатся в одних и тех же областях, исследователи должны ограничить продолжительность анализа относительно коротким периодом времени (≤4 часа)25. Даже когда VSA выполняется в течение более коротких периодов времени, практически невозможно устранить небольшие пустотные пятна (SVS), которые падают на большие пустоты, или отличить SVS от переноса мочи, прилипшей к хвостам или лапам. Также очень трудно различить, являются ли SVS следствием частых, но индивидуальных событий мочеиспускания (фенотип, который часто наблюдается в ответ на цистит 4,26) или из-за постмиктуриции (фенотип, связанный с обструкцией выходного отверстия мочевого пузыря 27). Кроме того, желание завершить анализ в рабочее время в сочетании с трудностями доступа к жилым помещениям при выключенном свете часто ограничивает эти анализы световым периодом 24-часового циркадного цикла. Таким образом, эти временные ограничения препятствуют оценке поведения мышей во время их активной ночной фазы, уменьшая способность анализировать конкретные гены или методы лечения, которые регулируются циркадными ритмами.

Чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений, исследователи разработали альтернативные методы оценки поведения мочеиспускания в режиме реального времени 26,28,29,30,31,32. Некоторые из этих подходов предполагают использование дорогостоящего оборудования, такого как метаболические клетки26,28,29, или использование тепловизионных камер30; Однако у них тоже есть ограничения. Например, в метаболических клетках моча имеет тенденцию прилипать к проводам сетчатого пола и к стенкам воронки, уменьшая количество собираемой и измеряемой мочи. Таким образом, может быть сложно точно собрать данные о небольших пустотах. Кроме того, метаболические клетки не предоставляют информацию о пространственном распределении событий мочеиспускания (т.е. мочеиспускания в углах по сравнению с центром камеры). Учитывая, что длинноволновое инфракрасное излучение, используемое термографическими камерами, не проникает в твердые тела, активность мочеиспускания, оцениваемая с помощью видеотермографии, должна выполняться в открытой системе, что может быть сложно с активными мышами, поскольку они могут подпрыгивать на несколько дюймов в воздухе. Другой системой является автоматизированный подход33 для удаления пятен на бумаге (aVSOP), который состоит из рулонной фильтровальной бумаги, которая с постоянной скоростью наматывается под полом клетки для мыши из проволочной сетки. Такой подход предотвращает повреждение бумаги и наложение пятен мочи, которые происходят при классическом VSA, и его реализация позволяет исследователю проводить эксперименты в течение нескольких дней. Тем не менее, он не дает исследователю точного времени событий мочеиспускания, и нет возможности изучить поведение и то, как оно коррелирует с кровянистыми выделениями. Чтобы получить эту информацию, исследователи включили видеомониторинг в анализы мочеиспускания, подход, который позволяет одновременно оценивать активность мыши и события мочеиспускания31,32. Один из подходов состоит в размещении синего светоизлучающего диода (LED) и видеокамеры с зеленым флуоресцентным белковым фильтром, установленным под экспериментальной клеткой для визуализации событий мочеиспускания, а также инфракрасного светодиода и видеокамеры над клеткой для захвата положениямыши 32. Эта установка использовалась для мониторинга поведения мочеиспускания при выполнении фотометрии волокна; Однако ярко освещенная среда этой системы требовала от исследователей лечения своих мышей мочегонным агентом для стимуляции мочеиспускания. В другом экспериментальном проекте широкоугольные камеры были размещены над и под экспериментальной клеткой для визуализации двигательной активности мыши и событий мочеиспускания соответственно. В этом случае пятна мочи, осевшие на фильтровальной бумаге, выстилающей пол клетки, были выявлены путем освещения фильтровальной бумаги ультрафиолетовыми лучами, помещенными под клетку31. Эта установка использовалась в коротких анализах, продолжительностью 4 минуты, во время световой фазы дня для изучения нейронов ствола мозга, участвующих в произвольном мочеиспускании31. О пригодности этой системы для ее использования во время темновой фазы или в течение периодов времени >4 мин не сообщалось.

В этой статье описан метод, который усиливает традиционный VSA, позволяя осуществлять долгосрочный видеомониторинг поведения мышей при мочеиспускании. Этот экономически эффективный подход предоставляет временную, пространственную и объемную информацию о событиях мочеиспускания в течение длительных периодов времени в течение светлых и темных фаз дня, а также подробности, связанные с поведением мышей 3,4,34. Предоставляется подробная информация о строительстве камер пустотирования, внедрении VSA В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ (RT-VSA) и анализе данных. RT-VSA ценен для исследователей, стремящихся понять физиологические механизмы, контролирующие функцию мочевыделительной системы, разработать фармакологические подходы к контролю мочеиспускания и определить молекулярную основу патологических процессов, влияющих на нижние мочевыводящие пути.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Уротелиальные пьезо1 /2 мыши с двойным нокаутом (Pz1/2-KO, генотип: Piezo1 fl/fl; Пьезо2 фл/фл; Upk2CRE+/-) и контроль (Pz1/2-C, генотип: Piezo1 fl/fl; Пьезо2 фл/фл; Upk2CRE-/-) были получены собственными силами из родительских штаммов, полученных в лабораториях Jax (штамм Piezo1 fl/fl # 029213; Пьезо2 fl/fl штамм # 027720; Штамм Upk2CRE+/- # 029281). В экспериментах использовались как самки (1,5–3 месяца и вес 17–20 г), так и самцы (2–4 месяца и вес 23–29 г) мышей. Для экспериментов по циститу, индуцированному циклофосфамидом, использовали самок C57Bl/6J дикого типа (3 месяца и вес ~20 г) (лаборатории Джексона, штамм #000664). Животные были размещены, а эксперименты проводились в учреждении по уходу за животными Университета Питтсбурга с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию Университета Питтсбурга. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и положениями Политики Службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и Закона о благополучии животных.

1. Сборка сепараторов для анализа пустотных пятен в реальном времени (RT-VSA)

  1. Установка RT-VSA состоит из УФ-стенда, который вмещает две УФ-лампочки и две широкоугольные камеры (нижние камеры), которые используются для записи активности мочеиспускания во время световой фазы дня. Расположите две камеры для мышей, чтобы они опирались на подставку. Прикрепите широкоугольные камеры (верхние камеры) к крышке каждой камеры мыши, используемые для записи активности мочеиспускания в темную фазу дня (рис. 1A).
  2. Сконструируйте раму УФ-подставки и камер для мыши из алюминиевых профилей с Т-образными пазами размером 1 x 1. В таблице 1 приведен список компонентов, используемых для создания двух камер мыши и УФ-подставки, а на рисунке 1B–D представлены различные виды собранных компонентов и размеров.
  3. Сконструируйте каждую камеру мыши из восьми алюминиевых профилей с Т-образными пазами, разрезанных до 10 дюймов, и четырех, разрезанных до 14,75 дюйма. Начните со сборки нижней части камеры мыши и используйте стандартные торцевые крепления (таблица 1) для сборки профилей с Т-образными пазами в соответствии с рисунком 1. Установите акрил, пропускающий ультрафиолетовое излучение, размером 38,5 см x 26,5 см, во внутреннем канале профилей, чтобы построить пол камер для мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о том, как собрать профили с Т-образными пазами со стандартными торцевыми крепежными элементами, посетите веб-страницу компании.
  4. Соорудите стены мышиной камеры с остальными профилями. Установите панели из износостойкого поликарбоната (AR) размером 38,5 см x 21,5 см и 26,5 см x 21,5 см в профили, чтобы собрать внешние стенки камеры мыши. Используйте панели AR размером 37,5 см x 23,9 см и 24,4 см x 23,9 см для создания внутренней части камеры мыши.
  5. Закрепите панели из поликарбоната AR стандартным торцевым крепежом 1/4-20 протектора. Инструкции по монтажу панелей в профилях на веб-странице см. в ПРИМЕЧАНИИ к шагу 1.3. Используйте коммерческий силиконовый герметик для герметизации стыков между внутренними панелями.
  6. Используйте два профиля с Т-образными пазами 12 дюймов и два профиля с Т-образными пазами 14,75 дюйма, чтобы собрать крышку клетки, как показано на рисунке 1B. Установите панель из поликарбоната AR размером 38,5 см x 26,5 см во внутренний канал профилей, чтобы завершить крышку.
  7. Установите 12-дюймовую опору профиля камеры перпендикулярно длинным осям верхней части сепаратора и закрепите двумя облегченными переходами внутри угловых кронштейнов (отмечен цифрой 3 на рисунке 1B). Используйте прямую плоскую пластину (отмеченную 2) в качестве опоры для крепления веб-камеры и установите ее, как показано на рисунке 1B. Прикрепите камеру к опоре с помощью крепежного винта камеры.
  8. Используйте стандартный правый узел с подъемным шарниром серии 10, чтобы прикрепить крышку к корпусу камеры мыши (отмечен 1 на рисунке 1B).
  9. Сконструируйте УФ-подставку с четырьмя профилями с Т-образными пазами, нарезанными до 40 дюймов, четырьмя профилями с Т-образными пазами, нарезанными до 32 дюймов, и четырьмя профилями с Т-образными пазами, нарезанными до 10 дюймов, в соответствии с рисунком 1C, D. Установите акриловый зеркальный лист размером 82,5 см x 26,5 см в профили, чтобы построить дно УФ-камеры.
  10. Используйте акриловый зеркальный лист размером 82,5 см x 30,5 см и 26,5 см x 30,5 см для создания стены УФ-подставки.
  11. Прикрепите плоские пластины T серии 10 с пятью отверстиями (отмеченные 2 на рисунке 1 C), плоские пластины L серии 10 с пятью отверстиями (отмеченные 3 на рисунке 1 C) и плоские пластины тройника с пятью отверстиями серии 10 (отмеченные 1 на рисунке 1C), чтобы закрепить УФ-подставку.
  12. Установите нижние камеры в профиль с Т-образными пазами, обрезанный до 32 дюймов, и прикрепите их к нижней части подставки с помощью двух облегченных переходных угловых кронштейнов, как показано на рисунке 1D. Используйте прямые плоские пластины, чтобы прикрепить веб-камеры к профилю с Т-образным пазом.
  13. Установите УФ-лампы на внутреннем, переднем и заднем профилях и прикрепите к прямым плоским пластинам, как показано на рисунке 1D.
  14. Подключите четыре веб-камеры к USB-портам компьютера, на котором запущено программное обеспечение для видеонаблюдения.

2. Содержание животных перед экспериментом

  1. Размещайте экспериментальных мышей, специально выведенных или полученных с внешнего участка, группами по четыре человека. Когда это возможно, используйте для этих экспериментов мышей соответствующего возраста или самцов мышей. Если животные получены из внешнего источника, дайте им акклиматизироваться не менее 7 дней, прежде чем проводить какие-либо экспериментальные процедуры.
  2. На протяжении всего времени пребывания на животноводческом объекте размещайте животных в стандартных клетках, содержащих подстилку и обогащение (например, пластиковое иглу, колесо, лист бумаги для измельчения), и держите их в течение 12 часов дневно-ночной цикл с доступом к воде и сухому мышиному корму ad libitum.

3. Записи RT-VSA в светлую и темную фазы дня

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол описывает использование RT-VSA для оценки поведения мышей при мочеиспускании в светлую и темную фазы дня. Животные содержатся в 12-часовом светлом и 12-часовом темном цикле с временем Цайтгебера (ZT) = 0 в 07:00 утра. Запись начинается с 10:30 до 11:00 (ZT = 3,5–4,0) для экспериментов со светлой фазой и с 18:00 до 18:30 (ZT = 11,0–11,5) для экспериментов в темной фазе. Когда животные тестируются в обоих условиях, эксперименты обычно проводятся в два отдельных дня, по крайней мере, 5 последовательных дней между светлыми и темными тестами. Эксперименты не следует проводить в дни, когда комнаты для животных убираются или клетки меняются, так как это может привести к стрессам, влияющим на поведение при мочеиспускании. Все действия должны выполняться в условиях минимального стресса для мышей.

  1. Транспортируйте подопытных животных из места их содержания в процедурный кабинет, где расположены регистрирующие камеры RT-VSA.
  2. Подготовка записывающей камеры RT-VSA
    1. Поместите лист фильтровальной бумаги (24,3 см x 36,3 см) в нижнюю часть каждой записывающей клетки RT-VSA. В зависимости от времени суток используйте тонкую (эксперименты со светлой фазой) или толстую (эксперименты с темной фазой) фильтровальную бумагу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотная фильтровальная бумага используется во время активной темновой фазы, так как она более устойчива к измельчению, чем тонкая фильтровальная бумага. Верхние камеры используются для визуализации пятен мочи, оседающих на плотной фильтровальной бумаге во время темной фазы. Напротив, во время фазы освещения используются нижние камеры, потому что окружающий свет не позволяет верхним камерам обнаруживать пятна мочи, осевшие на фильтровальной бумаге. В этом случае используется тонкая фильтровальная бумага. Мы обнаружили, что нижние камеры неэффективны при обнаружении небольших случаев мочеиспускания, нанесенных на плотную фильтровальную бумагу.
    2. Поверх фильтровальной бумаги поместите следующие предметы: пластиковое иглу (которое обеспечивает спальное место), стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для обогащения и пластиковую тарелку размером 60 мм x 15 мм, содержащую два или три кусочка мышиного сухого корма и 14–16 г воды в виде гель-пакета (несмачивающийся водный гель; Рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл для обогащения было специфическим для корпуса, используемого в этом исследовании.
    3. Как только записывающие камеры будут готовы, аккуратно поместите экспериментальных мышей внутрь, мягко положив их на фильтровальную бумагу. Убедитесь, что перемещение животных из клетки для содержания в клетки для записи происходит с минимальным стрессом.
    4. Как только все подопытные животные окажутся внутри своих записывающих клеток с закрытыми крышками, накройте верхнюю часть крышек абсорбирующей синеспинкой, чтобы свести к минимуму прямые отражения окружающего света на поверхности крышки из плексигласа.
    5. Включите ультрафиолетовую подсветку в нижней камере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Животные не имеют прямого контакта с ультрафиолетовым светом. Рекомендуемый ультрафиолетовый свет подробно описан в разделе материалов.
  3. Записи RT-VSA
    1. Для записи видео с верхней и нижней камер используйте программное обеспечение для записи видеонаблюдения, которое можно настроить на запись с нескольких веб-камер или сетевых камер одновременно.
    2. Открыв программу, инициируйте запись, нажав Command и R в окне программы. Выполняйте видеозаписи со скоростью 1 кадр в секунду.
    3. Сразу после начала записи выйдите из комнаты, осторожно закрыв дверь. Следите за тем, чтобы в комнате было тихо на протяжении всего эксперимента.
  4. Завершение записи RT-VSA
    1. Вернитесь в процедурный кабинет через 7 ч (эксперименты со светлой фазой) или на следующее утро (эксперименты с темной фазой).
    2. Остановите запись, нажав клавиши Command и T. Выключите ультрафиолетовое излучение.
    3. После остановки записи программа автоматически генерирует видеофайл (в формате .m4v) для каждой камеры и сохраняет его под именем камеры в ранее выбранной папке назначения. Убедитесь, что в каждой папке камеры эксперименты упорядочены по дате.
    4. Убедитесь, что в каждой папке даты или эксперимента есть один файл .m4v и все отдельные файлы .jpeg, соответствующие каждому кадру фильма.
    5. ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы .jpeg могут быть использованы для восстановления эксперимента в случае повреждения файлов фильма.
    6. Создайте на рабочем столе папку с названием и датой эксперимента и перенесите в нее все .m4v файлы. При необходимости удалите файлы .jpeg после сохранения и резервного копирования файлов фильмов.
    7. ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов со светлой фазой программное обеспечение генерирует один видеоролик на камеру, а для экспериментов с темной фазой оно генерирует два видеоролика для каждой камеры. Это связано с тем, что новый файл .m4v создается после полуночи при изменении даты.
    8. Скопируйте папку, содержащую фильмы, на флэш-накопитель для анализа на внешнем компьютере. Этот шаг может занять несколько минут и может выполняться параллельно с шагами 3.5.1–3.5.3.
  5. Очистка клеток для регистрации и перевод подопытных мышей обратно в место их содержания
    1. Снимите синюю подушку, закрывающую крышки клеток. Переведите животных из клеток записи в клетку для их содержания.
    2. Извлеките аксессуары и пищевые продукты из записывающих камер (например, пластиковые иглу, пластиковые трубки, тарелку с остатками чау-чау и водяного геля, а также фильтровальную бумагу) и утилизируйте их вместе с биологически опасными отходами.
    3. Очистите клетки с помощью ручного пылесоса, удалив гранулы чау-чау и фекалий, присутствующие на дне клетки. Затем опрыскайте пол и внутренние стенки клетки 70% этанолом и очистите внутреннюю часть мягкой тканью. Оставьте крышку клеток открытой, чтобы они высохли на воздухе.
    4. Поместите клетку с животными во вторичный контейнер и перевезите животных обратно к месту их содержания.

4. Генерация калибровочных кривых

ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровочная кривая необходима для преобразования областей пустотных пятен в объемы мочи. Если вы проводите эксперименты в светлую и темную фазы дня, то следует сгенерировать две калибровочные кривые, по одной для каждого типа используемой фильтровальной бумаги (тонкая и толстая фильтровальная бумага). Калибровочные кривые формируются в двух экземплярах. Каждая реплика запускается на фильтровальной бумаге, помещенной в записывающую камеру RT-VSA. Учитывая его сложный состав и возбудимость к ультрафиолетовому излучению, используйте мочу мыши для построения калибровочных кривых.

  1. Сбор мочи мышей
    1. Возьмите кусок гибкой прозрачной пленки (10 см х 15 см) и положите его на скамейку.
    2. Возьмите мышь за хвост и почистите ее. Мягко помассируйте нижнюю часть живота, чтобы вызвать мочеиспускание. Соберите мочу на поверхности прозрачной пленки пластикового листа.
    3. Осторожно отпустите животное в клетку. С помощью пипетки перенесите мочу с поверхности прозрачной пленки в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Повторяйте процедуру с несколькими мышами до тех пор, пока не соберется ~ 10 мл мочи мыши, соберите мочу и храните при -20 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности ~ 10 мл мочи мыши требуется для создания дубликатов калибровочных кривых для светлой и темной фаз. Чтобы избежать стресса у экспериментальных мышей, не используйте мышей, которые будут подвергаться экспериментам RT-VSA для сбора мочи.
  2. Запись калибровочной кривой
    1. Разморозьте мочу, собранную на шаге 4.1, и перемешайте ее, осторожно встряхивая в течение 10–15 с.
    2. Поместите кусок тонкой фильтровальной бумаги (24,3 см x 36,3 см) в каждую из двух записывающих клеток RT-VSA.
    3. Пипеткой нанесите следующие объемы мочи (в мкл) на каждую из фильтровальных бумаг: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 и 750. Чтобы предотвратить перекрытие пятен в результате диффузии, выделяйте пятна на достаточном расстоянии друг от друга.
    4. Закройте клетки крышками и накройте их подушечками.
    5. Начните запись, нажав Command и R, применяя те же параметры программного обеспечения, которые использовались для записи экспериментов (шаг 3.3.).
    6. Зарегистрируйте калибровочную кривую в течение 1 часа, чтобы обеспечить максимальную диффузию пятен мочи. Нажмите Command и T , чтобы остановить запись.
    7. Создайте новую папку на рабочем столе, поместите в нее файлы .m4v, а затем перенесите данные на флешку для последующего анализа.
    8. Выполните аналогичную процедуру для создания повторяющихся кривых с помощью плотной фильтровальной бумаги. В этом случае добавьте дополнительные слои прокладок, чтобы затемнить внутреннюю часть и имитировать условия темной фазы.
  3. Анализ записей калибровочных кривых
    1. Откройте файлы .m4v в программном обеспечении проигрывателя фильмов, развернув окно, чтобы заполнить экран. Для анализа калибровочных кривых, выполненных на плотной фильтровальной бумаге, используйте файлы, полученные с помощью верхних камер (рис. 3A). Для анализа калибровочных кривых, выполненных на тонкой фильтровальной бумаге, используйте файлы, полученные с помощью нижних камер (рис. 3B).
    2. Воспроизведите файл .m4v, перемещая ползунок времени вперед и назад, чтобы просмотреть полный видеоролик калибровочной кривой за 1 час.
    3. Определите временной диапазон, в котором меньшие пятна мочи (<25 мкл) имеют наибольшую интенсивность и максимально распространяются. Сделайте снимок экрана в течение этого периода времени. Назовите файл скриншота и сохраните его как файл .png (рисунок 3A, верхняя панель).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скриншоты делаются нажатием клавиши F6. Чтобы настроить F6 для получения снимков экрана, выберите: «Системные настройки» > «Сочетания клавиш >» и напишите F6 в поле справа от параметра «Сохранить изображение экрана как файл ».
    4. Определите временной диапазон, в котором средние и большие пятна мочи (>50 мкл) имеют максимальную площадь, и сделайте снимок экрана. Возможно, что некоторые из меньших пятен мочи не будут видны к тому времени, когда большие пятна мочи проявят максимальную диффузию. Назовите файл и сохраните снимок экрана как файл .png (рисунок 3A, нижняя панель).
    5. Откройте программное обеспечение ImageJ (NIH), а затем перетащите значок файла .png, полученный на шаге 4.3.3, чтобы открыть файл изображения (рис. 4A).
    6. На панели инструментов выберите значок «Многоугольные выделения » и очертите границу фильтровальной бумаги.
    7. Затем выберите «Анализировать» в строке меню, выберите «Установить измерения» в развернутом меню и во всплывающем окне выберите «Площадь». Нажмите кнопку ОК. Это позволяет получить значения площади при выполнении шага 4.3.8.
    8. Затем снова выберите « Анализировать » в строке меню и выберите «Измерить » из развернутых параметров. Появится окно результатов, содержащее область столбца, в которой показаны значения области в пикселе2 (рис. 4B–D).
    9. Выберите значок «Выделено от руки » на панели инструментов и используйте его, чтобы нарисовать линию по периметру отдельного пустотного пятна. Измерьте площадь, как показано на шаге 4.3.8. Программное обеспечение обновляет таблицу результатов по мере выполнения новых измерений. Новый набор чисел появится под предыдущими. Запишите число, которое появляется под областью столбца окна результатов для каждого проанализированного пятна (рис. 4E–G).
    10. Повторите шаги с 4.3.5 по 4.3.7 для каждого из реплицируемых точек.
    11. Установите общую площадь фильтровальной бумаги равной 100% и рассчитайте процент площади (% площади) для каждого пятна мочи. Эта нормализация исправит ошибки, которые могут возникнуть из-за различий в масштабировании или расположении камер.
    12. Создайте новую таблицу XY в графической программе и вставьте значения объема мочи (в мкл) в столбец X и повторяющиеся значения % площади в столбец Y.
    13. Затем выберите «Анализ» > « Анализ > анализ XY» > «Нелинейная регрессия (подгонка кривой)». В появившемся окне параметров выберите Модель > Полином > Полином второго порядка (квадратный).
    14. Затем на вкладке метода щелкните, чтобы отметить следующие варианты: « Регрессия наименьших квадратов», « Без взвешивания» и «Рассматривать каждое реплицируемое значение Y как отдельную точку».
    15. На вкладке "Ограничение" выберите " B0", "Тип ограничения" > "Константа, равная" и введите 0 в столбце "Значение ". Нажмите кнопку ОК.

5. Анализ записей экспериментальных мышей

  1. Откройте видеофайл, собранный во время светлой фазы (нижняя камера) или темной фазы (верхняя камера), для анализа.
  2. Оцените качество видеофайла, перемещая прокрутку времени вперед и назад, подтверждая, что фильтровальная бумага остается неповрежденной (без разрывов и пережевывания) в течение 6-часового временного окна, подлежащего анализу. Если бумага порвана, не проводите дальнейший анализ, так как мышь могла помочиться на открытый пластик, который не поддается количественной оценке (рис. 5).
  3. Чтобы проанализировать эксперименты, собранные в светлой или темной фазах, используйте команду перемотки вперед или ползунок временной шкалы, чтобы перейти к нужному временному окну. Активность мочеиспускания во время световой фазы регистрируется между 11:00 и 17:00 (ZT = 4,0–10,0) и во время темной фазы с полуночи до 06:00 утра (ZT = 17,0–23,0).
  4. Воспроизведите фильм в ускоренном режиме перемотки вперед, щелкнув значок >> (или вручную прокрутив фильм) в поисках доказательств того, что мышь опорожняется. Самый простой способ определить, что это происходит, — поискать внезапное появление ярких пятен мочи на фильтровальной бумаге. Другим индикатором является поиск поведенческих изменений, включая движение к углам клетки и короткий период бездействия, когда мышь опорожняется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По мере того, как человек становится лучше обнаруживать пустоты, он может увеличить скорость прокрутки или быстрой перемотки вперед. Однако у мышей с бактериальным и химически индуцированным циститом, которые имеют очень большое количество маленьких пустот 4,34, можно пропустить события мочеиспускания, если слишком быстро перемещаться по фильму.
  5. Зарегистрируйте время, в которое возникает каждая пустота. Как правило, время пустоты регистрируется при первых признаках обнаружения мочи (рис. 6A, B).
  6. Чтобы измерить пустоту, сначала используйте полосу прокрутки, чтобы переместиться вперед (или назад) во времени, ища момент времени, когда произошла максимальная диффузия пятна мочи. На этом этапе поставьте фильм на паузу и сделайте снимок экрана, как описано в шаге 4.3.3. Поместите стрелку компьютерной мыши в анализируемое место так, чтобы на снимке экрана было отмечено интересующее место (рис. 6C, D).
  7. Назовите файл снимка экрана, используя корреляционные числа, чтобы учесть порядок появления в фильме.
  8. Продолжайте анализировать файл, повторяя шаги 5.5 и 5.7 для каждого пустого места в фильме. После того, как все пустоты будут проанализированы, измерьте общую площадь фильтровальной бумаги, сделав снимок экрана и используя шаги, описанные в 4.3.6.
  9. Рассчитайте % площади каждого из пятен мочи, как описано в шаге 4.3.9. Преобразуйте значения % площади в объем мочи (мкл) для каждого пустотного пятна, используя калибровочные кривые, сгенерированные на шаге 4, и функцию интерполяции в графическом программном обеспечении.
    1. В программном обеспечении для построения графиков откройте таблицу XY, содержащую данные калибровочной кривой, и вставьте значения площади % в столбец Y под последним значением калибровочной кривой (рис. 7A).
    2. Перейдите на вкладку «Таблица результатов» и на вкладке «Модель» щелкните, чтобы выбрать «Интерполировать неизвестные» из стандартной кривой, и нажмите «ОК». Вкладка с именем Интерполированные средние значения X отображается рядом с вкладкой таблицы результатов. Эта вкладка содержит таблицу с интерполированными значениями, которые соответствуют объему мочи в мкл для каждого пустотного пятна. (рис. 7 А,Б).
  10. Повторите шаги с 5.1 по 5.9, чтобы проанализировать всех подопытных мышей.
  11. Создайте файл книги, содержащий данные, полученные на шагах с 5.5 по 5.10, используя по одной электронной таблице для каждой мыши (рис. 7C). Создайте один файл для экспериментов со светлой фазой, а другой — для экспериментов с темной фазой. Эти основные файлы содержат все необработанные данные и необходимые расчеты, используемые при дальнейшем анализе.

6. Анализ характера мочеиспускания подопытных мышей

  1. Сгенерируйте первичные и вторичные профили пустотных пятен (рис. 8, A, B и рис. 9).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно исследованиям частотного распределения 23, пустотные пятна размером ≥20 мкл обычно составляют >95% от общего объема пустот и считаются первичными пустотными пятнами (PVS)8,23,35. Пустотные пятна размером ≤20 мкл считаются вторичными или небольшими пустотными пятнами (SVS). Было показано, что различение между PVS и SVS является полезным подходом для характеристики фенотипов мочеиспускания. Повышенное количество SVS указывает на дисфункцию мочеиспускания35.
    1. Из основного файла, содержащего интересующие данные о пятнах мочеиспускания (светлая фаза или темная фаза), классифицируйте пятна в зависимости от их объема как PVS, когда их объем составляет ≥20 мкл, или SVS, когда их объем составляет <20 мкл.
    2. Подсчитайте число и вычислите средний пустой объем и общий объем для PVS. Подсчитайте количество и рассчитайте общий объем для SVS.
    3. Сгенерируйте гистограмму, которая сравнивает контроль с обработанными мышами для каждого из вычисляемых параметров: количество PVS, пустой объем PVS, общий объем PVS, количество SVS, общий объем SVS.
  2. Необязательно: Сгенерируйте график кумулятивного пустотного объема (функция лестницы), чтобы показать поведение пустот с течением времени (рис. 10 и рис . 11).
    1. Откройте главный файл книги и преобразуйте время аннулирования, выраженное в часах, минутах и секундах, в десятичную форму. Рассчитайте кумулятивный объем мочи (в мкл) для каждого момента времени.
    2. Создайте таблицу XY в графическом программном обеспечении со временем в десятичной форме в столбце X и совокупными объемами мочи в столбце Y. Скопируйте данные о времени и объеме мочи в таблицу. Сложите точки данных (0; 0) и (6; максимальное значение). Эти точки необходимы для завершения горизонтальных линий графика в начале эксперимента (время: 0 ч), когда объем опорожнения равен нулю (0; 0), и в конце эксперимента (время: 6 ч), когда кумулятивное значение мочеиспускания равно значению, полученному для последнего события мочеиспускания (6; максимальное значение).
    3. Двойной щелчок по графику; Должно появиться окно Формат графика. Перейдите на вкладку « Внешний вид », щелкните, чтобы снять флажок « Показать символы », и щелкните, чтобы выбрать «Показать соединительную линию/кривую». Нажмите на опцию «Стиль » и выберите «Выживание».

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мочеиспускание уротелиальных мышей с нокаутом Piezo1/2

Предполагается, что во время фазы накопления цикла мочеиспускания уротелий ощущает напряжение, оказываемое мочой, накопленной в мочевом пузыре, и преобразует этот механический стимул в клеточные реакции, такие как серозное высвобождениеАТФ 1,3. Ранее мы показали, что механически активированные каналы PIEZO1 и PIEZO2 экспрессируются в уротелии

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Включение видеонаблюдения является экономически эффективной модификацией, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с классическим VSA. В классическом VSA, который обычно используется в качестве анализа конечной точки, трудно различить перекрывающиеся пустоты. Это нетривиальная проблема, так как мыши, как правило, мочатся несколько раз в одной и той же области, когда анализ длится несколько часов, как правило, в углах клетки. Таким образом, первое преимущество RT-VSA заключается в том, что исследователь может легко иден...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NIH R01DK119183 (для G.A. и M.D.C.), наградой за пилотный проект через P30DK079307 (для M.G.D.), премией Американской ассоциации урологов за развитие карьеры и грантом Фонда Уинтерса (для Нью-Мексико), а также от Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores Питтсбургского центра исследований почек (P30DK079307).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,00 дюйма Х 1,00" Профиль с Т-образными пазами - четыре открытых Т-образных прорези –   Резка до 10 дюймов80/201010Количество: 20
1.00" Х 1,00" Профиль с Т-образными пазами - четыре открытых Т-образных прорези –   отрезать до 12 дюймов80/201010Количество: 6
1.00" Х 1,00" Профиль с Т-образными пазами - четыре открытых Т-образных прорези –   Резка до 40 дюймов80/201010Количество: 4
1.00" Х 1,00" Профиль с Т-образными пазами - четыре открытых Т-образных прорези – резка до 14,75 дюймов80/201010Количество: 12
1,00 дюйма Х 1,00" Профиль с Т-образными пазами - четыре открытых Т-образных прорези – Отрезать до 32 дюймов80/201010Количество: 5
1/4-20 Двойная скользящая Т-образная гайка эконом-класса80/203280Количество: 16
1/4-20 Тройная скользящая Т-образная гайка эконом-класса80/203287Количество: 18
10 & 25 серии 2 отверстия - 18 мм Внутренний угловой кронштейн с прорезями и двойной опорой80/2014061Количество: 6
10 Серия 3 отверстия - прямая плоская пластина80/204118Количество: 8
10 серия 5 отверстий - плоская пластина "L"80/204081Количество: 8
10 серия 5 отверстий - плоская пластина "T"80/204080Количество: 8
10 серия 5 отверстий - плоская пластина тройника80/204140Количество: 2
Стандартная подъемная петля серии 10 - правый в сборе80/202064Количество: 2
Серия от 10 до 15 2 отверстия - облегченный переход Внутренний угловой кронштейн80/204509Количество: 6
УФ-ламп длиной 24 дюймаADJ Products LLCT8-F20BLB24Количество: 2< спальня / > лампочка 20 Вт – 24" Длина волны: 365 нм
Акриловый зеркальный листProfesional PlasticsКоличество: 1< бр/> 82,5 см x 26,5 см
Акриловый зеркальный листProfesional PlasticsКоличество: 2< бр/> 26,5 см x 30,5 см
Акриловый зеркальный листProfesional PlasticsКоличество: 2< бр/> 82,5 см x 30,5 см
Поликарбонат AR (устойчивость к ультрафиолетовому излучению)80/2065-2641Количество: 2<спальня/> Толщина 4,5 мм, Прозрачный, 38,5 см x 26,5 см
Поликарбонат AR (устойчивость к ультрафиолетовому излучению)80/2065-2641Количество: 4<спальня/> Толщина 4,5 мм, прозрачный, 38,5 см x 21,5 см
Поликарбонат AR (устойчивость к ультрафиолетовому излучению)80/2065-2641Количество: 4< BR/> Толщина 4,5 мм, прозрачный, 26,5 см x 21,5 см
Поликарбонат AR (устойчивость к ультрафиолетовому излучению)80/2065-2641Количество: 4<спальня/> 4,5 мм толщина, прозрачная 37,5 см x 23,9 см
Поликарбонат AR (устойчивость к ультрафиолетовому излучению)80/2065-2641Количество: 4<спальня/> 4,5 мм толщина, прозрачная, 24,4 см x 23,9 см
Хроматографическая бумага (тонкая бумага)  Thermo Fisher Scientific57144
Cosmos промокательная бумага (плотная бумага)Blick Art Materials10422-1005
ExcelMicrosoft Corporation
GraphPad PrismGraphPad Программное обеспечениеверсии 9.4.0Программное обеспечение для построения графиков и статистики
ImageJFIJI NIH
ParafilmMerckпрозрачная пленка
Quick Time Player 10.5 программное обеспечение Мультимедийный плеерApple
Безопасность шпионБен программное обеспечениедля видеонаблюдения
Стандартная торцевая застежка, 1/4-2080/203381Количество: 80
УФ передающий акрилSpartechPolycast Solacryl SUVTКоличество: 2<чел/> 38,5 см x 26,5 см 
Водный гель: HydroGelClearH2O   70-01-5022(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Веб-камераLogitechC930eКоличество: 4

Ссылки

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621(2020).
  2. de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327(2015).
  3. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
  4. Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1(2022).
  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070(2015).
  6. Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
  7. Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509(2019).
  8. Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160(2020).
  9. Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
  10. de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111(2022).
  11. Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230(2013).
  12. Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
  13. Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314(2006).
  14. Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450(2007).
  15. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1(2014).
  16. Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79(2014).
  17. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89(2014).
  18. Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26(2014).
  19. Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128(2010).
  20. Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939(1973).
  21. Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548(2008).
  22. Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
  23. Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
  24. Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31(2021).
  25. Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
  26. Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653(2001).
  27. Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
  28. Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101(2013).
  29. Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170(2019).
  30. Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449(2020).
  31. Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
  32. Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73(2016).
  33. Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
  34. Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
  35. Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
  36. Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303(2019).
  37. Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
  38. Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
  39. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
  40. Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

VSA в реальном времениповедение при мочеиспусканиимышиные моделианализ мочевых пятенпроизвольное мочеиспусканиевидеомониторингфункция мочевого пузыряуретральный сфинктерлечение циклофосфамидом
Анализ пустоты в реальном времени
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.