Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Разработка и реализация модели перфузии легких Ex vivo у крыс

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64740

⸱

26 мая 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Anesthesiology, Vanderbilt University Medical Center, 2Anesthesiology, University of Greifswald, 3Department of Physiology and Cell Biology, University of South Alabama, 4Department of Medicine, University of South Alabama, 5Center for Lung Biology, University of South Alabama, 6Anesthesiology, Tennessee Valley Healthcare System Veterans Affairs Medical Center, 7Pharmacology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Легкие ex vivo полезны для различных экспериментов по сбору физиологических данных, исключая при этом смешанные переменные экспериментов in vivo . Коммерческие организации часто стоят дорого и ограничены в типах данных, которые они могут собирать. Мы описываем метод создания полностью модульной установки, адаптируемой к различным проектам исследований.

Аннотация

Препараты легких ex vivo являются полезной моделью, которая может быть применена во многих различных областях исследований, дополняя соответствующие модели in vivo и in vitro . Лаборатории, желающие использовать изолированные легкие, должны быть осведомлены о важных шагах и присущих проблемах для создания недорогой, надежной и легко адаптированной установки в соответствии с интересующей их темой. В данной статье описывается модель вентиляции легких и перфузии легких крыс ex vivo (сделай сам) для изучения влияния лекарств и газов на тонус легочных сосудов, независимо от изменений сердечного выброса. Создание этой модели включает в себя: а) проектирование и конструирование аппарата, и б) процедуру изоляции легких. Эта модель приводит к созданию системы, которая является более экономически эффективной, чем коммерческие альтернативы, и в то же время достаточно модульной, чтобы адаптироваться к изменениям в конкретных исследовательских вопросах. Необходимо было устранить различные препятствия, чтобы обеспечить согласованную модель, которую можно было бы использовать для различных тем исследований. Однажды созданная модель доказала свою способность к адаптации к различным вопросам и может быть легко изменена для различных областей обучения.

Введение

В последнее десятилетие все чаще используются методы перфузии легких ex vivo (ЭВЛП)1 в качестве средства изучения трансплантациилегких2, ишемии/реперфузии3, метаболизма легких4 и иммунных реакций5. Изолированные, но неповрежденные, вентилируемые и перфузированные легкие обладают критически важной способностью непосредственно оценивать реакцию легких, включая легочную сосудистую систему, на потенциальные вмешательства и/или терапевтические препараты без потенциальных искажающих факторов, таких как нейрональный и гормональный ввод или изменение гемодинамики in vivo. В то же время они поддерживают физиологическое взаимодействие вентиляции и перфузии, в отличие от условий in vitro. Например, предложение, рассматривающее иммунные реакции в легких5, требует того же качества данных, что и исследование, направленное на увеличение размера пула доноров6 для трансплантации легких. EVLP можно использовать для различных видов, включая мышей3, крыс 7,8,9,10,11,12, свиней 13 и людей 2. Поэтому необходимо создать модель, которая может давать надежные данные по множеству различных экспериментальных параметров. Клиническая значимость будет получена в последующих исследованиях с использованием модели EVLP в качестве инструмента.

В то время как коммерческие установки доступны для покупки для большинства видов, они часто могут быть непомерно дорогими и ограничивать исследователей определенной маркой оборудования и проприетарного программного обеспечения. Любое отклонение от стандартной схемы (например, переход от одного вида к другому) требует предвидения и работы в обход предоставленной схемы, что может оказаться сложным или невозможным. Ниже описывается модульная и экономичная установка для изолированных легких «сделай сам» (сделай сам), а также хирургическая процедура изоляции легких.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Часть экспериментов in vivo (от общей анестезии до эвтаназии) требует предварительного одобрения соответствующего Комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC). Все описанные здесь процедуры были одобрены (протокол номер M1700168) IACUC в Медицинском центре Университета Вандербильта, Нэшвилл, штат Теннесси, и были выполнены в соответствии с рекомендациями ARRIVE. До начала экспериментов все крысы содержались в учреждении института по уходу за животными со свободным доступом к воде и пище. Включая различные исследования, выходящие за рамки данной рукописи, мы использовали в общей сложности 148 самцов крыс Sprague Dawley в возрасте 7-10 недель с весом от 250 г до 400 г.

1. Конструкция аппарата

ПРИМЕЧАНИЕ: Все детали, включая соответствующих производителей, перечислены в Таблице материалов.

  1. Чтобы удерживать каждую единицу оборудования на месте, постройте специально изготовленную решетку, чтобы обеспечить простую настройку и установку новых устройств (рис. 1). Прикрепите алюминиевые столбы (от 1 до 2 футов в длину, 1 см в диаметре, можно приобрести в любом хозяйственном магазине) друг к другу с помощью поперечных зажимов, чтобы создать 3D-решетку, и поместите на пластиковый лоток (30 дюймов x 21 дюйм), чтобы предотвратить пролитие жидкостей.
  2. Установите датчики давления на одинаковой высоте к легким и подключите их к линиям легочной артерии (ПА), легочной вены (ЛВ) и к вентиляционной трубке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти преобразователи передают данные на соответствующие биоусилители, подключенные к системе сбора данных (DAQ) и ее программному обеспечению.
  3. Вместо того, чтобы использовать имеющиеся в продаже канюли, изготовьте канюли на заказ (Рисунок 2) из сегментов жесткой пластиковой трубки шириной 2 мм, которые расширяются на конце, используя открытое пламя, чтобы обеспечить надежное наложение швов. Согните их в U-образную форму, чтобы уменьшить нагрузку на легкие во время подвешивания и поместиться в камере легких.
  4. Чтобы сделать камеру, в которой легкие должны быть проветрены и перфузированы, поместите стакан объемом 1000 мл внутрь стакана объемом 1500 мл с водяной баней между ними и внутрь стакана объемом 1000 мл, создав пароварку. Поместите эти стаканы на нагревательную пластину, установленную на 48 °C, чтобы создать влажную и устойчивую к колебаниям температуры камеру для легких.
  5. Храните буфер для эксперимента в мерной колбе объемом 150 мл, помещенной на нагревательную пластину, установленную на 37 °C. Используйте магнитную мешалку для циркуляции буфера внутри стакана. Установите мениск буфера на такой высоте, чтобы он находился на 4 см выше легкого, чтобы создать врожденное давление 4 см H2Oна PV. Во время операции следите за тем, чтобы легкие животного находились на той же высоте, что и буфер, чтобы уменьшить образование гидростатического отека.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование колбы сводит к минимуму площадь поверхности, контактирующей с воздухом помещения, что сводит к минимуму диффузию газа.
  6. Используйте роликовый насос для перемещения буфера по контуру, состоящему из нагревательного змеевика и воздушного конденсатоотводчика, перед перфузией легкого. Утилизируйте сточные воды из фотоэлектрической колбы обратно в мерную колбу. Подключите нагревательный змеевик и воздушный конденсатоотводчик к циркуляционной водяной бане, также установленной на 37 °C. Отрегулируйте температуру водяной бани в соответствии с частотой вращения насоса, чтобы перфузат имел постоянную температуру 37 °C.

2. Порядок действий

  1. Перед началом эксперимента подготовьте установку.
    1. Убедитесь, что программное обеспечение работает (см. ниже) и правильно собирает данные.
    2. Ежедневно калибруйте все датчики давления, чтобы убедиться, что они не дрейфуют.
    3. Приготовьте буфер (см. Таблицу 1 для ингредиентов физиологического раствора с 4% бычьим сывороточным альбумином [BSA]) и убедитесь, что pH находится на уровне 7,4, используя HCl для соответствующей корректировки. Настройте систему перфузии с подогретым буфером (Таблица 1), который циркулирует по всей поверхности, следя за тем, чтобы в ней не было пузырьков воздуха. Добавьте BSA не менее чем за 30 минут до начала эксперимента, чтобы дать ему достаточно времени для растворения. При отсутствии оксигенатора пузырьковый газ вводится в перфузионный буфер перед добавлением БСА с газовым составом 65%N2, 30%O2 и 5% CO2 для имитации уровней CO2 в легких in vivo. Это предотвращает пенообразование раствора после добавления BSA.
    4. Подготовьте операционную зону с помощью всех необходимых хирургических инструментов, швов и пластыря. Наклоните операционную доску под углом 15° так, чтобы крыса под наркозом могла располагаться так, чтобы ее голова была поднята над остальным телом, а трахея и блокада сердца и легких можно было легко манипулировать.
    5. Надев надлежащие средства индивидуальной защиты, взвесьте крысу и сделайте внутрибрюшинную инъекцию пентобарбитала (65 мг/кг-1). Через 10 минут ущипните палец ноги, чтобы убедиться, что операционная плоскость общей анестезии достигнута. При необходимости введите больше анестетика.
  2. Перенесите крысу в операционную зону и закрепите ее на операционной доске, обмотав ее передние лапы отдельно, а затем задние ноги вместе, убедившись, что передние ноги достаточно свободны, чтобы можно было визуализировать болевой рефлекс, если анестезия не будет достаточно глубокой (рисунок 3A).
  3. Закрепите голову крысы, заклеив рот длинной тонкой полоской за передними зубами, не ограничивая язык или поток воздуха для все еще самопроизвольно дышащей крысы (Рисунок 3B).
  4. Выполнить трахеостомию путем защемления кожи над трахеей с помощью щипцов и разрезания хирургическими ножницами. С помощью изогнутых щипцов тупо рассеките мышцу и ткани, чтобы добраться до трахеи. Убедитесь, что во время этого шага не было кровотечения.
    1. Проденьте изогнутые щипцы под трахеей и откройте их, чтобы освободить место для 3-0 швов под ними, которые затем можно предварительно завязать в коробчатый узел (Рисунок 3B). Сделайте небольшой разрез между хрящевыми кольцами трахеи и вставьте канюлю трахеи (модифицированная игла 18 G с трубкой диаметром 1 мм, приклеенная вокруг кончика для создания выемки). Завяжите шов, следя за тем, чтобы воздух не мог выйти из разреза трахеи и что канюля не создает нагрузки на трахею.
  5. Настройте аппарат ИВЛ на работу с газовой смесью 30%О2, 5%СО2 и 65%Н2 с дыхательным объемом (ВТ) 10 мл/кг, положительным давлением на конечном выдохе (ПДЭ) 0 смЧ2О и частотой 60 вдохов/мин.
  6. После того, как трахейная канюля будет закреплена швом, начните вентилировать крысу с вышеуказанными настройками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый хирургический метод был адаптирован из Nelson et al.9 и описан шаг за шагом.
  7. Снимите шерсть с живота крысы с помощью больших хирургических ножниц и щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мази для удаления волос также можно использовать до начала эксперимента.
  8. Удерживая мечевидный отросток щипцами, сделайте небольшой горизонтальный разрез ниже ребер, следя за тем, чтобы диафрагма оставалась неповрежденной. После того, как внутренние органы можно будет безопасно визуализировать, расширьте горизонтальный разрез, чтобы обнажить всю диафрагму.
  9. Соблюдая крайнюю осторожность, чтобы избежать прокола легких, введите гепарин (3000 ЕД/кг-1) в нижнюю полую вену (НПВ) с помощью шприца 22 г.
  10. Снова удерживайте мечевидный отросток щипцами и разрежьте краниально вдоль грудины, постоянно визуализируя легкие, чтобы предотвратить их разрезание.
  11. Чтобы правильно увидеть блокаду сердца и легких, раздвиньте грудную клетку с помощью двух больших щипцов и следите за тем, чтобы не сломать ребра, что может привести к проколу легкого острым фрагментом кости (Рисунок 3C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как грудная клетка будет открыта, используйте PEEP со скоростью 2-3 смH2O, установленный водяным затвором, прикрепленным к конечности выдоха аппарата искусственной вентиляции легких, чтобы избежать ателектаза.
  12. В это время разрежьте IVC, чтобы усыпить крысу путем обескровливания. Внимательно следите за тем, чтобы с момента инъекции гепарина прошла не менее 1 минуты (см. шаг 2.9), чтобы дать ему достаточно времени для циркуляции и предотвращения образования микротромбов в легких.
  13. При установке перфузионных канюль постоянно проверяйте давление, чтобы убедиться в отсутствии резких изменений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внезапный скачок давления при работе насоса с постоянной скоростью указывает на образование засора, в то время как внезапное снижение может указывать на утечку.
  14. Обрежьте избыток тимуса, чтобы облегчить визуализацию легочной сосудистой системы. Найдите PA, проденьте под него небольшие изогнутые щипцы, а снизу снова проденьте шов 3-0 и предварительно завяжите в коробчатый узел.
  15. Сделайте небольшой разрез в правом желудочке сердца и вставьте канюлю PA (изготовленную из пластиковой трубки диаметром 2 мм, расширенной на конце с помощью открытого пламени, чтобы можно было завязать швы), осторожно, чтобы избежать разрыва соседней артерии. Закрепите канюлю с помощью шва и перфузии, начиная с 1,5 мл/мин-1 (Рисунок 3D).
  16. Немедленно иссекайте верхушку сердца, чтобы избежать повышения давления в легких. С помощью небольших изогнутых щипцов разорвите митральный клапан и визуально убедитесь, что щипцы могут беспрепятственно проникать в левое предсердие.
  17. Наложите предварительно наложенный шов 3-0 вокруг сердца ниже предсердия (рисунок 3E).
  18. Вставьте PV-канюлю (аналогичную конструкции PA-канюли) в левое предсердие и убедитесь, что буфер может вытекать из него, прежде чем перевязывать шов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы канюля для ЛВ была размещена за митральным клапаном, чтобы обеспечить ее правильное перекрытие, но при этом не была размещена слишком глубоко, чтобы не повредить ПВ или не затруднить поток (Рисунок 3E). Будьте особенно осторожны при наложении швов, так как слишком слабое завязывание приводит к потере кровотока, а слишком тугое завязывание может повредить сердце, ослабить расположение канюли и потенциально вызвать утечки.
  19. Обрежьте лишнюю ткань между грудной полостью и разрезом трахеостомы с помощью ножниц с тупым концом, чтобы не повредить трахею. Убедитесь, что видна вся трахея ниже трахеальной канюли и вся блокада сердца и легких.
  20. Удалите блокаду сердца и легких, удерживая канюлю трахеи и иссекая соединительную ткань за трахеей с помощью изогнутых ножниц с тупым концом, оставляя пищевод прикрепленным для дополнительной структурной поддержки (Рисунок 3F).
  21. Постепенно увеличивайте расход до максимального расхода 40 мл/кг-1/мин-1. Дайте вытекать первым 50 мл буфера из системы, чтобы удалить любые воспалительные цитокины, которые могут быть высвобождены (рис. 3G).
  22. Осторожно переместите изолированные легкие в камеру пароварки, созданную двумя стаканами. Следите за тем, чтобы канюля PA, PV или трахеи не перекручивалась ни в коем случае во время движения легких или их подвешивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Профилактика ателектаза во время извлечения легких и подключения к установке важна, особенно когда ЭВЛП используется для уже поврежденных легких или когда планируются вмешательства до ЭВЛП. Этого можно достичь, например, с помощью небольшого зажима на трахее после вдоха перед переводом на аппарат ИВЛ15.

3. Сбор данных

  1. Для сбора данных используйте любой коммерчески доступный аналого-цифровой преобразователь и систему сбора данных.
  2. Обратите внимание, что частота дискретизации достаточна для данной цели (в данном случае 200 Гц) и что все соответствующие зависимые параметры от биоусилителей и других входных устройств собираются одновременно (давление в дыхательных путях, PA и PV-давление, выбранные для данного протокола)16.
  3. Записывайте независимые параметры (например, скорость перфузии, скорость вентиляции, состав вентилируемого газа, состав буферного электролита и массу легких).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После 10 минут стабилизации и исходных показаний мы рандомизировали первую группу из 10 самцов крыс Sprague Dawley в пять небольших групп: глобальная ишемия без потока в течение 5, 7,5, 8, 9 или 10 минут (n = 2 в группе) с последующей реперфузией; Эти ограниченные предварительные эксперименты по подбору дозы были проведены для определения максимально возможного времени ишемии, чтобы обеспечить достаточную вентиляцию и реперфузию до возможного развития резкого и необратимого повышения давления в дыхательных путях и образо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Более 100 экспериментов были успешно проведены в нашей лаборатории с использованием этой установки. Модульная конструкция этой специализированной установки обеспечила большую гибкость в отношении потенциальных изменений в экспериментальных требованиях. В то время как в других установках используется деоксигенатор18 для имитации постоянного потребления кислорода и производстваCO2 конечными органами, в этой упрощенной модели эта функция не использовалась из-за акцента на изучении влияния ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, финансового или иного.

Благодарности

Поддержка была оказана, в частности, премией Merit Review Award (101 BX003482) от Службы исследований и разработок биомедицинской лаборатории Министерства по делам ветеранов США, грантом NIH (5R01 HL123227), премией за трансформационный проект (962204) от Американской кардиологической ассоциации, а также институциональными фондами, присужденными доктору Риссу. Д-р Бальцер получил независимое финансирование от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкое научно-исследовательское общество), номер проекта BA 6287/1-1. Авторы хотели бы поблагодарить Мэтью Д. Олсена, Чун Чжоу, Чжу Ли и Ребекку С. Рисс за их ценный вклад в исследование.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,000 мл Стеклянный стаканPyrex, Чикаго, Иллинойс
1,500 мл Стеклянный стаканPyrex, Чикаго, Иллинойс
Камера соответствия воздухоуловителямRadnoti130149
БиоусилителиCWE IncBPM-832
ЗажимыFisher ScientificS02626
DAQ (сбор данных)Национальный Instruments, Остин, ТехасNI USB-6343
Газовый смесительCWE Inc, Ардмор, ПенсильванияGSM-4
Нагревательная спиральRadnoti, Ковина, Калифорния158822
Нагревательная пластинаThermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс11-100-49SH
ГепаринPfizerW63422
LabVIEW Полная система разработки 2014National Instruments
ПентобарбиталDiamondback DrugsG2270-0235-50
pH700 ProbeOAKTON, Vernon Hills, IL EW-35419-10
Полистат водяная баняCole-ParmerEW-12121-02
Аппарат искусственной вентиляции легких для грызуновГарвардский аппарат, Холлистон, МассачусетсМодель 683
Роликовый насосCole-Parmer, Вертхайм, Германия Ismatec REGLO Digital MS 2/8
Sprague Dawley RatCharles Charles River, Wilmington, MAКод штамма 001
VetScan i-STATAbraxis, Chicago, ILi-STAT 1

Ссылки

  1. Uhlig, S., Taylor, A. E. Methods in Pulmonary Research. , Birkhäuser. (1998).
  2. Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125(2019).
  3. Stone, M. L., et al. Ex vivo perfusion with adenosine A2A receptor agonist enhances rehabilitation of murine donor lungs after circulatory death. Transplantation. 99 (12), 2494-2503 (2015).
  4. Valenza, F., et al. The consumption of glucose during ex vivo lung perfusion correlates with lung edema. Transplantation Proceedings. 43 (4), 993-996 (2011).
  5. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95 (2), 196-203 (2004).
  6. McAuley, D. F., et al. Clinical grade allogeneic human mesenchymal stem cells restore alveolar fluid clearance in human lungs rejected for transplantation. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (9), L809-L815 (2014).
  7. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation Proceedings. 42 (2), 444-447 (2010).
  8. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 45 (3), e54-e60 (2014).
  9. Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309(2015).
  10. Bassani, G. A., et al. Ex vivo lung perfusion in the rat: detailed procedure and videos. PLoS One. 11 (12), e0167898(2016).
  11. Watson, K. E., Segal, G. S., Conhaim, R. L. Negative pressure ventilation enhances acinar perfusion in isolated rat lungs. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217753596(2018).
  12. Ohsumi, A., et al. A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (1), L61-L70 (2020).
  13. Hozain, A. E., et al. Multiday maintenance of extracorporeal lungs using cross-circulation with conscious swine. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (4), 1640-1653 (2020).
  14. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412(2010).
  15. van Zanden, J. E., Leuvenink, H. G. D., Verschuuren, E. A. M., Erasmus, M. E., Hottenrott, M. C. A translational rat model for ex vivo lung perfusion of pre-injured lungs after brain death. PLoS One. 16 (12), e0260705(2021).
  16. Cleveland, W. J., et al. Implementation of LabVIEW as a virtual instrument in a cost-effective isolated lung setup. The FASEB Journal. 33 (1), 846(2019).
  17. Jamieson, S. W., Stinson, E. B., Oyer, P. E., Baldwin, J. C., Shumway, N. E. Operative technique for heart-lung transplantation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 87 (6), 930-935 (1984).
  18. Liu, M., et al. Alterations of nitric oxide synthase expression and activity during rat lung transplantation. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 278 (5), L1071-L1081 (2000).
  19. Riess, M. L., et al. Glucose measurements in blood-free balanced salt solutions with three devices (i-STAT®, glucose test strips and ACCU-CHEK® Aviva). Anesthesia and Analgesia. 128 (5), 924(2019).
  20. Menezes, A. Q., et al. Comparison of Celsior and Perfadex lung preservation solutions in rat lungs subjected to 6 and 12 hours of ischemia using an ex-vivo lung perfusion system. Clinics. 67 (11), 1309-1314 (2012).
  21. Riess, M. L., et al. Electrolyte measurements in blood-free balanced salt solutions - comparison of i-STAT® with ABL80. Anesthesia and Analgesia. 130 (5), 984(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Модель легких крысыизоляция легкихканюляция трахеилегочные сосудыблок сердце-легкиеишемия-реперфузияканюля легочной артериисырая и сухая масса
Разработка и реализация модели перфузии легких Ex vivo у крыс
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.