Мы демонстрируем пошаговый протокол исследования функции генов в перитонеальных тканевых резидентных макрофагах in vivo с использованием лентивирусных векторов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Препарат лентивирусного вектора для эффективной модуляции генов и микроРНК резидентных макрофагов перитонеальной полости in vivo у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Перитонеальные тканевые резидентные макрофаги обладают широкими функциями в поддержании гомеостаза и участвуют в патологиях внутри локальных и соседних тканей. Их функции продиктованы сигналами микросреды; Таким образом, важно исследовать их поведение в физиологической нише in vivo . В настоящее время в рамках конкретных методологий нацеливания на перитонеальные макрофаги используются трансгенные модели целых мышей. В данной работе описан протокол эффективной модуляции in vivo экспрессии мРНК и малых видов РНК (например, микроРНК) в перитонеальных макрофагах с использованием лентивирусных частиц. Препараты лентивируса изготавливали в HEK293T клетках и очищали на одном слое сахарозы. Валидация in vivo эффективности лентивируса после внутрибрюшинного введения выявила преимущественную инфекцию макрофагов, ограниченную местной тканью. Нацеливание на перитонеальные макрофаги было успешным во время гомеостаза и тиогликолат-индуцированного перитонита. Обсуждаются ограничения протокола, в том числе воспаление низкой степени, вызванное внутрибрюшинной доставкой лентивируса, и временные ограничения для потенциальных экспериментов. В целом, это исследование представляет собой быстрый и доступный протокол для быстрой оценки функции генов в перитонеальных макрофагах in vivo.
Введение
Тканевые резидентные макрофаги (Mφ) представляют собой гетерогенную популяцию фагоцитарных иммунных клеток, которые чувствуют и реагируют на вторжение патогенов 1,2. Кроме того, они играют важную роль в развитии тканей, ремоделировании и поддержании гомеостаза 1,3. Многие тканевые Mφ происходят от предшественников желточного мешка во время эмбриогенеза и сохраняются в ткани на протяжении всей жизни 4,5. Фенотип и функции этих клеток продиктованы коллаборативным....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все работы с животными проводились в соответствии с рекомендациями Institutional и Министерства внутренних дел Великобритании.
Примечание: Все исследования in vivo с лентивирусом должны проводиться в соответствии с местными и национальными рекомендациями по этичному использованию животных в исследованиях, а также с соблюдением всех правил, связанных с использованием инфекционных материалов категории II. Благополучие животных также должно контролироваться в соответствии с местными правилами. На этом этапе протокола необходимо проявлять крайнюю осторожность при работе с лентивирусными частицами и ост....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
При полном и правильном следовании этому протоколу получается в общей сложности 1,5 мл высококачественного лентивируса на один препарат, что достаточно для двенадцати инъекций in vivo в оптимальном объеме, определенном в этом исследовании18. Успех трансфекции можно оценить на ранних этапах протокола. Здоровые и сливающиеся HEK293T клетки должны демонстрировать, если они присутствуют в плазмидах, легко обнаруживаемый маркерный сигнал (например, GFP, используемый в этом исследовании) через .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Тканевые резидентные макрофаги выполняют ряд гомеостатических и воспалительных тканеспецифичных функций 1,2 в зависимости от их физиологической среды 6,7,8,9. В этом протоколе был представлен эффективный метод18 для манипулирования перитонеальными резидентными макрофагами in .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование финансировалось, полностью или частично, премией Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z]. P.R.T также поддерживается Британским научно-исследовательским институтом деменции. M.A.C поддерживается стипендией Исследовательского совета по биотехнологии и биологическим наукам (BB/T009543/1). В целях открытого доступа автор применил публичную лицензию CC BY на любую версию рукописи, принятую автором, возникшую в результате этой заявки. L.C.D является преподавателем в Университете Суонси и почетным научным сотрудником Университета Кардиффа. Эта работа подкрепляется работой, проведенной Ips....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,05% Трипсин-ЭДТА (1x) (Трипсин 500 мг/л или 0,02 мМ) | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| 0,22 μ m стерильный millex GP фильтр | Merck | SLGS033SS | |
| 0,45 мкм; m стерильный millex GP фильтр | Merck | SLHP033RS | |
| 0,5 мл инсулиновый шприц U-100 с иглой, 0,33 мм x 12,7 мм (29 G) | BD | 324892 | |
| 1 литр контейнер для острых предметов | Н/Д | Н/Д | |
| 2,4G2 антитело (TruStain FcX anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | |
| 40 μ m ситечко | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| среда AimV (исследовательский класс), добавка AlbuMax | Thermo Fisher Scientific | 31035025 | |
| Блокирующий буфер | приготовлен на месте | ||
| тиогликолят пивоваренной среды | Sigma-Aldrich | B2551 | 4% исходный раствор приготовлен в воде, автоклавирован и хранится в замороженном виде. |
| CD11b | Biolegend | 101222 | См. Таблицу 1 для разведения и концентрации |
| CD11b | BD | 550993 | Таблицу 1 для разведения и концентрации |
| CD11c | Biolegend | 117317 | Таблицу 1 для разведения и концентрации |
| CD11c | Biolegend | 117333 | С Таблицу 1 для разведения и концентрации |
| CD19 | BD | 560375 | Разбавление и концентрацию |
| CD19 | Biolegend | 152410 | Таблица 1 разбавление и концентрацию |
| CD226 | Biolegend | 128808 | Таблица 1 разбавление и концентрацию |
| CD3e | BD | 560527 | Таблицу 1 разбавление и концентрацию |
| CD3e | Biolegend | 152313 | Разведение и концентрация |
| CD4 | Biolegend | 100412 | Таблица 1 Разведение и концентрация |
| CD73 | eBioscience | 16-0731-82 | Разведение и концентрация |
| CD8a | 48-0081-82 | Таблица 1 Колба | |
| клеточной культуры (T175 fask, 175 см<суп>2, 550 мл) | Центрифуга Greiner Bio One | 658175 | |
| пробирки, конические донные пробирки 25 мм x 89 мм | Beckman Coulter | 358126 | |
| центрифуги | Beckman Coulter | и центрифуга TC | |
| Коллагеназа типа IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Конические центрифуги (15 мл и 50 мл) | Greiner Bio One | 11512303 и 11849650 | |
| Криопробы | Greiner Bio One | 123277 | или криопробы |
| DMEM medium (1x) + 4,5 г/л D-глюкозы, 400 &; M L-глютамин | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Effecten трансфекционный реактив | Qiagen | 301425 | |
| F4/80 | Biolegend | 123123 | Разведение и концентрацию |
| F4/80 | Biolegend | 123133 см | 1 |
| F4/80 | Biolegend | 123147 | См. Таблицу 1 для разведения и концентрации |
| FceR1 | eBioscience | 48-5898-80 | См. Таблицу 1 для разведения и концентрации |
| Фетальная телячья сыворотка (FCS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | с тепловой инактивацией на 30 мин при 56 °°; С и стерильные фильтруются через 0,22 мкм; m фильтр |
| Проточный цитометр | Thermo Fisher Scientific | Attune NxT | |
| Проточная цитометрия (FACS) | приготовленный на месте | ||
| Флуоресцентный микроскоп для культуры тканей | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
| Щипцы | Н/ | Д Н/Д Н/Д | Предпочтения пользователя |
| Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) | Gibco, Life Technologies | 14175-053 | |
| HEK293T клеточная линия | выращено не менее чем за неделю до трансфекции. Основной | ||
| антиген ВИЧ-1 | Beckman Coulter | 6604667 | |
| гиалуронидазы | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Hydrex хирургический скраб, хлоргексидинг глюконат 4% w/v средство для очищения кожи | Ecolab | 3037170 | |
| I-A/I-E | Biolegend | 107625 | См. Таблицу 1 для разведения и концентрации |
| ICAM1 | Becton Dickinson | 554970 | В таблице 1 приведены данные о разведении и концентрировании |
| Т-клеточной линии | выращенной по крайней мере за неделю до использования. Набор | ||
| окрашивания мертвых клеток в ближнем инфракрасном диапазоне | Thermo Fisher Scientific | L34975 | |
| Ly6G | Biolegend | 127615 | См. таблицу 1 для разведения и концентрации |
| мышей | здесь использовали C57BL/6 самок в возрасте 8-12 недель (Чарльз Риверс), если не указано иное | ||
| Микрокапиллярные пипетки (диапазон объема 0,5-1,000 мкм; L) | Fisher Scientific & Starlab | 11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108724 | см. Таблицу 1 для разбавления и концентрации |
| параформальдегида | Sigma-Aldrich | P6148-500G | полученного до 2% по объему в PBS |
| pCMV-Δ Плазмида упаковки R8.91 | Zuffrey, R., et al. 1997 | Устойчивость к ампицилину. | |
| Пенициллин/стрептомицин (100x, 10 000 ЕД/мл) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| чашке | Петри чашка Greiner Bio One | 664160 | |
| pHR'SIN-cPPT-SEW плазмида | Rosas, M. et al. 2014 | модифицирована для исследований экспрессии shRNA и miR. Кодирует маркер EGFP после промотора SFFV и выше усилителя вируса гепатита Woodchuck. Устойчивость к ампицилину. | |
| Плазмида pMD2.G | Naldini, L. et al. 1996 | Устойчивость к ампицилину. | |
| Крыса IgG1, κ контроль изотипа | Becton Dickinson | 550617 | См. Таблицу 1 для разведения и концентрации |
| Сыворотка крысы | Sigma-Aldrich | R9759-10ML | |
| Красная кровь ACK лизис | буфер приготовлен в домашних | ||
| условиях RPMI 1640 среда (1x) + 400 мкМ L-глутамин | Thermo Fisher Scientific | 21875-091 | |
| Сапонин | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| SiglecF | BD | 562681 | См. Таблицу 1 для разбавления и концентрации |
| Таблетки гипохлорита натрия (отбеливатель, 2,000 ppm) | Guest Medical | H8818 | |
| Стерильный 24-луночный планшет для культивирования клеток | Greiner Bio One | 662160 | |
| Стерильный PBS Дульбекко (DPBS) (1x) Mg++ и Ca2+ - бесплатно | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| стерильные ЭДТА | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| стерильные одноразовые переносные пипетки VWR (23,0 мл, 30 см) | VWR | 612-4515 | |
| Сахароза | Thermo Fisher Scientific | 15503022 | |
| хирургические ножницы | н/д | /д н/д | Пользовательские настройки |
| Шприцы (50 мл и 1 0 мл) | Fisher Scientific | 10084450 & 768160 | |
| Tim4 | Biolegend | 130007 | см. таблицу 1 для разбавления и концентрации |
| U-образного дна 96-луночной клеточной культуральной пластины | Greiner Bio One | 650180 |
Ссылки
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Jantsch, J., Binger, K. J., Muller, D. N., Titze, J. Macrophages in homeostatic immune function. Front Physiol. 5, 146(2014).
- Wynn, T. A., Vannel....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
