Препарат лентивирусного вектора для эффективной модуляции генов и микроРНК резидентных макрофагов перитонеальной полости in vivo у мышей

Краткое содержание

Мы демонстрируем пошаговый протокол исследования функции генов в перитонеальных тканевых резидентных макрофагах in vivo с использованием лентивирусных векторов.

Аннотация

Перитонеальные тканевые резидентные макрофаги обладают широкими функциями в поддержании гомеостаза и участвуют в патологиях внутри локальных и соседних тканей. Их функции продиктованы сигналами микросреды; Таким образом, важно исследовать их поведение в физиологической нише in vivo . В настоящее время в рамках конкретных методологий нацеливания на перитонеальные макрофаги используются трансгенные модели целых мышей. В данной работе описан протокол эффективной модуляции in vivo экспрессии мРНК и малых видов РНК (например, микроРНК) в перитонеальных макрофагах с использованием лентивирусных частиц. Препараты лентивируса изготавливали в HEK293T клетках и очищали на одном слое сахарозы. Валидация in vivo эффективности лентивируса после внутрибрюшинного введения выявила преимущественную инфекцию макрофагов, ограниченную местной тканью. Нацеливание на перитонеальные макрофаги было успешным во время гомеостаза и тиогликолат-индуцированного перитонита. Обсуждаются ограничения протокола, в том числе воспаление низкой степени, вызванное внутрибрюшинной доставкой лентивируса, и временные ограничения для потенциальных экспериментов. В целом, это исследование представляет собой быстрый и доступный протокол для быстрой оценки функции генов в перитонеальных макрофагах in vivo.

Введение

Тканевые резидентные макрофаги (Mφ) представляют собой гетерогенную популяцию фагоцитарных иммунных клеток, которые чувствуют и реагируют на вторжение патогенов ^1,2. Кроме того, они играют важную роль в развитии тканей, ремоделировании и поддержании гомеостаза ^1,3. Многие тканевые Mφ происходят от предшественников желточного мешка во время эмбриогенеза и сохраняются в ткани на протяжении всей жизни ^4,5. Фенотип и функции этих клеток продиктованы коллаборативными и иерархическими взаимодействиями специфических факторов транскрипции и локального микроокружения 6,7,8,9. Растущее понимание этой зависимости увеличивает потребность в эффективных in vivo методах манипулирования генами Mφ в их физиологически значимой нише.

Лентивирусные векторы являются часто используемым инструментом для манипуляций с нуклеиновыми кислотами в конкретных клеточных популяциях in vivo 10,11,12, в частности, благодаря их способности инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки и стабильно встраиваться в геном хозяина ^13,14. За последние два десятилетия технология доставки лентивирусов была оптимизирована, и были исследованы альтернативные оболочки и синтетические промоторы для увеличения линейно-специфического таргетинга ^8,15. Благодаря широкому клеточному тропизму, вирус везикулярного стоматита обволакивает гликопротеин (VSV-G)^16,17 стал «золотым стандартом» оболочки, используемой в технологии лентивирусов.

В данном протоколе¹⁸ лентивирусные частицы VSV-G с псевдотипированием используются для демонстрации целенаправленной и эффективной доставки короткой шпильковой РНК (shRNA) и микроРНК (miR) в перитонеальную Mφ (pMφ) мыши in vivo, в равновесном состоянии¹⁹. Экспрессия трансгена была обусловлена промотором вируса, формирующего селезеночный очаг (SFFV). Продуктивное инфицирование клеток определялось экспрессией лентивирусного усиленного зеленого флуоресцентного белка (GFP). Использование этого подхода позволило легко считывать данные для экспериментов с лентивирусом in vivo для определения оптимальной дозы и временных рамок эксперимента. Наконец, лентивирусная провокация in vivo мышей во время воспаления, вызванного тиогликолатами, выявила естественную склонность к селективной pMφ-инфекции.

Протокол

Все работы с животными проводились в соответствии с рекомендациями Institutional и Министерства внутренних дел Великобритании.

Примечание: Все исследования in vivo с лентивирусом должны проводиться в соответствии с местными и национальными рекомендациями по этичному использованию животных в исследованиях, а также с соблюдением всех правил, связанных с использованием инфекционных материалов категории II. Благополучие животных также должно контролироваться в соответствии с местными правилами. На этом этапе протокола необходимо проявлять крайнюю осторожность при работе с лентивирусными частицами и острыми предметами.

1. Подготовка HEK293T клеток к трансфекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте эти действия в шкафу биологической безопасности для стерильных культур тканей.

1. Приготовьте полную модифицированную среду Dulbecco Modified Eagle Medium (cDMEM) для HEK293T клеток, объединив 450 мл DMEM с 10% (v/v) эмбриональной сывороткой теленка (50 мл) и конечной концентрацией 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина.
2. Размораживать HEK293T клетки не менее чем за 1 неделю до планируемой трансфекции. Поддерживайте здоровые условия выращивания и прохода каждые 2-3 дня, используя трипсин + ЭДТА для отделения клеток от колбы.
3. За сутки до трансфекции осторожно отсасывайте питательную среду из клеток и аккуратно промойте клетки стерильным DPBS. Добавьте в колбу 1-5 мл трипсина и инкубируйте при 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 в течение 2-5 минут.
4. Добавьте 5-10 мл cDMEM и вращайте ячейки при 350 x g в течение 5 минут. Удалите жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл cDMEM. Подсчитайте клетки и засемените 10-11 x 10⁶ жизнеспособных HEK293T клеток в колбе T175 в 20 мл cDMEM.
5. Инкубируйте при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 в течение ночи, чтобы HEK293T клетки достигли 70–80% конфлюенции.
6. На следующий день подтвердите слияние клеток под световым микроскопом.
7. Извлеките среду из колбы с помощью серологической полоски объемом 25 мл, не нарушая монослой клеток.
8. Аккуратно добавьте 10 мл DPBS и покачивайте пластину, чтобы промыть клетки, стараясь не нарушить монослой клеток.
9. Удалите DPBS с помощью серологической полоски объемом 25 мл.
10. Добавьте 15 мл нового cDMEM на стену на колбу T175, чтобы не нарушить монослой клетки, и верните планшет в инкубатор при температуре 37 °C.

2. Трансфекция HEK293T клеток с использованием нелипосомального липидного реагента для трансфекции липидов

1. В центрифужной пробирке объемом 15 мл приготовьте лентивирусные компоненты: 2 мкг лентивирусной плазмиды, 1,5 мкг pΔ8,91 (pCMV-Δ8,91) и 1 мкг pMD2.G (pCMV-MD2.G) с помощью Buffer EC (набор реагентов Transfection) до конечного объема 600 мкл.
2. Добавьте 36 мкл раствора усилителя. Смешайте компоненты с помощью пипетки объемом 1 мл, многократно всасывая часть жидкости и капля за каплей нанося ее обратно прямо на оставшийся раствор. Оставить на 5 минут при комнатной температуре (RT).
3. Добавьте 120 мкл реагента для трансфекции и перемешайте, как указано выше, примерно 20 раз. Инкубировать в течение 10 минут при RT.
4. Добавьте 5,2 мл cDMEM и перемешайте, как указано выше, с серологической полоской объемом 5 мл.
5. С помощью одноразовой переводной пипетки добавьте трансфекционную смесь по каплям непосредственно на монослой HEK293T клеток (избегая стенок колбы), распределяя смесь по разным местам колбы.
6. Распределите плазмиду, осторожно покачивая колбу из стороны в сторону. Избегайте попадания жидкости в крышку колбы.
7. Инкубировать колбу при 37 °C в инкубаторе с 5 %_CO2 в течение 48 часов. Подтвердить эффективную трансфекцию HEK293T клеток путем появления флуоресцентного маркера, в данном случае GFP, в течение 24 ч после трансфекции под контролем флуоресцентного микроскопа для визуализации клеток.
   Примечание: Для конструкций без флуоресцентного маркера HEK293T клетки должны быть проверены на наличие используемого маркерного гена или на изменение экспрессии в гене/белке, представляющем интерес, с помощью соответствующих методов, например, количественной ПЦР. В качестве альтернативы, успешная трансфекция может быть косвенно проверена во время тестирования коллекции лентивируса на клетках Jurkat на более поздних стадиях протокола с помощью вышеуказанных методов.
   ВНИМАНИЕ: Трансфицированные HEK293T клетки считаются инфекционными, и при работе с ними следует соблюдать соответствующие меры предосторожности. Следует соблюдать местные правила, которые обычно могут включать работу в шкафу биологической безопасности категории II, использование двойных перчаток и соответствующего раствора для обеззараживания для дезинфекции, например, повышенную концентрацию отработанного отбеливателя (2000 ppm) или эквивалентного раствора в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности. Все растворы и пластмассы, вступающие в контакт с препаратом лентивируса, должны быть продезинфицированы в соответствии с институциональными процедурами биобезопасности.

3. Сбор лентивирусных частиц

1. Приготовьте раствор для обеззараживания, раствор отбеливателя (гипохлорита натрия) высокой концентрации (2 000 ppm) или эквивалентное средство в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности в ведре и поместите его в шкаф биологической безопасности.
2. Подготовьте шкаф безопасности для биологии, убрав все лишние предметы, такие как пустые штативы для пробирок и т. д.
3. Предварительно промаркируйте центрифужную пробирку объемом 50 мл на колбу T175 HEK293T ячеек и снимите крышку с центрифужной пробирки. Поместите пробирки в устойчивую решетку.
4. Достаньте колбу из инкубатора и подтвердите экспрессию GFP с помощью флуоресцентного микроскопа с лазером 488 нм (рис. 1A). Интенсивность сигнала зависит от эффективности процедуры трансфекции и используемых конструкций.
5. Соберите среду из клеток в предварительно маркированную центрифужную пробирку объемом 50 мл. Наклоните колбу T175 HEK293T с трансфицированными ячейками так, чтобы среда собиралась в нижнем углу колбы. С помощью серологической полоски объемом 25 мл соберите среду, не нарушая монослой клеток. На этом этапе могут быть видны некоторые плавающие ячейки. Переложите среду в чистую центрифужную пробирку объемом 50 мл и закройте крышку.
   1. Используя серологическую полоску объемом 25 мл, добавьте в колбу 25 мл свежей теплой кДМЭМ. Следите за тем, чтобы направить поток среды на стенки колбы, чтобы не нарушить монослой ячейки. Верните колбу с трансфицированными HEK293T ячейками в инкубатор (37 °С, 5%_СО2).
      Примечание: Второй сбор лентивируса и дальнейшая очистка могут быть выполнены через 24 часа после процедуры, описанной в описанных выше шагах.
6. Когда сбор лентивируса будет завершен через 24 или 48 ч, добавьте раствор для обеззараживания в клетки, следя за тем, чтобы он покрывал монослой клеток. Держите колбу в горизонтальном положении в течение следующих 24 часов, затем выбросьте ее в соответствии с соответствующими правилами категории II.

4. Очищение от лентивируса

1. Фильтруем собирающую среду с шага 3.5.
   1. Извлеките поршень из шприца объемом 50 мл и вставьте в конец шприца стерильный фильтр с низким содержанием белка, связывающий полиэфирсульфон или поливинилиденфторид 0,45 мкм. С помощью серологической полоски объемом 25 мл добавьте в шприц собранную среду с шага 3.5.1 и аккуратно верните поршень.
   2. Медленно нажмите на пробку, чтобы пропустить среду через фильтр в свежую центрифужную пробирку объемом 50 мл. Если поток значительно уменьшился, расположите шприц фильтром вверх и вытяните поршень настолько, чтобы удалить среду из фильтра.
   3. Осторожно замените фильтр на шприце на новый и утилизируйте использованный фильтр в растворе для обеззараживания. Продолжайте фильтрацию среды. По завершении обеззаритите фильтр и шприц, погрузив фильтр в воду и наполнив шприц раствором для обеззараживания.
2. Предварительно охладите ультрацентрифугу, установив температуру 4 °C, и закройте крышку, чтобы температура акклиматизировалась.
3. Добавьте 3 мл 20 % раствора сахарозы (20 мас. в ультрачистой воде, фильтр стерилизован с помощью фильтра 0,22 мкм) на дно конической ультрацентрифужной пробирки.
4. С помощью серологической полоски объемом 25 мл наложите отфильтрованную среду поверх слоя сахарозы, стараясь не повредить слои.
   1. Используйте самую низкую настройку скорости на пипетке. Наклоните коническую ультрацентрифужную пробирку примерно на 45° и медленно добавьте отфильтрованную лентивируссодержащую среду из шага 4.1 к стенке пробирки. Следите за тем, чтобы среда и сахароза не смешивались, и было видно четкое разделение слоев (Рисунок 1B). По мере увеличения объема слоя среды медленно наклоняйте ультрацентрифужную пробирку обратно в вертикальное положение.
5. Если общий объем, включая сахарозу и среду, в ультрацентрифужной пробирке составляет менее 29 мл, долейте свежий cDMEM, чтобы избежать схлопывания пробирки во время отжима. Для нескольких сборов T175 мл смешайте препараты фильтрованной среды и используйте несколько ультрацентрифужных пробирок. При необходимости дольте в последнюю ультрацентрифужную пробирку среду.
6. Убедитесь, что ведра ультрацентрифуги чистые; На дне ведра или крышках нет остатков среды. При необходимости протрите ~70% спиртом. Положите подходящие адаптеры для трубок на дно каждого ведра (Рисунок 1C) и осторожно опустите ультрацентрифужные пробирки в ведра.
7. Надежно закройте ведра и повесьте их на отведенные места на вращающемся роторе.
8. Следите за тем, чтобы ведра были сбалансированы с одинаковыми объемами сахарозы и средней. Вращающийся ротор никогда не должен работать без ковшей, хотя противоположные ковши могут оставаться пустыми²⁰ (Рисунок 1D).
9. Осторожно вставьте ротор в ультрацентрифугу и включите вакуум. Установите скорость ускорения и замедления ультрацентрифуги на самое низкое значение и запустите подготовку лентивируса при 85 000 x g в течение 90 минут при 4 °C.
10. Подождите, пока ультрацентрифуга достигнет необходимой скорости (около 3-5 минут), прежде чем уйти, чтобы убедиться, что ротор вставлен правильно и вращение не прекратится.
11. Во время работы ультрацентрифуги очистите рабочее пространство в соответствии с требованиями безопасности II категории и подготовьте пространство для следующих шагов.
12. Когда отжим закончится, отключите вакуум и осторожно снимите ротор, чтобы не потревожить образцы.
13. Осмотрите ультрацентрифугу на предмет разливов и убедитесь в отсутствии утечек из ведра. В случае разлива наденьте двойную перчатку и обеззараживайте центрифугу и внешнюю поверхность ведер противовирусными средствами.
14. Снимите ведра с ультрацентрифуги и осторожно транспортируйте ведра в шкаф безопасности биологии II категории.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Частицы лентивируса собираются на дне ультрацентрифужной пробирки. Дробинка не видна невооруженным глазом.
15. Вылейте сахарозу и среду одним плавным движением прямо в контейнер для отходов с раствором для обеззараживания.
16. Держа ультрацентрифужную трубку перевернутой, перенесите ее на двойной слой ткани и оставьте сохнуть на 10 минут. Тем временем протрите внутреннюю часть ведер смоченной в воде салфеткой и высушите на воздухе вверх дном.
17. Тщательно вытрите насухо остатки жидкости с края ультрацентрифужной пробирки салфеткой, прежде чем перевернуть ее в вертикальном положении. Продезинфицируйте ткань и поверхность под ней.
18. Повторно суспендируйте вирусную гранулу в 1 мл бессывороточной среды или раствора, необходимого для дальнейших экспериментов, осторожно дозируя раствор вверх и вниз. Оставьте на 15 минут в режиме RT в шкафу безопасности биологии II категории.
19. Осторожно перемешайте препараты лентивируса с помощью пипетки объемом 1 мл перед выделением в пробирки с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 мл (например, криопробирки). Подготовьте аликвоты для работы in vivo (кратность 100 мкл) и для титра лентивируса в Т-клетках Jurkat (1 x 20 мкл) (см. шаг 5).
20. Избегайте циклов замерзания-оттаивания; Препараты лентивирусов могут храниться при температуре -80 °C до 6 месяцев без негативного влияния на инфекционность.

5. Титрование продукции лентивируса в Т-клетках Jurkat

1. Приготовьте полную среду Roswell Park Memorial Institute 1640 (cRPMI-1640) для Т-клеток Jurkat путем добавления 500 мл RPMI-1640 с 10% (v/v) эмбриональной сыворотки теленка и конечной концентрацией 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина.
2. Чтобы обеспечить здоровую культуру Т-клеток Jurkat, сохраняйте клетки в культуре до 1 недели до заражения.
3. В день титрования лентивируса выложите жизнеспособные Т-клетки Jurkat в 24-луночный планшет в соотношении 2 x 10⁵ клеток/лунку по 200 мкл на лунку cRPMI-1640.
4. Используйте свежесобранный лентивирус или разморозьте флакон с лентивирусом, содержащий 20 μл, на льду и аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
5. Используя серийное разведение в cRPMI-1640, инфицируйте Т-клетки Jurkat 0,25 μл, 0,5 μл, 1 μл, 2,5 μл, 5 μл и 10 μл лентивирусного запаса. Аккуратно покачивайте пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение лентивируса. Неинфицированные Т-клетки Jurkat служат отрицательным контролем.
6. Инкубируйте тарелку при 37 °C. Через 4 ч долите в каждую лунку cRPMI до общего объема 400 μл. Верните планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 3 дня.
7. Через 48 ч после инфицирования подтвердите экспрессию GFP с помощью флуоресцентной системы визуализации.
8. Через 3 дня после заражения соберите каждую лунку 24-луночного планшета в отдельные пробирки для сбора объемом 1,5 мл и центрифугируйте клетки при 350 x g при 4 °C в течение 5 минут.
9. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу в 300 мкл 2% параформальдегида (PFA), приготовленного до 2% (w/v) в DPBS и оставьте на 15 минут на льду в темноте.
10. Центрифугируйте клетки при 350 x g при 4 °C в течение 5 мин и повторно суспендируйте гранулу в буфере для сортировки клеток с флуоресценцией-активацией (FACS) (стерильный DPBS + 4% FCS + 1 мМ стерильный ЭДТА).
11. Анализ частоты экспрессии GFP и средней интенсивности флуоресценции инфицированного лентивируса и его контрольных клеток с помощью проточной цитометрии (рис. 2).

6. Лентивирусная инфекция in vivo тканевых резидентных перитонеальных макрофагов

1. В бокс биологической безопасности категории II загрузите иглы инсулина общим объемом 200 мкл бессывороточной среды, содержащей необходимое количество лентивируса (используйте одноразовые иглы по 30 г для благополучия животных и во избежание потери жидкости в игле).
2. Поместите ножны иглы обратно на иглу, используя технику совка одной рукой. Держите иглу на льду и вводите в течение 30 минут.
3. В животноводческом помещении перед инъекциями установите шкаф биологической безопасности категории II (рис. 1E).
   1. Постелите лист чистой салфетки. Ослабьте оболочку на игле инсулина, содержащей лентивирус.
   2. Приготовьте чашку Петри, содержащую небольшие кусочки ткани и дезинфицирующее средство на основе хлоргексидина глюконата, пробирку объемом 50 мл с раствором для обеззараживания (2000 ppm раствора отбеливателя) и острый безопасный контейнер.
4. Удерживайте мышь, захватывая кожу в области затылка²¹. Правильно удерживаемая мышь неподвижна, а это требуется для безопасности.
5. Повернув живот вверх, направьте голову животного немного вниз. Ввести лентивирус внутрибрюшинно в нижний правый квадрант брюшной полости. Это необходимо для того, чтобы избежать инъекций в любые органы брюшной полости.
6. Прежде чем выпустить мышь, наполните шприц обеззараживающим раствором и безопасно утилизируйте его в острый сейф.
7. Протрите место укола на животе мыши тканью, смоченной в дезинфицирующем средстве, и верните животное в клетку.
8. Мыши, получившие инъекцию лентивируса, помещаются в контейнеры категории II или в клетки с индивидуальной вентиляцией (IVC) (изолированные клетки с высокоэффективной фильтрацией воздуха) в течение как минимум 72 часов после инъекции. Разместите соответствующую информационную карточку на передней части клетки.
9. Переместите мышь в новую клетку категории I через 72 часа после заражения, в зависимости от местных разрешений на безопасность. Наблюдайте за мышами ежедневно в течение 3 дней с момента инъекции.

7. Забор перитонеальных клеток у мышей, инфицированных лентивирусом

ВНИМАНИЕ: При сборе в течение 72 ч после инъекции лентивируса соблюдайте институциональные правила биологической безопасности категории II. Подстилка и клетка, в которых содержались инфицированные животные в течение первых 72 ч после инъекции лентивируса, должны быть обеззаражены в соответствии с правилами биологической безопасности II категории учреждения.

1. Усыпляйте мышей в соответствии с установленными правилами, например, путем вдыхания возрастающей концентрации_СО2 с последующим подтверждением смерти от вывиха шейки матки.
2. Очистите брюшную полость мыши с помощью 70% изопропанола и тщательно разрежьте кожу, чтобы обнажить оболочку брюшинной полости.
3. Промывайте брюшную полость 6 мл ледяного буфера FACS с помощью шприца объемом 10 мл и иглы 23 G. Избегайте прокола любых органов.
4. Аккуратно массируйте брюшину, чтобы вытеснить клетки в буфер FACS.
5. Соберите перитонеальную жидкость с помощью того же шприца и иглы.
6. Извлеките иглу и переложите ячейки в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
7. Держите брюшинные промывки на льду.
8. Соберите другие необходимые органы и храните их в соответствии с исследованием.
9. Утилизируйте туши животных в соответствии с местными правилами защиты животных и техники безопасности.

8. Окрашивание и анализ клеток брюшины

1. Центрифугируйте перитонеальный лаваж при 350 x g при 4 °C в течение 5 минут, выбросьте надосадочную жидкость в раствор для обеззараживания и повторно суспендируйте клетки в 1 мл буфера FACS.
2. Подсчитайте собранные ячейки и планшет 4 x 10⁵ клеток на лунку в 96-луночном планшете с V-образным дном.
3. Выполняйте окрашивание на жизнеспособность с помощью фиксируемого реагента (например, используемого здесь набора для окрашивания мертвых клеток Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit) в соответствии с инструкциями производителя.
4. Если клетки были инфицированы в течение последних 72 ч, зафиксируйте клетки в 2% PFA на 15 мин на льду. Добавьте равный объем холодного DPBS и снова центрифугируйте при 350 x g при 4 °C в течение 5 минут.
5. Приготовьте блокирующий буфер: Смешайте 4 мкг/мл антитела 2,4G2 в 10% (v/v) сыворотке крови крысы в буфере FACS для поверхностного окрашивания или буфере для пермеабилизации для внутриклеточного окрашивания.
6. Ресуспендируйте каждую лунку, содержащую клеточную гранулу, в 50 мкл блокирующего буфера и инкубируйте при 4 °C в течение 15 минут.
7. Приготовьте смесь антител в 50 мкл буфера FACS (для поверхностного окрашивания) или буфера для пермеабилизации (для внутриклеточного окрашивания) для каждого образца. Окончательный объем окрашивания для каждого образца составит 100 μл, включая 50 μL блокирующего буфера. Рассчитайте концентрацию антител соответственно (Таблица 1).
8. Добавьте 50 мкл смеси антител в образцы и 50 мкл контрольного изотипа и контрольного буфера в контрольные образцы. Инкубируйте образцы в течение 30 минут на льду в темноте. При необходимости включите неокрашенные клетки и элементы контроля изотипа.
9. Промойте каждую лунку 100-200 μL ледяного DPBS и центрифугируйте планшет при 350 x g при 4 °C в течение 5 минут. Повторите этот шаг, чтобы смыть все несвязанные антитела. Анализируйте образцы на проточном цитометре.

9. Извлечение клеток из органов

1. Приготовьте 1 мл смеси для пищеварения на каждый орган: смешайте сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS), 2 мг/мл коллагеназы IV типа и 0,03 мг/мл ДНКазы I (включите 1,5 мг/мл гиалуронидазы для переваривания легких).
2. Перелейте собранный орган в 1 мл пищеварительной смеси и пропустите через мясорубку ножницами.
3. Профильтруйте ячейки через сетчатое фильтр 40 мкм и центрифугируйте при 350 x g при 4 °C в течение 5 минут.
4. При выделении клеток из легких, селезенки или печени лизируйте эритроциты с помощью буфера для лизиса ACK (150 мМ NH₄Cl, 10 мМ KHCO₃, 0,1 мМ Na₂EDTA pH = 7,4). Профильтруйте ячейки через сетчатое фильтр 40 мкм и центрифугируйте при 350 x g при 4 °C в течение 5 минут.
5. Окрасьте и проанализируйте клетки, как описано в разделе 8.

Результаты

При полном и правильном следовании этому протоколу получается в общей сложности 1,5 мл высококачественного лентивируса на один препарат, что достаточно для двенадцати инъекций in vivo в оптимальном объеме, определенном в этом исследовании¹⁸. Успех трансфекции можно оценить на ранних этапах протокола. Здоровые и сливающиеся HEK293T клетки должны демонстрировать, если они присутствуют в плазмидах, легко обнаруживаемый маркерный сигнал (например, GFP, используемый в этом исследовании) через 48 ч после трансфекции плазмид (рис. 1A). Низкая интенсивность сигнала, чрезмерная отслойка клеток и низкая конфлюенция на ранних этапах протокола могут указывать на гибель клеток и привести к низкому выходу препарата лентивируса. Часть отслоения клеток до необязательного сбора II (шаг 3.5.1.) видна и ожидаема.

В этом протоколе для генерации частиц лентивируса используются три плазмиды: упаковочная плазмида pCMV-ΔR8.91, кодирующая структурный белок HIV-1 (Gag), вспомогательные белки Tat и Rev, а также полимераза обратной транскриптазы (Pol)²²; pMD2.G, кодирующий оболочку VSV-G под промотором ЦМВ¹³; и плазмида pHR'SIN-cPPT-SEW (кодирующая усиленный маркер GFP)¹⁹ соответственно модифицирована для экспрессии shRNA или микроРНК.

Препараты лентивируса титруются в Т-клеточной линии Jurkat благодаря их высокой^{инфекционности23}. Успешный препарат лентивируса позволяет достичь уровня инфицирования более 95% при дозе 5 мкл (рис. 2A). Средняя интенсивность флуоресценции инфицированных клеток продолжает увеличиваться с увеличением доз (рис. 2B, C). При необходимости титры вирусов могут быть измерены с помощью ПЦР в реальном времени интегрированных вирусных компонентов, например, промотора SFFV, который линейно коррелирует с процентом клеток, экспрессирующих GFP, и логарифмически с GFP MFI (рис. 2D). В зависимости от конструкции, особенно с большой вставкой²⁴, некоторые препараты лентивируса могут демонстрировать пониженную инфекционность в Т-клетках Jurkat, как показано для конструкции Cre-GFP, использованной в этом исследовании (рисунок 2E, F). В таком случае несколько препаратов частиц лентивируса могут быть объединены и ресуспендированы в 1 мл. Мы рекомендуем проверить иммунный ответ на эти препараты in vivo до начала экспериментов. Естественно, используемые здесь препараты лентивируса с альтернативными рецепторами проникновения VSV-G, могут демонстрировать различную эффективность инфекции в Т-клеточной линии Jurkat, в зависимости от экспрессии рецепторов на клетках. Клеточные линии, используемые для титрования, должны быть выбраны таким образом, чтобы они экспрессировали рецептор, используемый частицами лентивируса для проникновения в клетки, и в них преимущественно отсутствовали или имели очень низкую экспрессию факторов рестрикции²⁵.

Об успешной продукции лентивирусных частиц также свидетельствует инфекция pMφ (определяемой как популяция CD11b⁺ F4/80⁺ и Tim4⁺ )¹⁸ (рис. 3A). Мы определили, что внутрибрюшинное введение препарата лентивируса в объеме 100 мкл (в общем объеме 200 мкл бессывороточной среды) дает наибольший процент и интенсивность сигнала GFP в этих клетках (рис. 3B, C). Инъекции более высоких доз (150 мкл и 200 мкл препарата лентивируса) не оказывали благоприятного влияния на экспрессию GFP в pMφ. Временные эксперименты через 4 ч, 3 дня, 7 дней и 14 дней после внутрибрюшинного (в/в) введения 100 мкл лентивируса выявили значительный процент резидентных pMφ, экспрессирующих GFP, на 3 и 7 день, с последующим исчезновением инфицированной популяции на 14 день (рис. 3D, E). Интересно, что gfp-экспрессирующий pMφ в основном исчезает к 14-му дню после заражения, отчасти из-за иммунного распознавания маркера GFP. Действительно, эксперименты с лентивирусом с маркером GFP у селективных T-Reg мышей Foxp3-DTR-eGFP предотвращают отторжение инфицированного резидентного pMφ по крайней мере до 21 дня (рис. 3F). Для препаратов лентивируса с пониженной эффективностью в клетках Jurkat требуется более высокое количество для достижения ожидаемой скорости инфицирования in vivo. Однако, как показано на примере препарата лентивируса Cre-GFP, в зависимости от конструкции конструкции, даже доза 300 мкл через 7 дней после внутримышечной инъекции может привести к неблагоприятному исходу (рис. 3G). Ранее мы продемонстрировали успешное использование этого протокола для сверхэкспрессии и нокдауна генов in vivo у мышей pMφ, включая лентивирусные shRNA-опосредованные Map3k8 и Gata6 нокдаун, а также гиперэкспрессию Gata6 ¹⁹. В данной работе мы показываем, что этот протокол также может быть успешно использован для сверхэкспрессии мышиной микроРНК 146b (mmu-miR-146b) и для нокдауна молекулы межклеточной адгезии 1 (ICAM1, CD54) с использованием лентивирусной полученной шРНК в резидентных pMφ (рис. 3H, I).

Инфицирование первичных клеток, таких как макрофаги, требует более высокого поступления лентивируса, предположительно из-за наличия факторов рестрикции в этих клетках. Факторы рестрикции являются естественными защитными механизмами клеток, которые вмешиваются в этапы жизненного цикла вирусов, такие как обратная транскрипция или интеграция, что приводит к ингибированию экспрессии генов в конструкциях.

Кроме того, валидация протокола in vivo не показала влияния доставки i.p-лентивируса на жизнеспособность перитонеальных иммунных клеток (рис. 4A) и указала на отчетливую инфекционность резидентных субпопуляций pMφ (определяемую экспрессией маркеров CD73 и Tim4) (рис. 4B, C). Важно отметить, что продуктивная лентивирусная инфекция была ограничена резидентным Mφ в месте инъекции, о чем свидетельствует отсутствие значительной экспрессии GFP в брыжеечных лимфатических узлах (mLN), легких, печени или Mφ селезенки через 7 дней после заражения (рис. 4D). Учитывая, что во многих случаях генетическое нацеливание Mφ необходимо проводить в условиях воспаления, мы исследовали эффективность этого протокола у мышей, которым внутрибрюшинно вводили 0,1 мл 4% тиогликолата. Инъекция тиогликолата вызывает приток воспалительных моноцитарных Mφ и моноцитарных клеток, которые могут быть разделены на 5 отдельных популяций (рис. 4E). Анализ проточной цитометрии выявил рефрактерный фенотип моноцитарных подобных клеток (популяции Ly6C^hi 1 и 2) к лентивирусной инфекции, что соответствует предыдущим результатам в клетках человека²⁶. Напротив, резидентные Mφ и моноциты (группы 3-5) оставались наиболее восприимчивыми к инфекции (рисунок 4F).

Детальный проточный цитометрический анализ выявил экспрессию GFP преимущественно в резидентном перитонеальном Mφ и большом комплексе гистосовместимости (MHC) класса II⁺ (MHCII⁺ F4/80⁺ Tim4⁺) (до 60 % на 3-е сутки после инъекции) (рис. 5A). Сигнал GFP практически не был обнаружен в других популяциях перитонеальных клеток, включая перитонеальные Mφs/DC костного мозга (MHCII⁺, CD11b⁺, CD11c⁺), В-клетки (CD19⁺), Т-клетки (CD3⁺), тучные клетки (CD11b^-, FcεR1⁺), эозинофилы (Siglec-F⁺), ^{NK-клетки} (CD19-, NK1.1⁺) и нейтрофилы (Ly6G⁺) (рис. 5A, B). Продолжительность жизни экспрессии GFP (рисунок 5C) во всех популяциях следовала продолжительности жизни резидентного перитонеального Mφ (рисунок 1D). Преходящее увеличение частоты нейтрофилов было зарегистрировано через 4 ч после внутримышечного введения 100 мкл (в общем объеме 200 мкл бессывороточной среды) лентивируса (рис. 5D), что указывает на раннее легкое воспаление, присутствующее у зараженных животных. Наконец, у резидентных pMφ наблюдалось значительное снижение частоты между 7 и 14 днями после инфицирования (рисунок 5E), что свидетельствует о наилучшем экспериментальном окне между 3 и 7 днями после инъекции.

Рисунок 1: Продукция лентивируса в HEK293T клетках. (A) Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения HEK293T клеток через 48 часов после успешной трансфекции (флуоресцентный микроскоп [пик возбуждения 488 нм, пик излучения 510 нм], 20-кратное увеличение, масштабная линейка = 400 мкм). (В) Фотография ультрацентрифужной конической пробирки, содержащей слой 20% сахарозы (внизу, прозрачная) и слой среды, собранной из трансфицированных HEK293T клеток (вверху, красный). (C) Фотография правильной установки конической ультрацентрифуги в ведро, включая адаптер. (D) Фотографии, показывающие правильную и неправильную балансировку ротора ультрацентрифуги. (E) Фотография оптимальной конфигурации кабинета Cat II и материалов для инъекций in vivo для правши. Этот рисунок был изменен с разрешения Ipseiz N et ^al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Титрование лентивируса в Т-клетках Jurkat . (A) Репрезентативный проточный цитометрический анализ Т-клеток Jurkat через 72 ч после заражения возрастающими дозами лентивируса, содержащими плазмиду GFP, показывающий процент клеток GFP⁺ (GFP⁺), (B) среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) клеток GFP⁺ и (C) репрезентативную гистограмму экспрессии GFP. (D) Точечная диаграмма, показывающая MFI (слева Y) и процент клеток, инфицированных GFP-экспрессирующим лентивирусом (справа Y) в сравнении с числом копий вируса, обнаруженных на пг ДНК (ось x). (E) Репрезентативная гистограмма инфицирования Т-клеток Jurkat субоптимальным препаратом Cre-GFP лентивируса (Cre-GFP LV) и контролем лентивируса GFP (GFP LV) и (F) сводные данные, показывающие процент инфицированных Cre-GFP лентивирусом лентивирусом Jurkat T-клеток Jurkat (GFP⁺). Этот рисунок был изменен с разрешения Ipseiz N et ^al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Инфекционная эффективность резидентного pMФ. (A) Стратегия гейтирования резидентных pMφ (CD11b⁺, Tim4⁺, F4/80⁺) и Tim4^-, F4/80⁺ клеток. Клетки были забиты на синглеты с последующим выделением CD11b⁺. (B) репрезентативные точечные диаграммы и (C) сводка частоты инфицирования (% GFP+ клеток) и интенсивности (MFI) GFP⁺ клеток, выделенных через 3 дня после инфицирования in vivo различными дозами препарата GFP лентивируса. (D) репрезентативная точечная диаграмма и (E) сводка частоты инфицирования (% GFP+ клеток) и интенсивности (MFI) GFP+ клеток, выделенных в разные моменты времени после инфицирования in vivo 100 мкл лентивируса в общем объеме 200 мкл бессывороточной среды. (F) Сводка количества клеток на 7, 14 и 21 день после внутрибрюшинной доставки GFP-экспрессирующего лентивируса у мышей Foxp3-DTR-eGFP с указанием количества GFP-экспрессирующих pMφ и воспалительных макрофагов и дендритных клеток (InfMØs/DCs [F480^низкий]). (n= 1-2 на группу). (G) Репрезентативная точечная диаграмма субоптимальной in vivo инфекции Gata6-KO ^{mye 19} резидентного pMφ с 300 мкл лентивируса Cre-GFP через 7 дней после внутримышечной инъекции. (H) Количественное определение ОТ-кПЦР экспрессии mmu-miR-146b-5p резидентного перитонеального Mφ in vivo с помощью 100 мкл лентивируса, кодирующего мышиную микроРНК-146b (miR-146b) или контроль (C). Резидентные pMφ (белые круги) и Tim4^-, F4/80⁺ клетки (серые круги). (I) Репрезентативная точечная диаграмма успешного подавления ICAM1 на pMφ у самок мышей 129S6 через 7 дней после внутримышечной инъекции лентивируса, содержащего целевую shRNA. Показана контрольная шРНК. В оверлее показано управление изотипами. Данные выражены в виде среднего значения ± SEM, n≥2 мышей. Этот рисунок был изменен с разрешения Ipseiz N et ^al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Инфекционная эффективность резидентных субпопуляций pMφ. (A) Процент от общего числа отдельных клеток и резидентного Mφ жизнеспособных через 7 дней после 100 мкл бессывороточной среды (-) или инъекции лентивируса GFP (+) в/. (B) Стратегия гейтирования, показывающая четыре основные популяции pMφ, обнаруженные in vivo: CD73⁺Tim4⁺, CD73-Tim4^-, CD73^+Tim4-, и (C) соответствующую частоту инфекции (% GFP+ клеток) и интенсивность (MFI GFP+ клеток) этих популяций. (D) Процентное содержание клеток GFP+ в нескольких органах через 7 дней после внутривенного введения 100 мкл лентивируса. Сокращения: mLN, брыжеечный лимфатический узел. (E) Мышам вводили в/0,1 мл 4% тиогликолата в течение 5 дней с последующей внутримышечной инъекцией лентивируса. Стратегия стробирования pMφ и моноцитов через 3 дня после инъекции лентивируса i.p. (F) Частота инфекций, MFI и анализ количества клеток моноцитов GFP+ (Ly6C⁺) и Mφ (Ly6C^-). Данные выражены как среднее значение ± SEM, n≥3 мышей. Этот рисунок был изменен с разрешения Ipseiz N et ^al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Влияние инъекции лентивируса на воспаление брюшины. Мышам вводили in vivo i.p GFP, экспрессирующий лентивирус. (А) Частота инфицирования клеточных популяций в брюшной полости после различных инъекций лентивируса (50 мкл, 100 мкл, 150 мкл или 200 мкл). (B) Интенсивность экспрессии GFP в продуктивно инфицированных клеточных популяциях через 7 дней после внутримышечной инъекции. (C) Частота инфицирования клеточных популяций в брюшной полости в различные моменты времени после внутривенного введения. (D) и (E) Процент клеток в различные моменты времени после внутривенной инъекции. Все инъекции лентивируса проводили с одинаковым общим объемом 200 мкл с использованием бессывороточной среды. Если не указано иное, использовали дозу 100 мкл лентивируса. Контрольные мыши («С») получали 200 мкл чистой бессывороточной среды. Данные выражены как среднее значение ± SEM, n≥3 мышей. Этот рисунок был изменен с разрешения Ipseiz N et ^al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Мишень для антител	Флуорофор	Клон	Используемое разбавление	конечная концентрация [мкг/мл]
Основной антиген ВИЧ-1	РД1	ФН190-1-1	1/100	1
I-A/I-E	PerCpCy5.5	М5/114.15.2	1/400	0.5
Ли6Г	PerCpCy5.5	1А8	1/400	0.5
CD3e	PerCpCy5.5	17А2	1/200	1
CD3e	PE/Cy7	500А2	1/400	0.5
CD11c	PE/Cy7	Н418	1/800	0.25
CD11c	БВ605	Н418	1/400	0.5
СД226	АФ647	10 Э 5	1/400	1.25
Тим4	АФ647	РТМ4-54	1/600	0.83
СД4	БТР	ГК1.5	1/400	0.5
CD11b	АФ700	М1/70	1/700	0.71
CD11b	PerCpCy5.5	М1/70	1/400	0.5
F4/80	Тихоокеанский синий	БМ8	1/700	0.71
F4/80	БВ605	БМ8	1/400	0.25
F4/80	БВ711	БМ8	1/400	0.5
КД73	Флюор450	TY/11.8	1/400	2.5
СД19	В450	1Д3	1/400	0.5
СД19	БТР	1Д3	1/400	0.5
CD8a	Флюор450	53-6.7	1/400	0.5
SiglecF	БВ421	Е50-2440	1/400	0.5
НК1.1	БТР/CY7	ПК136	1/400	0.5
FceR1	Флюор450	МАР-1	1/400	0.5
ICAM1	ПЭ	1А29	1/100	2
Контроль изотипа крысы IgG1, κ	ПЭ		1/100	2

Таблица 1: Список антител

Обсуждение

Тканевые резидентные макрофаги выполняют ряд гомеостатических и воспалительных тканеспецифичных функций ^1,2 в зависимости от их физиологической среды ^6,7,8,9. В этом протоколе был представлен эффективный метод¹⁸ для манипулирования перитонеальными резидентными макрофагами in vivo с использованием частиц лентивируса для исследования функции макрофагов в их биологическом микроокружении.

Для успеха протокола важно использовать здоровые HEK293T клетки. Лучшей практикой является размораживание клеток по крайней мере за неделю до начала этого протокола, чтобы обеспечить восстановление клеток и хорошие показатели. Клетки должны быть засеяны в соответствующем объеме среды за сутки до планируемой трансфекции и должны достичь примерно 80% конфлюенции в день трансфекции. Недостаточное или чрезмерное слияние клеточных препаратов приведет к снижению выхода лентивируса. Для достижения наилучших результатов мы рекомендуем проводить трансфекцию HEK293T клеток реагентом для трансфекции в соответствии с инструкциями производителя. Существенными этапами трансфекции являются соответствующее смешивание плазмид и реагентов и капельное добавление смеси непосредственно в монослой HEK293T клетки. В этом протоколе может быть использована трансфекция фосфатом кальция HEK293T клеток^27,28. Тем не менее, пользователь должен знать, что эффективность этого метода может варьироваться, и это может привести к снижению эффективности трансфекции.

Меры предосторожности должны быть учтены в протоколе со дня HEK293T трансфекции клеток. К ним относятся работа в защитном шкафу категории II, ношение двойных перчаток при работе с загрязненным материалом и надлежащее отбеливание загрязненного материала (раствором для обеззараживания, например, раствором отбеливателя 2 000 ppm) в течение не менее 4 часов. Пользователи должны ознакомиться со своими институциональными регламентами в отношении работы с патогенами и отходами категории II.

В этом протоколе препарат лентивируса сначала очищается с помощью фильтра 0,45 мкм для удаления HEK293T клеточного мусора. Следует избегать использования фильтров меньшего размера (0,22 мкм) и мембран из эфира целлюлозы, так как это приведет к потере частиц лентивируса. Рекомендуется использовать фильтры полиэфирсульфона или поливинилиденфторида с низким связыванием белка²⁹. Вторая стадия очистки выполняется на одном 20% слое сахарозы в ультрацентрифуге для удаления оставшихся примесей, что особенно важно для последующего введения препарата лентивируса in vivo . В учреждениях, где ультрацентрифуга недоступна, другие³⁰ описали очистку лентивируса на основе сахарозы с помощью стандартной лабораторной центрифуги. Это может быть реализовано в данном протоколе в качестве альтернативы. Препарат лентивируса титруют в Т-клетках Jurkat в зависимости от экспрессии сигнала маркера (например, GFP, используемого в этом протоколе). Для конструкций без маркеров физические частицы лентивируса могут быть оценены путем количественного определения белка p24gag ВИЧ-1 с помощью набора^{ИФА 31}, анализа проточной цитометрии основного антигена¹⁸ ВИЧ-1 или измерения изменений в мишенном гене (предпочтительно с использованием методов, позволяющих измерять изменения в отдельных клетках, например, проточной цитометрии или микроскопии). Если титрование контроля и лентивируса существенно различаются в Т-клетках Jurkat, объемы, используемые для исследований in vivo , могут быть скорректированы таким образом, чтобы достичь наиболее сопоставимой инфекции между препаратами лентивируса.

Основным ограничением протокола является наблюдаемое исчезновение резидентного GFP⁺ перитонеального Mφ в течение 14 дней после внутривенного введения лентивируса. Для долгосрочных исследований следует рассматривать линии мышей со стабильными генетическими изменениями в определенном типе клеток или тканей³². Например, поскольку перитонеальные макрофаги не экспрессируют Foxp3 (белок T-Reg), мы использовали мышей Foxp3-DTR-eGFP³³ и подтвердили, что экспрессия GFP сохраняется в перитонеальном Mφ через 21 день после инфицирования (рис. 3F). Тем не менее, важно отметить, что лентивирусы содержат другие чужеродные компоненты, и это продление персистенции инфицированных клеток у мышей Foxp3-DTR-GFP может быть непостоянным. Дополнительным недостатком этого метода является низкий уровень воспаления, который может наблюдаться в брюшной полости после инъекции лентивируса, о чем свидетельствует приток нейтрофилов через 4 ч после инъекции (рис. 5D), что может означать, что повторные инфекции ускоряют связанную с воспалением потерю резидентного Mφ, экспрессирующего GFP. Несмотря на то, что мы не обнаружили интерферонов I типа (ИФН) в брюшной полости, ранее было продемонстрировано, что псевдотипированные лентивирусные частицы VSV-G индуцируют некоторые из стимулированных ИФН генов в человеческом Mφ в отсутствие обнаруживаемых ИФН³⁴. Это следует учитывать при использовании данного протокола в экспериментах по изучению противовирусных иммунных реакций. Возникновение острого и продолжительного воспаления после внутримышечного введения препарата лентивируса может свидетельствовать о контаминации препарата.

Области устранения неполадок включают: 1) для низкого титра лентивируса обеспечить здоровье HEK293T клеток и эффективную трансфекцию (например, экспрессию маркеров, если они присутствуют, в HEK293T клетках). Если уровень заражения остается низким, учитывайте размер конструкции. Конструкции с более крупными вставками или более сложными вторичными структурами могут влиять на итоговый титр лентивируса и инфекционность²⁴. Следовательно, каждая конструкция должна быть протестирована независимо и параллельно соответствующему вектору управления; 2) Если требуется большое количество лентивируса, рекомендуется подготовить несколько колб T175 из HEK293T клеток и соответственно масштабировать производство. Во избежание вариаций препаратов лентивируса оптимальной практикой является объединение окончательных коллекций перед аликвотированием и хранением. Для такого более крупного производства смесь плазмид (секция 2) должна быть приготовлена в пробирках объемом 50 мл, чтобы обеспечить эффективное смешивание компонентов.

Несмотря на широкий тропизм, лентивирусные частицы VSV-G с псевдотипированием преимущественно нацелены на тканевые макрофаги, как было показано ранее для альвеолы³⁵, а здесь¹⁸ для pMФ при введении соответствующими путями. Изменения оболочки частиц лентивируса могут в некоторых случаях приводить к снижению трансдукции макрофагов in vivo³⁶ и являются ненужными для данного протокола. По сравнению с другими вирусными подходами для манипулирования генами in vivo в макрофагах (рассмотрено в³⁷), использование лентивирусных векторов обеспечивает стабильную интеграцию трансгена в тканевых макрофагах³⁵, эффективную экспрессию трансгенов и наибольший предел размера вектора (приблизительно 8 Кб).

Mφ брюшины играют важную роль в профилактике, возникновении, прогрессировании и разрешении различных заболеваний, включая рак брюшной полости, панкреатит и перитонит³⁸. Этот протокол описывает эффективный инструмент для модификации генов у мышей pMφ, позволяющий исследовать биологические процессы, лежащие в основе этих патологий, в физиологически значимом микроокружении. В то время как лентивирусные векторы сами по себе становятся инструментом, представляющим интерес для клинических^{вмешательств39}, из-за происхождения из вируса иммунодефицита и стабильной интеграции генома, проблемы безопасности препятствуют их терапевтической реализации. Дальнейшее понимание реакции макрофагов на модуляцию лентивирусных генов может способствовать применению этого высокоэффективного инструмента в клинических условиях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,05% Трипсин-ЭДТА (1x) (Трипсин 500 мг/л или 0,02 мМ)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0,22 μ m стерильный millex GP фильтр	Merck	SLGS033SS
0,45 мкм; m стерильный millex GP фильтр	Merck	SLHP033RS
0,5 мл инсулиновый шприц U-100 с иглой, 0,33 мм x 12,7 мм (29 G)	BD	324892
1 литр контейнер для острых предметов	Н/Д	Н/Д
2,4G2 антитело (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320
40 μ m ситечко	Thermo Fisher Scientific	22363547
среда AimV (исследовательский класс), добавка AlbuMax	Thermo Fisher Scientific	31035025
Блокирующий буфер	приготовлен на месте
тиогликолят пивоваренной среды	Sigma-Aldrich	B2551	4% исходный раствор приготовлен в воде, автоклавирован и хранится в замороженном виде.
CD11b	Biolegend	101222	См. Таблицу 1 для разведения и концентрации
CD11b	BD	550993	Таблицу 1 для разведения и концентрации
CD11c	Biolegend	117317	Таблицу 1 для разведения и концентрации
CD11c	Biolegend	117333	С Таблицу 1 для разведения и концентрации
CD19	BD	560375	Разбавление и концентрацию
CD19	Biolegend	152410	Таблица 1 разбавление и концентрацию
CD226	Biolegend	128808	Таблица 1 разбавление и концентрацию
CD3e	BD	560527	Таблицу 1 разбавление и концентрацию
CD3e	Biolegend	152313	Разведение и концентрация
CD4	Biolegend	100412	Таблица 1 Разведение и концентрация
CD73	eBioscience	16-0731-82	Разведение и концентрация
CD8a		48-0081-82	Таблица 1 Колба
клеточной культуры (T175 fask, 175 см<суп>2, 550 мл)	Центрифуга Greiner Bio One	658175
пробирки, конические донные пробирки 25 мм x 89 мм	Beckman Coulter	358126
центрифуги	Beckman Coulter		и центрифуга TC
Коллагеназа типа IV	Sigma-Aldrich	C5138
Конические центрифуги (15 мл и 50 мл)	Greiner Bio One	11512303 и 11849650
Криопробы	Greiner Bio One	123277	или криопробы
DMEM medium (1x) + 4,5 г/л D-глюкозы, 400 &; M L-глютамин	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Effecten трансфекционный реактив	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	Разведение и концентрацию
F4/80	Biolegend	123133 см	1
F4/80	Biolegend	123147	См. Таблицу 1 для разведения и концентрации
FceR1	eBioscience	48-5898-80	См. Таблицу 1 для разведения и концентрации
Фетальная телячья сыворотка (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	с тепловой инактивацией на 30 мин при 56 °°; С и стерильные фильтруются через 0,22 мкм; m фильтр
Проточный цитометр	Thermo Fisher Scientific	Attune NxT
Проточная цитометрия (FACS)	приготовленный на месте
Флуоресцентный микроскоп для культуры тканей	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Щипцы	Н/	Д Н/Д Н/Д	Предпочтения пользователя
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
HEK293T клеточная линия			выращено не менее чем за неделю до трансфекции. Основной
антиген ВИЧ-1	Beckman Coulter	6604667
гиалуронидазы	Sigma-Aldrich	H3506
Hydrex хирургический скраб, хлоргексидинг глюконат 4% w/v средство для очищения кожи	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	См. Таблицу 1 для разведения и концентрации
ICAM1	Becton Dickinson	554970	В таблице 1 приведены данные о разведении и концентрировании
Т-клеточной линии			выращенной по крайней мере за неделю до использования. Набор
окрашивания мертвых клеток в ближнем инфракрасном диапазоне	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	См. таблицу 1 для разведения и концентрации
мышей			здесь использовали C57BL/6 самок в возрасте 8-12 недель (Чарльз Риверс), если не указано иное
Микрокапиллярные пипетки (диапазон объема 0,5-1,000 мкм; L)	Fisher Scientific & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	см. Таблицу 1 для разбавления и концентрации
параформальдегида	Sigma-Aldrich	P6148-500G	полученного до 2% по объему в PBS
pCMV-Δ Плазмида упаковки R8.91	Zuffrey, R., et al. 1997		Устойчивость к ампицилину.
Пенициллин/стрептомицин (100x, 10 000 ЕД/мл)	Thermo Fisher Scientific	15140122
чашке	Петри чашка Greiner Bio One	664160
pHR'SIN-cPPT-SEW плазмида		Rosas, M. et al. 2014	модифицирована для исследований экспрессии shRNA и miR. Кодирует маркер EGFP после промотора SFFV и выше усилителя вируса гепатита Woodchuck. Устойчивость к ампицилину.
Плазмида pMD2.G	Naldini, L. et al. 1996		Устойчивость к ампицилину.
Крыса IgG1, κ контроль изотипа	Becton Dickinson	550617	См. Таблицу 1 для разведения и концентрации
Сыворотка крысы	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
Красная кровь ACK лизис	буфер приготовлен в домашних
условиях RPMI 1640 среда (1x) + 400 мкМ L-глутамин	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Сапонин	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	См. Таблицу 1 для разбавления и концентрации
Таблетки гипохлорита натрия (отбеливатель, 2,000 ppm)	Guest Medical	H8818
Стерильный 24-луночный планшет для культивирования клеток	Greiner Bio One	662160
Стерильный PBS Дульбекко (DPBS) (1x) Mg++ и Ca2+ - бесплатно	Thermo Fisher Scientific	14190144
стерильные ЭДТА	Thermo Fisher Scientific	15575020
стерильные одноразовые переносные пипетки VWR (23,0 мл, 30 см)	VWR	612-4515
Сахароза	Thermo Fisher Scientific	15503022
хирургические ножницы	н/д	/д н/д	Пользовательские настройки
Шприцы (50 мл и 1 0 мл)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	см. таблицу 1 для разбавления и концентрации
U-образного дна 96-луночной клеточной культуральной пластины	Greiner Bio One	650180