Высокоскоростной магнитный пинцет для наномеханических измерений на чувствительных к силе элементах

Клетки активно ощущают и реагируют на механические раздражители. При этом многие биомолекулы проявляют силовые свойства, которые обеспечивают динамические структурные изменения. Хорошо оцененные примеры включают механочувствительные ионные каналы и цитоскелетные элементы, которые обеспечивают клетки ключевой механической информацией из окружающей среды.

Кроме того, молекулы, обладающие уникальной силовой природой, также можно считать механочувствительными в более широком смысле. Например, локальное образование и плавление дуплексов нуклеиновых кислот, а также структур более высокого порядка, таких как G-квадруплексы, играют решающую роль в репликации, транскрипции, рекомбинации и, в последнее время, редактировании генома. Более того, некоторые нейронные белки, участвующие в синаптических коммуникациях, выполняют свои функции, генерируя физические силы, которые превышают уровни типичных межмолекулярных взаимодействий. Независимо от того, на каком примере вы проводите исследование, изучение наномеханики вовлеченных биомолекул с высокой пространственно-временной точностью окажется очень полезным для выявления молекулярных механизмов связанных с ними механобиологических процессов ^1,2,3.

Методы одномолекулярной силовой спектроскопии послужили мощными инструментами для изучения механических свойств биомолекул 2,4,5,6. Они могут отслеживать структурные изменения в нуклеиновых кислотах и белках одновременно с приложением силы, тем самым исследуя силозависимые свойства. Двумя хорошо известными установками являются оптический пинцет и магнитный пинцет (МТ), в которых используются шарики микронного размера для манипулирования молекулами ^5,6,7,8. В этих платформах полистирол (для оптического пинцета) или магнитные шарики (для МТ) привязаны к молекулам-мишеням (например, нуклеиновым кислотам и белкам) через молекулярные «ручки», обычно состоящие из коротких фрагментов двухцепочечной ДНК (дцДНК). Затем шарики перемещаются, чтобы приложить силу, и визуализируются, чтобы отслеживать их местоположение, которые сообщают о структурных изменениях в молекулах-мишенях. Оптический и магнитный пинцет в значительной степени взаимозаменяемы в своих применениях, но существуют важные различия в их подходах к управлению силой. Оптический пинцет по своей сути представляет собой инструменты с позиционным зажимом, которые захватывают шарики в нужном положении, из-за чего приложенная сила колеблется, когда целевая конструкция претерпевает изменения формы; Увеличение растяжения, например, от раскладывания, ослабляет трос и снижает натяжение, и наоборот. Хотя активная обратная связь может быть реализована для управления силой в оптических пинцетах, MT, напротив, естественным образом работают как устройство силового зажима, используя преимущества стабильных магнитных сил в дальней зоне постоянными магнитами, которые также могут выдерживать возмущения окружающей среды.

Несмотря на свою долгую историю и простую конструкцию, МТ отстают от оптических пинцетов в их приложениях для высокоточных измерений, в основном из-за технических проблем с быстрым отслеживанием шариков. Однако в последнее время несколько групп совместно провели многогранное совершенствование как аппаратного, так и программного обеспечения для приборов машинного перевода 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . В этой работе мы представляем пример такой установки, работающей на частоте 1,2 кГц, и описываем, как использовать ее для выполнения наномеханических измерений на чувствительных к силе биомолекулах. В качестве модельных систем мы используем шпильки ДНК и нейрональные комплексы SNARE и исследуем их быстрые структурные изменения в режиме пиконетона. Шпильки ДНК демонстрируют простые переходы с двумя состояниями в четко определенном диапазоне сил^20,21 и, следовательно^, служат игрушечными моделями для проверки работоспособности установки пинцета. Поскольку белки SNARE собираются в чувствительный к силе комплекс, который управляет слиянием мембран²², они также были тщательно изучены с помощью одномолекулярной силовой спектроскопии 14,23,24,25. Представлены стандартные подходы к анализу данных и извлечению полезной информации по термодинамике и кинетике. Мы надеемся, что эта статья может способствовать внедрению высокоточных МТ в механобиологические исследования и мотивировать читателей исследовать свои собственные чувствительные к силе системы, представляющие интерес.

Все материалы и оборудование, описанные в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов. Программное обеспечение LabVIEW для работы с высокоскоростной установкой машинного перевода, описанной ниже, а также скрипты MATLAB для анализа демонстрационных данных размещены на GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) и находятся в открытом доступе.

1. Конструкция аппарата

ПРИМЕЧАНИЕ: Общий принцип построения высокоскоростного МТ аналогичен стандартным, обычным системам МТ, за исключением использования высокоскоростной комплементарной камеры на основе металл-оксидного полупроводника (КМОП) и мощного когерентного источника света (рис. 1). Обратитесь к другим источникам для получения более подробной информации о стандартных приборах МТ 5,26,27.

1. Установите инвертированный микроскоп на антивибрационный оптический стол. Установите высокоскоростную CMOS-камеру и фреймграббер.
2. Постройте сцену перевода для манипулирования магнитами в 3D. Установите моторизованный линейный столик (ход >20 мм) вертикально поверх ручного столика XY.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вертикальное движение управляет усилием, тогда как ступень XY предназначена для ручного выравнивания магнитов по оптической оси для первоначальной сборки установки.
3. Установите роторный шаговый двигатель и систему ремней и шкивов для вращающихся магнитов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ремень передает вращательное движение между валом двигателя и магнитами, находящимися на расстоянии нескольких сантиметров друг от друга. Вращение магнитов является внутренним для поступательной манипуляции.
4. Установите магниты. Используйте акриловый держатель (заказанный у компании-производителя; см. дополнительный рисунок S1), который может плотно разместить два одинаковых магнита параллельно, с четко определенным зазором 1 мм между магнитами (рис. 1B). Чтобы использовать максимальное усилие, достижимое с данной парой магнитов, отрегулируйте вертикальное положение подвижного столика так, чтобы нижняя поверхность магнитов совпадала с плоскостью образца при перемещении в самое нижнее положение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Lipfert et al. для получения дополнительной информации о конструкции держателя и конфигурации^{магнитов 28}. Высота и ориентация магнитов контролируются программным обеспечением LabVIEW в сочетании со сбором данных.
5. При просмотре с помощью объектива с малым увеличением выровняйте магниты по центру поля зрения. Убедитесь, что вращение магнитов не вызывает большого смещения центра пары магнитов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если средняя точка между магнитами вращается вокруг оси вращения, вполне вероятно, что магниты смещены от центра из-за несовершенного держателя. Небольшой уровень смещения по отношению к размеру зазора допустим, так как вращение магнита предназначено только для проверки тросов и приложения крутящих моментов в определенных приложениях.
6. Установите суперлюминесцентный диод (SLD) для подсветки бусин. Пропустите луч через зазор 1 мм между двумя магнитами. Убедитесь, что луч правильно коллимирован, чтобы поместиться в зазоре, и освещение не затеняется магнитами.
7. Установите пьезосканер на наконечник и установите объектив с 100-кратным погружением в масло (числовая апертура [NA]: 1,45) для отслеживания борта. Чтобы избежать потенциальных артефактов в результатах отслеживания, убедитесь, что освещение поддерживается равномерно при перемещении магнитов. Наконец, отрегулируйте уровень освещенности до максимальной яркости без насыщения пикселей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения различных источников света для высокоскоростного слежения за шариками см. Dulin et ^al.29.

2. Калибровка магнитной силы

1. Используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР; см. Таблицу 1), подготовьте 5 фрагментов дцДНК kbp (с использованием праймера B, праймера Z_5k и λ-ДНК), которые помечены биотином на одном конце (для поверхностного прикрепления) и азидом на другом конце (для прикрепления шариков).
2. Следуя разделу 6, подготовьте проточную ячейку с молекулами 5 kbp.
3. Следуя разделу 7, определите хорошую конструкцию бортового троса, проверив ее удлинение и вращение. В частности, обязательно выбирайте валик с минимальной траекторией вращения (т.е. с радиусом <200 нм), чтобы минимизировать смещение высоты валика из-за нецентрированного крепления^30,31. Как только хороший трос будет идентифицирован, начните отслеживание борта, ссылаясь на раздел 9.
4. Если установка новая, охарактеризуйте ее шум и стабильность для надежных измерений с высоким разрешением. Поместите магнит на расстоянии ~ 3 мм от поверхности проточной ячейки (чтобы применить >10 пН и подавить броуновское движение шарика), отследите z-положение шарика на частоте 1,2 кГц и вычислите отклонение Аллана (AD) от z-координатного временного ряда^32,33 (рис. 2C). Убедитесь, что значения AD в несколько нанометров достижимы в высокоскоростном режиме (<0,1 с) и что дифференциальное отслеживание (положение магнитного валика относительно эталонного валика) снижает AD в более длительном временном масштабе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы получаем AD <3 нм при максимальной частоте (разрешение 1,2 кГц или 0,83 мс), а AD продолжает уменьшаться, по крайней мере, до 10 с, что подразумевает минимальный дрейф. Другие сообщили об аналогичных значениях на аналогичных установках 9,10,11,12,34.
5. С магнитами в положении покоя (F ~ 0 pN) запишите координаты x и y привязанного шарика на частоте 1,2 кГц. Запишите положение в течение достаточно длительного периода (т. е. достаточно большего, чем характерное время релаксации флуктуации³⁵), чтобы броуновское движение было достаточно выборизировано.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь направление x соответствует направлению магнитного поля, тогда как движение в y представляет собой поперечное движение, перпендикулярное полю.
6. Переместите магниты ближе к проточной ячейке и повторяйте измерения положения шарика, пока магниты не коснутся верхней части проточной ячейки. Двигайтесь большими шагами (например, 1-2 мм), когда магниты находятся на расстоянии более 7 мм от плоскости образца (поскольку приложенная сила медленно увеличивается в дальнем поле магнитов), но постепенно уменьшайте размер шага (например, 0,1-0,5 мм) по мере приближения для более точной калибровки при более высоких уровнях силы (рис. 2B).
7. Рассчитайте силу в каждом положении магнита, d, используя любой из двух альтернативных методов (предоставляется сценарий MATLAB «калибровка силы.m», включающий оба метода; см. Дополнительный файл 1).
   1. Измерьте дисперсию y-координат бусины (рис. 2D) и среднее z-положение бусины относительно самого низкого положения (рис. 2B, внизу). Затем используйте уравнение (1)7,27,36 для оценки силы (с фиксированным радиусом валика R = ^1,400 нм и тепловой энергией k _RT = 4.11 пН∙нм):
      (1)
   2. В качестве альтернативы можно рассчитать спектральную плотность мощности (PSD) y-координат S_y (рис. 2E). Определите приложенную силу F, подгонив двойную лоренцеву модель³⁷ к измеренному S_y с помощью уравнения (2).
      (2)
      Здесь , R — радиус валика, γ _yи γ_φ — коэффициенты поступательного и вращательного сопротивления соответственно (оцениваемые по уравнению Стокса-Эйнштейна), _{k R}T — тепловая энергия, f₊ и f_- две характеристические частоты, полученные с помощью уравнения (3).
      (3)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку удлинитель троса L является функцией силы, которая следует хорошо зарекомендовавшей себя модели червячной цепи (WLC), приведенные выше выражения оставляют F в качестве единственного подходящего параметра (для простоты мы устанавливаем R равным 1,400 нм, потому что он распределяется по всем уровням силы, и точное значение не оказывает заметного влияния на результаты). При необходимости размытие при движении и сглаживание при получении изображения с помощью камеры должны рассматриваться как^38,39, но этот эффект незначителен в наших высокоскоростных измерениях выше 1 кГц с привязями 5 кбит/с.
8. Повторите шаги 2.4-2.7 для еще нескольких конструкций. Исследуйте от трех до пяти различных шариков, чтобы усреднить изменчивость силы между магнитными шариками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение силы между используемыми магнитными шариками следует учитывать для определения правильного количества конструкций для усреднения. Эта изменчивость невелика, но может привести к погрешности измеряемой силы более чем на 1 пН даже для коммерческих продуктов³¹. Для большинства применений, где абсолютное определение задействованных сил не имеет решающего значения, обычно достаточно усреднения результатов калибровки трех-пяти шариков. Альтернативный подход к учету этого изменения заключается в измерении силы с помощью отдельных тросов в начале эксперимента, что может занять много времени. Другой вариант состоит в том, чтобы встроить шпильки, которые распаковываются на известных уровнях силы в каждую конструкцию³¹.
9. Построите график измеренной силы в зависимости от расстояния до магнита и подгоните двойную экспоненциальную функцию к данным (рис. 2F), используя уравнение (4).
   (4)
   Здесь F₀ (базовая линия), A 1 и A 2 (амплитуды) и d ₁ и d₂ (константы распада) являются подходящими параметрами. Убедитесь, что значения силы из двух методов, а также результирующие двойные экспоненциальные подгонки в значительной степени совпадают (рис. 2F, G).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что калибровка силы выполнена правильно, проверьте соотношение силы и удлинения зондируемых конструкций, построив график зависимости удлинения от измеренной силы.
10. Чтобы скорректировать смещение высоты валика z_{в результате} зависящего от силы наклона магнитных шариков^30,31, оцените z от бокового смещения x_off, учитывая геометрию смещенного_от центра троса с радиусом валика^, используя уравнение (5), и примените значения к измеренным значениям расширения. Этот шаг реализован в скрипте MATLAB "force calibration.m" (строки 252-254).
    (5)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что эта поправка вносит небольшие изменения в удлинение, особенно для шариков с малым радиусом вращения (<200 нм), это смещение часто критически влияет на упругий отклик, как видно из перехода от рисунка 2H к рисунку 2I^30,31.
11. Проверьте длину персистенции L_p , подгонив расширяемую модель WLC к данным с помощью уравнения (6).
    (6)
    Здесь L₀ — длина контура (1,7 мкм для 5 кбит/с), а K₀ — модуль энтальпического растяжения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что L p дцДНК хорошо принят как 40-50 нм в типичном буфере, таком как фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), формула WLC, применяемая к коротким молекулам (<5 kbp), систематически недооценивает L _p, поскольку L₀ уменьшается^{на 31,40}. Это связано с тем, что классическая модель WLC предполагает полимер, длина цепи которого достаточно больше, чем длина его стойкости. Здесь мы получили L_p = 40 ± 3 нм для конструкции 5 kbp (рис. 2H), а поправка на расширение в дальнейшем дала однородный K₀ от 1,100 ± 200 пN (рис. 2I). Применение конечной модели^{WLC 31,40,} а также поправки на негауссованность в распределении^{расширения 41} несколько увеличит L_p.
12. После проверки калибровки силы примените полученные параметры подгонки двухэкспоненциальной модели к предоставленному программному обеспечению LabVIEW (дополнительный файл 2) и подождите, пока программное обеспечение вычислит текущую силу в режиме реального времени по показаниям двигателя (т. е. положению магнита). Поскольку аналитическое выражение для обратной функции d(F) недоступно, подготовьте справочную таблицу d по сравнению с F с шагом 0,1 пН путем численной оценки целевых уровней силы d. Сохраните эту таблицу в программном обеспечении, чтобы управлять управлением усилием.

3. Синтез ДНК шпилек

ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкции шпилек ДНК для экспериментов МТ получают путем ПЦР-амплификации области 510.н. в λ-ДНК с двумя пользовательскими праймерами, один из которых содержит структуру шпильки на своем 5'-конце (рис. 3A). Таким образом, мотив шпильки помещается на один конец продукта ПЦР.

1. Подготовьте грунтовки.
   1. Прямой праймер: Праймер B_hp, который мечен 5'-биотином для прикрепления поверхности стекла и связывается с λ-ДНК. Этот праймер содержит мотив шпильки со стержнем 8.н. и петлей 6 нт, 5 футов до области λ-связывания.
   2. Обратный праймер: Праймер Z_hp, помеченный 5'-азидом для магнитного крепления шариков и связывающийся с λ-ДНК на расстоянии 1 кбп от прямого праймера.
2. Настройте и запустите ПЦР с λ-ДНК (матрицей), nTaq-полимеразой и стандартными условиями ПЦР (см. Таблицу 1). Очистите продукт с помощью коммерческого набора для очистки.
3. Измерьте концентрацию ДНК путем поглощения ультрафиолета на длине волны 260 нм (A260) и выполните электрофорез в агарозном геле (2% гель) (см. Таблицу 2), чтобы проверить размер продукта. Типичный выход составляет ~ 35 мкл раствора ~ 600 нМ.

4. Получение белков SNARE

ПРИМЕЧАНИЕ: Нейрональные комплексы SNARE собираются путем объединения трех очищенных белков крысы, экспрессируемых из кишечной палочки: VAMP2 / синаптобревин-2, синтаксин-1A и SNAP-25 (рис. 3B). Чтобы облегчить их сборку, синтаксин и SNAP-25 экспрессируются совместно с фрагментом VAMP2 (без N-концевой области; называемой «ΔN-VAMP2») в структуру, называемую «ΔN-комплексом», а затем смешиваются с полноразмерным VAMP2 после присоединения ДНК с образованием полных комплексов.

1. Подготовьте плазмиды, содержащие кДНК, для экспрессии белков SNARE (последовательности ДНК для всех плазмид приведены в таблице материалов).
   1. Подготовьте 6× VAMP2 с тегом His, у которого отсутствует трансмембранный домен (2-97; L32C/I97C для дисульфидных связей) клонирован в вектор pET28a.
   2. Подготовьте синтаксин-1А, в котором отсутствует Habc и трансмембранный домен (замены 191-267, I202C/I266C для дисульфидных связей), клонированный вместе с 6×His-меченым ΔN-VAMP2 (49-96) в вектор pETDuet-1.
   3. Подготовьте полноразмерную изоформу b SNAP-25 (2-206, все от C до A), клонированную в вектор pET28a. Это будет использовано для подготовки комплексов ΔN.
   4. Подготовьте полноразмерную изоформу b SNAP-25 с 6×тегом HIS (1-206, все от C до A), клонированную в вектор pET28a, для прямого добавления в буфер анализа MT для повторной сборки комплексов SNARE после развертывания.
2. Подготовьте две пробирки с клетками Rosetta (DE3) E. coli . Трансформируйте одну группу плазмидами VAMP2 (из шага 4.1.1), одну с синтаксином-1A/ΔN-VAMP2 и немечеными плазмидами SNAP-25 (из этапов 4.1.2 и 4.1.3) для экспрессии ΔN-комплекса, а другую с помощью плазмид SNAP-25 с тегом His (из шага 4.1.4).
3. Перенесите трансформированные клетки в бульон Лурия-Бертани (LB) с соответствующими антибиотиками (здесь канамицин и хлорамфеникол для VAMP2 и SNAP-25 с тегом His; канамицин, хлорамфеникол и ампициллин для ΔN-комплекса). Выращивают их при 37 °C в встряхивающем инкубаторе (220 об/мин) до тех пор, пока оптическая плотность (OD) бульона не достигнет 0,7-0,9.
4. Добавьте 1 мМ изопропил β-d-1-тиогалактопиранозид (IPTG) для индукции экспрессии белка и инкубируйте клетки в течение 3-4 ч при 37 ° C в встряхивающем инкубаторе (220 об/мин).
5. Гранулируют клетки центрифугированием культуры при 4 500 × г в течение 15 мин при 4 ° C.
6. Подготовьте буферы для очистки белка (см. табл. 2).
7. Суспендировать клеточные гранулы, экспрессирующие SNARE, в 40 мл ледяного буфера лизиса и лизировать клетки ультразвуком на льду (амплитуда 15%, 5 с включена и 5 с выключена, всего 30 минут).
8. Центрифугируют лизат при 15 000 × г в течение 30 мин при 4 °C для удаления нерастворимых материалов.
9. Пропустите надосадочную жидкость через гравитационную колонну, заполненную 1 мл смолы Ni-NTA. Промойте смолу промывочным буфером A, затем промывочным буфером B и разбавьте белки 10 мл элюирующего буфера.
10. Удалите трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP) и имидазол из элюента с помощью обессоливающей колонны (следуйте инструкциям производителя). Разбавьте образец PBS.
11. Сконцентрируйте белки с помощью центробежных фильтров (отсечка 10 кДа) до ~ 70 мкМ, сохраняя при этом белки в PBS (обычно с получением 2 мл). Измерьте концентрацию белка либо с помощью ультрафиолетового (УФ) поглощения на длине волны 280 нм (A280), либо с помощью анализа Брэдфорда.
12. Приготовьте небольшие аликвоты, заморозьте в жидком азоте и храните при температуре -80 °C до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полные комплексы SNARE будут собраны после конъюгации ΔN-комплекса на ручке ДНК (см. ниже).

5. Прикрепление дескрипторов ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Две ручки дцДНК 510.н., содержащие первичные аминогруппы на одном конце, сначала подготавливают с помощью ПЦР, а затем аминогруппы превращают в малеимидные группы с помощью бифункционального сшивающего агента SM (PEG) ₂. Затем две ручки ковалентно связываются с комплексами SNARE через их цистеиновые группы для сайт-специфической конъюгации (рис. 3B).

1. Подготовьте грунтовки.
   1. Подготовьте прямые праймеры: праймер B (для амплификации ручки B), который мечен 5'-биотином для прикрепления к поверхности стекла и связывается с λ-ДНК; Праймер Z (для усиления рукоятки Z), помеченный 5'-азидом для крепления магнитных шариков и имеющий ту же последовательность, что и праймер B.
   2. Подготовьте обратный праймер: праймер N (общий для ручки B и ручки Z), который мечен 5'-амином для конъюгации белка и связывается с λ-ДНК на расстоянии 510.н. от прямого праймера.
2. Настройте и запустите два набора ПЦР-реакций (18 пробирок по 200 мкл для каждой ручки) с λ-ДНК (матрицей), nTaq-полимеразой и стандартными условиями ПЦР (см. Таблицу 1). Очистите продукт с помощью набора для очистки ПЦР и промойте каждую ручку 45 мкл сверхчистой воды. Используйте минимальный объем воды, чтобы получить высокую концентрацию ручек для эффективной реакции на последующих этапах.
3. Измерьте концентрацию ДНК с помощью A260. Типичный выход составляет ~ 650 мкл раствора ~ 2 мкМ для каждой ручки. Держите небольшие образцы отдельно друг от друга для последующей проверки при электрофорезе в агарозном геле.
4. Реагируйте на каждую рукоятку (1 мкМ в PBS) с 5 мМ SM(PEG)₂. Инкубировать при комнатной температуре при аккуратном вращении. Через 1 ч используйте набор для очистки ДНК для удаления непрореагировавшего SM(PEG)₂. Облейте каждую ручку 250 мкл PBS для получения ~ 2 мкМ растворов.
5. Смешайте растворы Handle B и ΔN-комплекса в молярном соотношении 1:16 (например, 1 мкМ Handle B и 16 мкМ ΔN-комплекса) в PBS и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре с перемешиванием. Держите отдельно небольшой образец для электрофореза в агарозном геле.
6. Добавьте раствор VAMP2 в 2,5-кратном молярном избытке над ΔN-комплексом, используемым на предыдущем этапе. Выдерживают смесь еще 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. На этом этапе собираются полные комплексы SNARE.
7. Удалите свободные белки путем буферного обмена со свежим PBS и центробежным фильтром (отсечка 100 кДа): центрифуга при 14 000 × г в течение 5 мин при 4 °C, повторить не менее 6 раз и запустить в течение 15 мин для последнего отжима. Измерьте увеличение соотношения A260/A280, чтобы контролировать удаление свободных белков. Держите отдельно небольшой образец для электрофореза в агарозном геле.
8. Добавьте ручку Z в раствор в 15-кратном молярном избытке над ручкой B. Поддерживайте концентрацию ручки Z по крайней мере выше 1 мкМ, чтобы облегчить реакцию. Инкубируйте смесь в течение ночи при температуре 4 °C при перемешивании.
9. Проверьте промежуточные продукты (ручка B и ее белковые конъюгаты) и конечный продукт (комплекс SNARE с двумя ручками) с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 3B, вставка) (см. Таблицу 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если белки успешно прикреплены к ручке B, будет обнаружен сдвиг подвижности. В частности, образование полных комплексов SNARE на ручках ДНК может быть подтверждено их устойчивостью к додецилсульфату натрия (SDS), в отличие от ΔN-комплексов, которые разбираются в SDS и оставляют только синтаксин, связанный с ДНК (сравните b и c на рисунке 3B).
10. Приготовьте небольшие аликвоты, заморозьте в жидком азоте и храните при температуре -80 °C до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что окончательный раствор содержит непрореагировавшие ручки, во время сборки образца в проточной ячейке будет выбрана только искомая конструкция, дважды меченная биотином и азидом.

6. Изготовление проточных ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Проточные ячейки для измерений МТ изготовлены из двух стеклянных покровных стекол, соединенных между собой двусторонним скотчем (рис. 3C). Одно покровное стекло покрыто смесью ПЭГ и биотинилированного полиэтиленгликоля (ПЭГ), чтобы избежать неспецифического связывания и обеспечить специфическую привязку молекул-мишеней через связь биотин-нейтравидин (рис. 3D). Затем растворы материалов для экспериментов МТ последовательно вливаются в проточную ячейку с помощью шприцевого насоса (рис. 3C, D).

1. Подготовьте два стеклянных покровных стекла, по одному для верхней (24 мм × 50 мм, толщина No 1,5) и нижней (24 мм × 60 мм, толщина No 1,5) поверхности. Очистите покровные стекла ультразвуком в 1 м КОН в течение 30 минут. После обработки ультразвуком промойте покровные стекла дистиллированной водой и держите в воде до следующего шага.
2. ПЭГилатировать нижнее покровное стекло в соответствии с опубликованными протоколами^42,43. Используйте N- [3- (триметоксисилил) пропил] этилендиамин для силанизации и смесь биотина-ПЭГ-SVA и mPEG-SVA 1:100 (ww) в 100 мМ бикарбонатном буфере. Держите ПЭГилированные покровные стекла сухими при температуре -20 °C и храните их в течение нескольких недель.
3. В день экспериментов выньте ПЭГилированные покровные стекла и высушите их феном с помощью азотного пистолета. Визуально осмотрите их на наличие грязи, чтобы убедиться, что они чистые.
4. Чтобы сделать каналы для образцов, подготовьте полоски двустороннего скотча шириной ~2 мм и положите четыре полоски на нижнее покровное стекло (ПЭГилированная поверхность вверх), параллельные друг другу и отделенные друг от друга ~5 мм (рис. 3C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, в одной проточной ячейке можно создать три канала для образцов шириной 5 мм.
5. Поместите верхнее защитное стекло в центр нижнего покровного стекла, оставив ~ 5 мм пространства на коротких краях для входных и выходных отверстий каналов. Аккуратно прижмите пинцетом заднюю часть верхнего покровного стекла, чтобы надежно закрыть каналы.
6. Чтобы сделать впускной резервуар, обрежьте край наконечника пипетки объемом 200 мкл. Вырежьте ~ 10 мм из более широкого отверстия, чтобы обеспечить удержание ~ 200 мкл раствора. Сделайте три из них для трех каналов потока. Чтобы настроить выпускные отверстия, подготовьте три иглы для шприца, которые подходят к трубке для шприцевого насоса.
7. Используя 5-минутную эпоксидную смолу, приклейте резервуары и игольчатые ступицы к проточной ячейке. Убедитесь, что сформировано полное уплотнение, чтобы избежать утечки, и что каналы не заблокированы излишками клея. Дайте ему высохнуть не менее 30 минут.

7. Сборка бортовых тросовых конструкций

ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы материалов для экспериментов МТ, в том числе для конструкций бортовых тросов, последовательно вводятся в проточные ячейки с помощью шприцевого насоса (рис. 3C, D).

1. Подготовьте магнитные бусины. Возьмите 5 мг шариков M270-эпоксидной смолы из исходного раствора (~ 3,3 × 10 шариков⁸ в 167,5 мкл диметилформамида) и замените растворитель фосфатным буфером (см. Таблицу 2) путем магнитной сепарации шариков.
2. Подготовьте шарики при ~ 1,1 × 10⁹ шариках мл-1 в фосфатном буфере с 1 М сульфатом аммония и вступите в реакцию с 2 мМ дибензоциклооктина (DBCO)^-_NH2. Выдерживают смесь в течение 3 ч на вращающемся миксере при комнатной температуре. После реакции промойте шарики 3 раза свежим фосфатным буфером, чтобы удалить непрореагировавшие молекулы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вымытые шарики можно хранить без дополнительного вращения при температуре 4 °C в течение нескольких недель перед использованием.
3. Подсоедините иглу на выходе проточного канала к шприцевому насосу с помощью полиэтиленовой трубки. Уравновесьте каналы с помощью PBS.
4. Последовательно вводите в канал путем всасывания с помощью насоса следующие растворы: NeutrAvidin, целевые конструкции (шпильки ДНК или комплексы SNARE с ручками ДНК), эталонные полистирольные шарики и магнитные шарики с покрытием DBCO. Перед использованием тщательно перемешайте растворы шариков, чтобы диспергировать потенциальные агрегаты шариков.
5. Смойте несвязанные шарики, приложив 0,1 пН силы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приложение небольшой силы, направленной вверх, облегчает удаление несвязанных шариков и помогает избежать разрыва специально связанных конструкций бортового троса.
6. Для экспериментов с комплексами SNARE включите 1,5 мкМ SNAP-25 в конечный буфер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Свободные молекулы SNAP-25 могут повторно связывать комплексы SNARE после развертывания и позволяют проводить повторные измерения на одном комплексе.

8. Идентификация целевых конструкций

1. На поверхности канала проточной ячейки найдите магнитные шарики, которые привязаны к одиночным молекулам целевой конструкции. Убедитесь, что рядом находится эталонная бусина.
2. Поверните бусину-кандидата и убедитесь, что она свободно вращается. Если шарик привязан к нескольким молекулам, он проявляет ограниченное движение.
3. Вращайте бусину на несколько полных оборотов и узнайте радиус вращения (эта функция реализована в предусмотренном программном обеспечении). Желательно выбирать бусину с небольшим радиусом вращения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот радиус показывает, насколько валик смещен от центра оси троса, что случайным образом определяется при сборке борт-трос^30,31. Во всех экспериментах минимальное смещение бусины по центру смягчает многие артефакты, связанные с большим отношением радиуса валика к удлинению троса, которое мы используем.
4. Увеличьте усилие от 0 до 5 пН, чтобы определить хорошие бусины с одной привязью. Обратите внимание на большое изменение дифракционной картины бусины, возникающее в результате растяжения троса со скоростью 1 кбит/с (или эквивалентных двух ручек с частотой 510.н.). Если дифракционная картина существенно не изменится, уменьшите силу до нуля и найдите другой валик-кандидат.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подъем бусины ~ 300 нм можно легко заметить по необработанным изображениям без фактического запуска процесса отслеживания.

9. Отслеживание борта для измерений удлинения

ПРИМЕЧАНИЕ: Отслеживание бусин осуществляется путем анализа изображений бусин в режиме реального времени в программном обеспечении LabVIEW, поставляемом с этой статьей. Метод слежения и его варианты использовались в большинстве традиционных систем МТ и объяснялись в предыдущей литературе 2,5,7,26. Измеряя положение магнитного шарика относительно неподвижного эталонного валика (т. е. дифференциальное отслеживание), измерения положения становятся чрезвычайно устойчивыми к внешнему возмущению.

1. После того, как подходящая магнитная бусина будет расположена вместе с эталонной бусиной, нажмите кнопку «Калибровка », чтобы начать подготовку к отслеживанию бусин.
2. Нажмите на бусины на изображении, чтобы определить расположение бусин. Затем изображения будут обрезаны до областей интереса (ROI) (например, 150 x 150 пикселей для бусины 3 мкм) вокруг бусин, а затем дополнительно проанализированы для извлечения точных координат бусин.
3. Дождитесь завершения вращения магнита. Этот процесс записывает x- и y-координаты валика (путем вычисления 2D-перекрестной корреляции⁴⁴ или с использованием радиальной симметрии⁴⁵ изображений валика с сопоставимой производительностью) при вращении магнитов для документирования смещенного от центра прикрепления^{валика 31}.
4. Для слежения в направлении z дождитесь, пока программа сгенерирует справочную таблицу дифракционных изображений бусин на разных расстояниях от фокальной плоскости. Это осуществляется путем ступенчатого перемещения линзы объектива с помощью пьезосканера с равноудаленными шагами и записи усредненных по флуктуациям изображений шариков в каждом положении. Затем z-координаты бусин в реальных экспериментах определяются путем сравнения изображений бусин в реальном времени с таблицей поиска с интерполяцией⁷.
5. Когда генерация справочных таблиц будет завершена, включите слежение и автофокусировку (нажмите кнопки Track ? и AF? Buttons) и нажмите кнопку «Получить », чтобы начать запись положения бусин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Автофокусировка не является обязательной, но рекомендуется для коррекции дрейфа ступени в z во время съемки.

10. Схемы принудительного применения

1. Эксперименты с наращиванием силы: Чтобы проверить соотношение силы и удлинения конструкции, примените увеличение силы вверх и вниз с постоянной скоростью нагрузки (± 1,0 пН ^с-1) (рис. 4A). Например, примените три раунда цикла 0-20-0 pN, чтобы проверить общую длину конструкции и кривую разгибания усилия ручек.
2. Указав параметры троса в программном обеспечении, наложите кривую силового удлинения WLC поверх измеренных данных и определите, привязан ли целевой шарик подлинной конструкцией образца с правильными ручками ДНК. В качестве отправной точки используйте известную длину контура (например, ~340 нм для дцДНК 1 кбит/с) и длину персистенции WLC (30-45 нм для короткой дцДНК³¹). При необходимости примените метод коррекции расширения, описанный в шаге 2.11.
3. Если конструкция проверена, подробно изучите реакцию силы-расширения, чтобы найти дополнительное расширение, возникающее в результате молекул-мишеней-шпилек или комплексов SNARE.
4. Эксперименты с постоянной силой: Постепенно изменяйте приложенную силу дискретными шагами, чтобы исследовать силовую чувствительность молекул-мишеней (рис. 4B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: МТ позволяют проводить простые и эффективные эксперименты с постоянной силой, потому что приложенная сила поддерживается постоянной, когда магниты удерживаются неподвижно.
   1. Для шпилек ДНК приложите усилие 4-8 пН с шагом 0,2-0,5 пН и измерьте положение шарика в течение ~ 10 с на каждом уровне силы.
   2. Для комплексов SNARE приложите усилие 14-16 пН с шагом 0,1-0,2 пН и измерьте положение валика в течение ~10 с на каждом уровне силы.
5. Эксперименты с силовыми прыжками: Наблюдайте за переходными событиями комплексов SNARE.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты с силовыми скачками, как и эксперименты с постоянной силой, включают изменения уровней силы. Однако силовые скачки используют более резкие изменения приложенной силы, что позволяет отслеживать события, вызванные силой в исследуемых молекулах, такие как внезапный разрыв белковых комплексов. Например, поскольку комплексы SNARE проявляют структурный гистерезис при циклическом движении^{силы 23}, информативно проводить эксперименты с силовыми скачками и измерять задержку перехода (рис. 4C).
   1. Распаковки: Отслаивание молекулы VAMP2 от интактного тройного комплекса SNARE, оставляя бинарный комплекс синтаксина-1A и SNAP-25.
   2. Повторное застежка: Застежка-молния распакованной молекулы VAMP2 для регенерации интактного комплекса SNARE.
      1. Разворачивается: Полная разборка комплекса SNARE сопровождается полной диссоциацией SNAP-25. Только молекулы VAMP2 и синтаксина остаются в конструкции после развертывания.
      2. Складывание: Регенерация комплекса SNARE при связывании свободной молекулы SNAP-25 с буфера.
6. При 2 pN индуцируют сборку интактного комплекса SNARE, ожидая (~ 30 с) ассоциации свободной молекулы SNAP25. Внезапное уменьшение протяженности наблюдается при образовании комплекса SNARE.
7. Чтобы наблюдать за событиями распаковки, подождите несколько секунд при 10-12 пН, а затем резко переходите к 14-15 пН с максимально возможной скоростью двигателя. В зависимости от целевой силы комплекс SNARE будет демонстрировать либо обратимый переход между частично распакованными промежуточными продуктами (как в экспериментах с постоянной силой), либо скачок ~ 25 нм в более высокое, разархивированное состояние после случайного времени ожидания (или задержки).
8. Чтобы наблюдать за событиями повторного застеживания, уменьшите усилие до 10-12 пН сразу после того, как будет наблюдаться расстегивание. Опять же, комплекс SNARE демонстрирует стохастический переход в нижнее состояние с застежкой-молнией после некоторой случайной задержки. Если разворачивание произошло после распаковки, комплекс не сможет застегнуться повторно, так как молекула SNAP-25 будет отсутствовать.
9. Чтобы наблюдать за разворачивающимися событиями, подождите более длительный период после того, как будет наблюдаться распаковка, чтобы обнаружить дальнейшее увеличение расширения (~ 2 нм).

11. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Типы анализа, который можно проводить с данными МТ, зависят от целевой системы. Тем не менее, существуют общие подходы к извлечению полезной информации из соответствующих экспериментов, описанных на рисунке 4. Все анализы выполняются с помощью MATLAB (R2021a) с использованием пользовательских кодов, предоставленных в этой статье. Эти коды генерируют графики, используя те же данные, что и в этой статье. Обратите внимание, что в то время как необработанные данные отслеживания 100 Гц были взяты непосредственно для анализа, данные отслеживания 1,2 кГц обычно подвергались медианной фильтрации (с пятиточечным скользящим окном) перед анализом для уменьшения шума (за исключением анализа шума).

1. Эксперименты с наращиванием силы: Проанализируйте соотношение силы и растяжения (например, упругость полимеров) и переведите силу для извлечения информации о наномеханических свойствах.
2. Эксперименты с постоянной силой: Проанализируйте популяции состояний и время пребывания (или скорость перехода) в зависимости от силы для извлечения структурных (например, областей, участвующих в переходе), термодинамических (например, разность свободных энергий) и кинетических (например, энергетический барьер) параметров конформационных изменений.
3. Эксперименты с силовыми прыжками: Проанализируйте кинетику разрыва (например, белок-белковые взаимодействия и связывание рецептор-лиганд) или время жизни переходных промежуточных продуктов (например, разворачивание биомолекул) для извлечения стабильности молекул-мишеней и их состояний.
4. В качестве репрезентативных приложений проанализируйте данные образцов для шпилек ДНК и комплексов SNARE:
   1. Переходы шпильки ДНК с двумя состояниями: сила расстегивания, расстояние открытия, силовая зависимость сдвига популяции, а также измерения назначения состояний и скорости перехода с помощью скрытой марковской модели (HMM) (предоставлены коды MATLAB).
   2. Конформационные изменения комплексов SNARE: сила распаковки, силовая зависимость промежуточных состояний и латентности распаковки, гистерезис при повторном застежке и поведение разворачивания/сворачивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Модели расширения силы для ручек ДНК, шпилек ДНК и конформаций комплекса SNARE приведены в предыдущих ссылках^14,31.

Калибровка по усилию
Результаты двух методов измерения силы (дисперсия бокового смещения шариков и анализ спектра мощности) отличались на 0-2 пН (рис. 2G). Согласно результатам, приведенным на рисунке 2F, мы можем надежно достигать до 30 пН с помощью обычных неодимовых магнитов.

Переходы с двумя состояниями шпильки ДНК 8.н.
Сначала мы исследовали наномеханику короткой шпильки ДНК (рис. 5). Шпильки ДНК были широко охарактеризованы обычной одномолекулярной силовой спектроскопией, и поэтому доступен обширный источник ссылок для сравнения. Расстегивание короткой шпильки обычно обратимо, поэтому события ее повторного застеживания также наблюдаются в том же диапазоне сил, в котором происходит расстегивание (рис. 5А). Применяя сдвиг силы от 0 пН до 20 пН (рис. 5B), было проверено, что индуцированное силой расширение конструкции шпильки соответствует модели WLC, которая может быть отнесена исключительно к эластичности ручек ДНК (рис. 5C, «закрытый»). При температуре около 6 пН конструкция демонстрировала дополнительные колебания в растяжении, связанные с обратимым расстегиванием структуры шпильки (рис. 5C, вставка). Наконец, при ~ 8 пН переход в конечном итоге исчез, и расширение остановилось на верхнем состоянии, которое было дополнительно расширено на ~ 7 нм. Следовательно, измеренный профиль растяжения силы выше 8 пН привязывается к новой модельной кривой (рис. 5C, «открытая»), которая включает длину одноцепочечной области расстегнутой шпильки.

Затем мы провели эксперименты с постоянной силой, чтобы систематически исследовать переход шпильки. Положение валика измеряли в диапазоне сил 4-8 пН с шагом 0,5 пН в течение ~10 с на каждом уровне; Затем были собраны и проанализированы значения расширения, чтобы измерить их равновесное распределение в зависимости от силы. Результаты отслеживания 100 Гц предполагали постепенный переход к более протяженному состоянию в этом силовом режиме (рис. 5D), но полученные гистограммы расширения были недостаточно четкими для разрешения различных популяций (рис. 5E). В отличие от этого, когда те же эксперименты проводились на частоте 1,2 кГц (рис. 5F), высокоскоростные траектории изменений расширения после мягкой фильтрации (пятиточечный медианный фильтр) выявили две различные популяции, которые хорошо описываются смесью двух гауссовских распределений (рис. 5G). Расстояние между двумя популяциями, указывающее на расстояние открытия шпильки, оставалось неизменным на уровне ~ 7 нм в режиме силы расстегивания молнии (рис. 5H). Отклонение в конечностях (4 пН и 8 пН) было обусловлено неточной локализацией одного состояния из-за его скудности.

Данные показали, что средняя сила для расстегивания перехода (сила, при которой замкнутая и открытая популяции становятся равными) F1/2 составляла ~ 6 пН, а верхнее, открытое состояние постепенно становилось доминирующим по мере того, как мы увеличивали силу на 4-8 пН (рис. 5I). При использовании соотношения Больцмана для открытой вероятности были получены точные значения F 1/2 = 5,9 пН и Δz = 7,1 нм, согласующиеся с приведенными выше наблюдениями. Следует, однако, отметить, что сила раскрытия, полученная из одной конструкции, может быть неточной из-за вариабельности от валика к валику в генерации силы, которая была измерена как ~ 4% для коммерческих шариков M27031. Кроме того, поскольку длина стебля (8.н.) короткая, сила раскрытия других шпилек 8.н. с другим нуклеотидным составом может сильно варьироваться в20 раз. Наконец, мы применили HMM к трассировкам расширения, чтобы отобразить переход состояния, и тем самым измерили скорости перехода (рис. 5F, красная трасса). Скорость распаковки и повторного застеживания изменялась экспоненциально в зависимости от приложенной силы (рис. 5J) таким образом, что сила способствует расстегиванию и препятствует повторному застежке. При необходимости можно дополнительно использовать классическое выражение Белла для извлечения параметров энергетического ландшафта (например, высоты барьера и расстояния)46.

Характеристика тепловых флуктуаций при измерениях протяженности
Используя конструкцию шпильки, мы профилировали силовой шум в измерениях растяжения. Во-первых, тепловые флуктуации привязного валика были рассчитаны на основе уравнений с использованием параметров (например, радиуса валика, длины троса), подходящих для этих экспериментов2,5 (рис. 5K, сплошные кривые). Мы также построили график стандартного отклонения растяжения, измеренного по временному следу конструкции шпильки на различных уровнях силы. Поскольку эта молекула имела мотив шпильки, ее отклик при 4 пН (закрытое состояние) использовался для измерения собственного шума, тогда как динамика шпильки была обнаружена ~ 6 пН, как и ожидалось, и служила проверкой. Силовое подавление флуктуаций также наблюдалось после того, как шпилька стала в основном открытой (сравните 8 пН против 4 пН). Сравнение с тепловым пределом показывает, что есть возможности для улучшения, но этот оставшийся шум часто связан с флуктуацией вращения магнитного шарика30, что является случайным и сложным для разрешения. Для более систематического анализа броуновского шума во времени наблюдения часто используется расчет отклонения Аллана32,33. Мы рассчитали дисперсию Аллана для данных шпильки, представленных на рисунке 5F, аналогично измерениям 5 kbp на рисунке 2C. Результаты, приведенные на рисунке 5L, показывают, что в промежуточном диапазоне сил 4-8 пН мы получили 2-3 нм отклонения Аллана на максимальной скорости (1,2 кГц), и это значение упало до уровня ниже 1 нм для времени наблюдения (τ) более 0,1 с. Интересно, что динамика шпильки возникла около 5-7 пН в течение ~ 0,01 с (рис. 5L, вставка), что согласуется с измеренной переходной силой и скоростями на рисунке 5I,J.

Конформационные изменения нейрональных комплексов SNARE
Затем мы использовали нейрональные комплексы SNARE в качестве белковой модели и изучили их силовые механические свойства. В отличие от конструкции шпильки, одиночные комплексы SNARE удерживались между двумя ручками дцДНК по 510.н. (рис. 6A). Следует отметить, что концы синтаксина-1А и VAMP2, дистальнее ручек, были сшиты дисульфидной связью между искусственными остатками цистеина, чтобы избежать разрыва и обеспечить многократное выщипывание данной конструкции.

Сначала мы применили увеличение силы, как с увеличением, так и с уменьшением уровней силы (± 1 пН с-1), чтобы растянуть и расслабить целевую конструкцию соответственно. В режиме низкой и средней силы (0-10 пН) две ручки независимо вели себя как полимеры WLC, в целом формируя кривую силового расширения, неотличимую от кривой дцДНК 1 kbp (рис. 6B, черный). Однако, когда сила была увеличена до уровня выше 10 пН, значения расширения заметно отклонились от модели WLC, что указывает на то, что встроенный комплекс SNARE показал дополнительное увеличение расширения. Более конкретно, увеличение расширения можно резюмировать в три отдельных этапа: (а) небольшое, постепенное увеличение 11-13 пН, (б) быстрые и большие (~ 10 нм) колебания в 14-16 пН и (в) окончательное, необратимое раскрытие около ~ 20 нм. Кроме того, когда сила была снижена, чтобы ослабить конструкцию, расширение либо возвращалось к исходной кривой силы-растяжения при меньшей силе (<15 пН), либо следовало за новой модельной кривой с большим расширением (рис. 6B, синий). В конечном итоге общее расширение было восстановлено до более низких значений (от синего до черного на рисунке 6B) ниже 5 пН, и можно было применить те же циклы изменения силы, которые показали аналогичную тенденцию.

Исходя из молекулярной модели конформации комплекса SNARE, мы можем точно рассчитать возможные значения расширения потенциальных промежуточных продуктов (рис. 6C). Более того, предполагая поведение WLC для размотанных полипептидов, расширения могут быть оценены как функция силы, тем самым генерируя полные модели расширения силы для различных конформаций (рис. 6B, пунктирные линии). Взяв эти значения за основу, мы интерпретировали вышеуказанные переходы следующим образом 14,23: (а) постепенный переход от полностью застегнутого состояния (FZ) к открытому линкерно-открытому состоянию (LO) в 11-13 pN, подразумевая открытие линкерных областей синтаксина-1A и VAMP2; (b) быстрый переход между LO и полумолнией (HZ), подразумевающий открытие комплекса SNARE до нулевого ионного слоя; и (c) окончательный переход либо в разархивированное (UZ), либо в развернутое состояние (UF), подразумевающий полное отделение VAMP2 от остальной части комплекса. Состояние UZ отличается от UF тем, что ассоциированная молекула SNAP-25 по-прежнему связана с синтаксином-1A, поддерживая бинарный комплекс. В случае UF (без SNAP-25) полный комплекс SNARE может быть регенерирован только после рекомбинации свободной молекулы SNAP-25 из раствора, в котором снижение приложенной силы для обеспечения такого повторного связывания имеет решающее значение.

Чтобы более систематически проверить конформационные изменения комплексов SNARE, мы провели эксперименты с силовыми скачками в силовом режиме, где конформационные флуктуации часто наблюдались при 14-15 пН (рис. 6D). Как правило, мы сначала начинали с измерения положения валика при 10 пН и проверяли стабильное расширение, что указывает на отсутствие изменений, связанных с SNARE. Затем уровень силы резко увеличивался до 14-15 пН, при котором следили за расширением до тех пор, пока не происходило расстегивание, если таковое имелось. Наконец, сила была уменьшена до 10 пН, чтобы проверить, не является ли какое-либо постоянное увеличение растяжения, связанное с разворачиванием. При 14 пН следы расширения в основном оставались в состоянии LO, с редкими всплесками в состоянии HZ. Следует отметить, что эти краткие экскурсы в состояние ГЦ, вероятно, будут пропущены при отслеживании 100 Гц, которое усредняет и понижает дискретизацию изображений шариков в 12 раз. Несмотря на явные и частые визиты в состояние ГЦ, комплексу не удалось осуществить полный переход в состояние УЗ (рис. 6Е), что говорит о том, что внешняя сила была недостаточно сильной, чтобы преодолеть энергетический барьер к расстегиванию. Напротив, даже небольшое увеличение силы (до 14,3 пН) сделало переход очень эффективным, так что состояние UZ достигалось в основном в течение нескольких секунд (рис. 6F). Последовательно распаковка была завершена в основном в течение 1 с, когда мы приложили к комплексу 14,5 пН (рис. 6G, H). Примечательно, что расстегивание при более высоких силах часто приводило к полному развертыванию всего комплекса (сопровождаемому удалением SNAP-25), о чем свидетельствует небольшое дополнительное увеличение удлинения над UZ (рис. 6H) и сигнатура сворачивания, наблюдаемая при 2 пN (рис. 6I). В целом, эти данные показывают классическое поведениескольжения 47 для развертывания комплексов SNARE, согласующееся с предыдущими отчетами 14,23,48.

Рисунок 1: Настройка прибора. Схема (А) и фотография (Б) высокоскоростной установки МТ. Магниты, управляемые линейным двигателем и двигателем вращения, расположены над столиком образца инвертированного микроскопа, оснащенного 100-кратной масляной иммерсионной линзой и высокоскоростной CMOS-камерой. Световой луч от суперлюминесцентного диода проходит через магниты и освещает поле. Вставка: Репрезентативные дифракционные изображения бусин, расположенных на разном расстоянии от фокальной плоскости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Калибровка по усилию . (A) Схема образца калибровки силы. Величины силы, действующей антипараллельной парой магнитов с расстоянием 1 мм, измеряются в зависимости от расстояния d магнита от смещений магнитного шарика (M270), привязанного фрагментом дцДНК со скоростью 5 кбп. В) Репрезентативные данные, полученные в ходе процедуры калибровки силы. Цветные стрелки обозначают области, которые расширены в (D) (совпадающие цвета). (C) Отклонение Аллана для z-положения привязного борта со скоростью 5 кбит/с, измеренное при 15-20 пН. Показаны кривые для z-координат магнитного валика до (синего) и после (красного) вычитания положения опорного валика. (D) Репрезентативные временные ряды положения y, измеренные на указанном расстоянии от магнита d. Соответствующая гистограмма распределения координат Y показана справа с гауссовской подгонкой (красная). (E) Репрезентативный ОСЧС на основе данных, приведенных в подпункте (D). Значения силы, полученные при установке модели (красный) на соответствующие PSD, приведены сверху. (F) Калибровка магнитной силы в зависимости от расстояния до магнита. Силы измерялись либо по дисперсии (слева), либо по методу PSD (справа). Подгонка (красная) указывает на двойную экспоненциальную модель с аннотированным уравнением. (G) Разница в измеренной силе, полученная в результате дисперсии и PSD. Красная кривая вычисляется для подгонок, показанных в (F). (Х,И) Проверка соотношения силы и удлинения калибровочной конструкции 5 кбит/с. Средние значения растяжения при различных уровнях силы (измеренные по дисперсии) использовались либо непосредственно (H), либо после поправки на смещение борта по высоте (I) из-за наклона смещенного от центра валика31. Данные о расширении силы для n = 5 молекул были подогнаны с помощью растяжимой модели WLC, а подогнанные параметры (длина персистенции Lp и модуль растяжения Ko) аннотированы сверху (среднее значение ± s.d.). Аббревиатура: PSD = спектральная плотность мощности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Пробоподготовка . (A) Получение шпилечных конструкций ДНК 8.н. путем ПЦР-амплификации участка λ-ДНК 1 kbp. (B) Получение сложных конструкций SNARE с двумя ручками ДНК по 510.н. Вставка: Проверка ручек ДНК и их прикрепления к белкам методом электрофореза в агарозном геле (2% гель). Стрелки указывают на сдвиг подвижности (цветовая кодировка) видов продукта: свободные ручки 510.н. (пурпурный); Ручка B прикреплена к синтаксину (красный), к ΔN-комплексу (зеленый) и к комплексу SNARE (синий); и последний двухручный комплекс SNARE (зеленый). Добавление SDS разрушает ΔN-комплексы (присутствующие в b), но не полные комплексы SNARE, образованные полноразмерным VAMP2 (присутствующим в c). С) Проектирование и фотографирование проточной ячейки для экспериментов с МТ. (D) Схема последовательного введения растворов проб в канал проточной ячейки. Аббревиатура: МТ = магнитный пинцет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Типы репрезентативных экспериментов. (А-С) Схемы экспериментов с силовым переходом, силовым зажимом и силовым скачком (вверху) с репрезентативными временными следами расширения из соответствующих измерений (середина). Типы анализа, которые можно провести, показаны внизу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Переход в два состояния шпильки ДНК 8.н. (A) Схема экспериментов МТ на шпильке ДНК с ожидаемым переходом распаковки и повторного молнии. (B) Репрезентативный след удлинения конструкции из экспериментов с изменением силы с возрастающими (~ 0,25 пН с-1) уровнями силы. С) Репрезентативная кривая силы растяжения, восстановленная на основе данных, приведенных в подпункте В. Желтые кривые обозначают модели WLC для конструкции шпильки со шпилькой в закрытой (сплошной) и открытой (пунктирной) конформации. (D) Репрезентативный след растяжения из экспериментов с постоянной силой с возрастающими уровнями силы, измеренный на частоте 100 Гц. (E) Гистограммы данных о расширении в (D). (Ф,Г) Результаты тех же экспериментов в (D) и (E), но с отслеживанием 1,2 кГц. Необработанный временной ряд 1,2 кГц был сглажен путем применения пятиточечного медианного фильтра. Красные следы в расширенном виде (F) были получены от HMM. Красные линии в (G) обозначают местонахождение гауссовских популяций. (H) Расстояние между двумя популяциями в (G). (I) Вероятность в открытом состоянии как функция приложенной силы. Красная кривая представляет собой подогнанную модель Больцмана ( ) со средней силой F1/2 = 5,9 пН. (J) Скорость распаковки и повторного застеживания перехода, измеренная по результатам HMM. Сплошные линии указывают на экспоненциальную зависимость от силы. k) тепловые колебания при измерениях протяженности. Стандартные отклонения данных о расширении шпильки (без фильтрации) показаны в зависимости от силы. Предел теплового разрешения, представляющий собой теоретическую величину тепловых флуктуаций, был оценен по уравнению 9 в работе Choi et al.2 для шарика размером 2,8 мкм с привязью 1 кбит/с. (L) Отклонения Аллана, рассчитанные на основе данных шпильки 1,2 кГц в (F) (без фильтрации). На врезке показано отклонение Аллана на 0,01 с в зависимости от силы, что свидетельствует о постепенном увеличении и уменьшении флуктуации за счет динамики шпильки. Аббревиатура: МТ = магнитный пинцет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Конформационные изменения нейрональных комплексов SNARE. (A) Схема экспериментов МТ на комплексах SNARE. (B) Репрезентативные кривые растяжения силы для конструкции SNARE. Черные и синие следы (100 Гц) были получены из периодов растяжения и расслабления в экспериментах с силовым сдвигом соответственно. Пунктирными линиями обозначены модели расширения, учитывающие различные конформации комплексов SNARE, показанные в (C). (C) Молекулярные модели комплексных конформаций SNARE с соответствующими расчетными расширениями. Значения оценивались по геометрическим параметрам спиральных пучков и модели WLC для полипептидной области14. (D) Схема экспериментов с силовыми скачками для исследования сложных конформаций SNARE. (Е-Х) Репрезентативные следы расширения из экспериментов с силовыми скачками, выполненных на указанных уровнях силы. В подпункте (Е) расстегивание не наблюдалось. В (F) и (G) наблюдалось расстегивание с последующим повторным застежкой при 10 пН. В подпункте (H) за расстегиванием последовало еще одно разворачивающееся событие. (I) Сворачивание комплекса SNARE при 2 пН. Явное снижение распространения из состояния УФ в состояние ФЗ наблюдалось при 5 пН. Аббревиатура: МТ = магнитный пинцет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Условия проведения ПЦР-реакций и электрофореза в агарозном геле. Параметры реакции для ПЦР конструкций ДНК, включая дцДНК 5 kbp для калибровки силы, конструкцию шпильки ДНК и ручки ДНК для присоединения SNARE. Последовательности грунтовок приведены в Таблице материалов.

Таблица 2: Буферы и их состав. Состав буферов, используемых для очистки белка.

Дополнительный рисунок S1: Чертеж магнитодержателя. Показаны размеры акрилового держателя для двух магнитов размером 10 мм х 10 мм х 12 мм с зазором 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Заархивированный файл, содержащий коды MATLAB. Скрипты MATLAB для анализа данных, полученных в результате экспериментов с высокоскоростным магнитным пинцетом, включая калибровку силы, шпильку и комплексный анализ SNARE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: заархивированный файл пакета программного обеспечения LabVIEW. Полный пакет кодов LabVIEW для работы с высокоскоростным магнитным пинцетом и сбора данных с его помощью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.