Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высокоскоростной магнитный пинцет для наномеханических измерений на чувствительных к силе элементах

3.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65137

⸱

12 мая 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем высокоскоростной магнитный пинцет, который выполняет наномеханические измерения чувствительных к силе биомолекул с максимальной частотой 1,2 кГц. Мы представляем его применение к шпилькам ДНК и комплексам SNARE в качестве модельных систем, но он также будет применим к другим молекулам, участвующим в механобиологических событиях.

Аннотация

Одномолекулярные магнитные пинцеты (МТ) служили мощными инструментами для принудительного опроса биомолекул, таких как нуклеиновые кислоты и белки, и поэтому готовы быть полезными в области механобиологии. Поскольку метод обычно основан на отслеживании магнитных шариков на основе изображений, ограничение скорости при записи и анализе изображений, а также тепловые колебания шариков долгое время препятствовали его применению при наблюдении небольших и быстрых структурных изменений в молекулах-мишенях. В этой статье подробно описаны методы построения и эксплуатации установки МТ высокого разрешения, которая может разрешать наноразмерную, миллисекундную динамику биомолекул и их комплексов. В качестве прикладных примеров демонстрируются эксперименты с шпильками ДНК и комплексами SNARE (механизм слияния мембран), в которых основное внимание уделяется тому, как их переходные состояния и переходы могут быть обнаружены в присутствии сил пиконетонного масштаба. Мы ожидаем, что высокоскоростные МТ будут по-прежнему обеспечивать высокоточные наномеханические измерения молекул, которые чувствуют, передают и генерируют силы в клетках, и тем самым углубят наше понимание механобиологии на молекулярном уровне.

Введение

Клетки активно ощущают и реагируют на механические раздражители. При этом многие биомолекулы проявляют силовые свойства, которые обеспечивают динамические структурные изменения. Хорошо оцененные примеры включают механочувствительные ионные каналы и цитоскелетные элементы, которые обеспечивают клетки ключевой механической информацией из окружающей среды.

Кроме того, молекулы, обладающие уникальной силовой природой, также можно считать механочувствительными в более широком смысле. Например, локальное образование и плавление дуплексов нуклеиновых кислот, а также структур более высокого порядка, таких как G-квадруплексы, играют решающую роль в репликации, транскрипции, рекомбинации и, в последнее время, редактировании генома. Более того, некоторые нейронные белки, участвующие в синаптических коммуникациях, выполняют свои функции, генерируя физические силы, которые превышают уровни типичных межмолекулярных взаимодействий. Независимо от того, на каком примере вы проводите исследование, изучение наномеханики вовлеченных биомолекул с высокой пространственно-временной точностью окажется очень полезным для выявления молекулярных механизмов связанных с ними механобиологических процессов 1,2,3.

Методы одномолекулярной силовой спектроскопии послужили мощными инструментами для изучения механических свойств биомолекул 2,4,5,6. Они могут отслеживать структурные изменения в нуклеиновых кислотах и белках одновременно с приложением силы, тем самым исследуя силозависимые свойства. Двумя хорошо известными установками являются оптический пинцет и магнитный пинцет (МТ), в которых используются шарики микронного размера для манипулирования молекулами 5,6,7,8. В этих платформах полистирол (для оптического пинцета) или магнитные шарики (для МТ) привязаны к молекулам-мишеням (например, нуклеиновым кислотам и белкам) через молекулярные «ручки», обычно состоящие из коротких фрагментов двухцепочечной ДНК (дцДНК). Затем шарики перемещаются, чтобы приложить силу, и визуализируются, чтобы отслеживать их местоположение, которые сообщают о структурных изменениях в молекулах-мишенях. Оптический и магнитный пинцет в значительной степени взаимозаменяемы в своих применениях, но существуют важные различия в их подходах к управлению силой. Оптический пинцет по своей сути представляет собой инструменты с позиционным зажимом, которые захватывают шарики в нужном положении, из-за чего приложенная сила колеблется, когда целевая конструкция претерпевает изменения формы; Увеличение растяжения, например, от раскладывания, ослабляет трос и снижает натяжение, и наоборот. Хотя активная обратная связь может быть реализована для управления силой в оптических пинцетах, MT, напротив, естественным образом работают как устройство силового зажима, используя преимущества стабильных магнитных сил в дальней зоне постоянными магнитами, которые также могут выдерживать возмущения окружающей среды.

Несмотря на свою долгую историю и простую конструкцию, МТ отстают от оптических пинцетов в их приложениях для высокоточных измерений, в основном из-за технических проблем с быстрым отслеживанием шариков. Однако в последнее время несколько групп совместно провели многогранное совершенствование как аппаратного, так и программного обеспечения для приборов машинного перевода 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . В этой работе мы представляем пример такой установки, работающей на частоте 1,2 кГц, и описываем, как использовать ее для выполнения наномеханических измерений на чувствительных к силе биомолекулах. В качестве модельных систем мы используем шпильки ДНК и нейрональные комплексы SNARE и исследуем их быстрые структурные изменения в режиме пиконетона. Шпильки ДНК демонстрируют простые переходы с двумя состояниями в четко определенном диапазоне сил20,21 и, следовательно, служат игрушечными моделями для проверки работоспособности установки пинцета. Поскольку белки SNARE собираются в чувствительный к силе комплекс, который управляет слиянием мембран22, они также были тщательно изучены с помощью одномолекулярной силовой спектроскопии 14,23,24,25. Представлены стандартные подходы к анализу данных и извлечению полезной информации по термодинамике и кинетике. Мы надеемся, что эта статья может способствовать внедрению высокоточных МТ в механобиологические исследования и мотивировать читателей исследовать свои собственные чувствительные к силе системы, представляющие интерес.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все материалы и оборудование, описанные в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов. Программное обеспечение LabVIEW для работы с высокоскоростной установкой машинного перевода, описанной ниже, а также скрипты MATLAB для анализа демонстрационных данных размещены на GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) и находятся в открытом доступе.

1. Конструкция аппарата

ПРИМЕЧАНИЕ: Общий принцип построения высокоскоростного МТ аналогичен стандартным, обычным системам МТ, за исключением использования высокоскоростной комплементарной камеры на основе металл-оксидного полупроводника (КМОП) и мощного когерентного источника света (рис. 1). Обратитесь к другим источникам для получения более подробной информации о стандартных приборах МТ 5,26,27.

  1. Установите инвертированный микроскоп на антивибрационный оптический стол. Установите высокоскоростную CMOS-камеру и фреймграббер.
  2. Постройте сцену перевода для манипулирования магнитами в 3D. Установите моторизованный линейный столик (ход >20 мм) вертикально поверх ручного столика XY.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вертикальное движение управляет усилием, тогда как ступень XY предназначена для ручного выравнивания магнитов по оптической оси для первоначальной сборки установки.
  3. Установите роторный шаговый двигатель и систему ремней и шкивов для вращающихся магнитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ремень передает вращательное движение между валом двигателя и магнитами, находящимися на расстоянии нескольких сантиметров друг от друга. Вращение магнитов является внутренним для поступательной манипуляции.
  4. Установите магниты. Используйте акриловый держатель (заказанный у компании-производителя; см. дополнительный рисунок S1), который может плотно разместить два одинаковых магнита параллельно, с четко определенным зазором 1 мм между магнитами (рис. 1B). Чтобы использовать максимальное усилие, достижимое с данной парой магнитов, отрегулируйте вертикальное положение подвижного столика так, чтобы нижняя поверхность магнитов совпадала с плоскостью образца при перемещении в самое нижнее положение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Lipfert et al. для получения дополнительной информации о конструкции держателя и конфигурациимагнитов 28. Высота и ориентация магнитов контролируются программным обеспечением LabVIEW в сочетании со сбором данных.
  5. При просмотре с помощью объектива с малым увеличением выровняйте магниты по центру поля зрения. Убедитесь, что вращение магнитов не вызывает большого смещения центра пары магнитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если средняя точка между магнитами вращается вокруг оси вращения, вполне вероятно, что магниты смещены от центра из-за несовершенного держателя. Небольшой уровень смещения по отношению к размеру зазора допустим, так как вращение магнита предназначено только для проверки тросов и приложения крутящих моментов в определенных приложениях.
  6. Установите суперлюминесцентный диод (SLD) для подсветки бусин. Пропустите луч через зазор 1 мм между двумя магнитами. Убедитесь, что луч правильно коллимирован, чтобы поместиться в зазоре, и освещение не затеняется магнитами.
  7. Установите пьезосканер на наконечник и установите объектив с 100-кратным погружением в масло (числовая апертура [NA]: 1,45) для отслеживания борта. Чтобы избежать потенциальных артефактов в результатах отслеживания, убедитесь, что освещение поддерживается равномерно при перемещении магнитов. Наконец, отрегулируйте уровень освещенности до максимальной яркости без насыщения пикселей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения различных источников света для высокоскоростного слежения за шариками см. Dulin et al.29.

2. Калибровка магнитной силы

  1. Используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР; см. Таблицу 1), подготовьте 5 фрагментов дцДНК kbp (с использованием праймера B, праймера Z_5k и λ-ДНК), которые помечены биотином на одном конце (для поверхностного прикрепления) и азидом на другом конце (для прикрепления шариков).
  2. Следуя разделу 6, подготовьте проточную ячейку с молекулами 5 kbp.
  3. Следуя разделу 7, определите хорошую конструкцию бортового троса, проверив ее удлинение и вращение. В частности, обязательно выбирайте валик с минимальной траекторией вращения (т.е. с радиусом <200 нм), чтобы минимизировать смещение высоты валика из-за нецентрированного крепления30,31. Как только хороший трос будет идентифицирован, начните отслеживание борта, ссылаясь на раздел 9.
  4. Если установка новая, охарактеризуйте ее шум и стабильность для надежных измерений с высоким разрешением. Поместите магнит на расстоянии ~ 3 мм от поверхности проточной ячейки (чтобы применить >10 пН и подавить броуновское движение шарика), отследите z-положение шарика на частоте 1,2 кГц и вычислите отклонение Аллана (AD) от z-координатного временного ряда32,33 (рис. 2C). Убедитесь, что значения AD в несколько нанометров достижимы в высокоскоростном режиме (<0,1 с) и что дифференциальное отслеживание (положение магнитного валика относительно эталонного валика) снижает AD в более длительном временном масштабе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы получаем AD <3 нм при максимальной частоте (разрешение 1,2 кГц или 0,83 мс), а AD продолжает уменьшаться, по крайней мере, до 10 с, что подразумевает минимальный дрейф. Другие сообщили об аналогичных значениях на аналогичных установках 9,10,11,12,34.
  5. С магнитами в положении покоя (F ~ 0 pN) запишите координаты x и y привязанного шарика на частоте 1,2 кГц. Запишите положение в течение достаточно длительного периода (т. е. достаточно большего, чем характерное время релаксации флуктуации35), чтобы броуновское движение было достаточно выборизировано.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь направление x соответствует направлению магнитного поля, тогда как движение в y представляет собой поперечное движение, перпендикулярное полю.
  6. Переместите магниты ближе к проточной ячейке и повторяйте измерения положения шарика, пока магниты не коснутся верхней части проточной ячейки. Двигайтесь большими шагами (например, 1-2 мм), когда магниты находятся на расстоянии более 7 мм от плоскости образца (поскольку приложенная сила медленно увеличивается в дальнем поле магнитов), но постепенно уменьшайте размер шага (например, 0,1-0,5 мм) по мере приближения для более точной калибровки при более высоких уровнях силы (рис. 2B).
  7. Рассчитайте силу в каждом положении магнита, d, используя любой из двух альтернативных методов (предоставляется сценарий MATLAB «калибровка силы.m», включающий оба метода; см. Дополнительный файл 1).
    1. Измерьте дисперсию y-координатfigure-protocol-1 бусины (рис. 2D) и среднее z-положениеfigure-protocol-2 бусины относительно самого низкого положения (рис. 2B, внизу). Затем используйте уравнение (1)7,27,36 для оценки силы (с фиксированным радиусом валика R = 1,400 нм и тепловой энергией k RT = 4.11 пН∙нм):
      figure-protocol-3(1)
    2. В качестве альтернативы можно рассчитать спектральную плотность мощности (PSD) y-координат Sy (рис. 2E). Определите приложенную силу F, подгонив двойную лоренцеву модель37 к измеренному Sy с помощью уравнения (2).
      figure-protocol-4(2)
      figure-protocol-5Здесь , R — радиус валика, γ yи γφ — коэффициенты поступательного и вращательного сопротивления соответственно (оцениваемые по уравнению Стокса-Эйнштейна), k RT — тепловая энергия, f+ и f- две характеристические частоты, полученные с помощью уравнения (3).
      figure-protocol-6 (3)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку удлинитель троса L является функцией силы, которая следует хорошо зарекомендовавшей себя модели червячной цепи (WLC), приведенные выше выражения оставляют F в качестве единственного подходящего параметра (для простоты мы устанавливаем R равным 1,400 нм, потому что он распределяется по всем уровням силы, и точное значение не оказывает заметного влияния на результаты). При необходимости размытие при движении и сглаживание при получении изображения с помощью камеры должны рассматриваться как38,39, но этот эффект незначителен в наших высокоскоростных измерениях выше 1 кГц с привязями 5 кбит/с.
  8. Повторите шаги 2.4-2.7 для еще нескольких конструкций. Исследуйте от трех до пяти различных шариков, чтобы усреднить изменчивость силы между магнитными шариками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение силы между используемыми магнитными шариками следует учитывать для определения правильного количества конструкций для усреднения. Эта изменчивость невелика, но может привести к погрешности измеряемой силы более чем на 1 пН даже для коммерческих продуктов31. Для большинства применений, где абсолютное определение задействованных сил не имеет решающего значения, обычно достаточно усреднения результатов калибровки трех-пяти шариков. Альтернативный подход к учету этого изменения заключается в измерении силы с помощью отдельных тросов в начале эксперимента, что может занять много времени. Другой вариант состоит в том, чтобы встроить шпильки, которые распаковываются на известных уровнях силы в каждую конструкцию31.
  9. Построите график измеренной силы в зависимости от расстояния до магнита и подгоните двойную экспоненциальную функцию к данным (рис. 2F), используя уравнение (4).
    figure-protocol-7(4)
    Здесь F0 (базовая линия), A 1 и A 2 (амплитуды) и d 1 и d2 (константы распада) являются подходящими параметрами. Убедитесь, что значения силы из двух методов, а также результирующие двойные экспоненциальные подгонки в значительной степени совпадают (рис. 2F, G).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что калибровка силы выполнена правильно, проверьте соотношение силы и удлинения зондируемых конструкций, построив график зависимости удлинения от измеренной силы.
  10. Чтобы скорректировать смещение высоты валика zв результате зависящего от силы наклона магнитных шариков30,31, оцените z от бокового смещения xoff, учитывая геометрию смещенногоот центра троса с радиусом валика, используя уравнение (5), и примените значения к измеренным значениям расширения. Этот шаг реализован в скрипте MATLAB "force calibration.m" (строки 252-254).
    figure-protocol-8(5)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что эта поправка вносит небольшие изменения в удлинение, особенно для шариков с малым радиусом вращения (<200 нм), это смещение часто критически влияет на упругий отклик, как видно из перехода от рисунка 2H к рисунку 2I30,31.
  11. Проверьте длину персистенции Lp , подгонив расширяемую модель WLC к данным с помощью уравнения (6).
    figure-protocol-9(6)
    Здесь L0 — длина контура (1,7 мкм для 5 кбит/с), а K0 — модуль энтальпического растяжения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что L p дцДНК хорошо принят как 40-50 нм в типичном буфере, таком как фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), формула WLC, применяемая к коротким молекулам (<5 kbp), систематически недооценивает L p, поскольку L0 уменьшаетсяна 31,40. Это связано с тем, что классическая модель WLC предполагает полимер, длина цепи которого достаточно больше, чем длина его стойкости. Здесь мы получили Lp = 40 ± 3 нм для конструкции 5 kbp (рис. 2H), а поправка на расширение в дальнейшем дала однородный K0 от 1,100 ± 200 пN (рис. 2I). Применение конечной моделиWLC 31,40, а также поправки на негауссованность в распределениирасширения 41 несколько увеличит Lp.
  12. После проверки калибровки силы примените полученные параметры подгонки двухэкспоненциальной модели к предоставленному программному обеспечению LabVIEW (дополнительный файл 2) и подождите, пока программное обеспечение вычислит текущую силу в режиме реального времени по показаниям двигателя (т. е. положению магнита). Поскольку аналитическое выражение для обратной функции d(F) недоступно, подготовьте справочную таблицу d по сравнению с F с шагом 0,1 пН путем численной оценки целевых уровней силы d. Сохраните эту таблицу в программном обеспечении, чтобы управлять управлением усилием.

3. Синтез ДНК шпилек

ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкции шпилек ДНК для экспериментов МТ получают путем ПЦР-амплификации области 510.н. в λ-ДНК с двумя пользовательскими праймерами, один из которых содержит структуру шпильки на своем 5'-конце (рис. 3A). Таким образом, мотив шпильки помещается на один конец продукта ПЦР.

  1. Подготовьте грунтовки.
    1. Прямой праймер: Праймер B_hp, который мечен 5'-биотином для прикрепления поверхности стекла и связывается с λ-ДНК. Этот праймер содержит мотив шпильки со стержнем 8.н. и петлей 6 нт, 5 футов до области λ-связывания.
    2. Обратный праймер: Праймер Z_hp, помеченный 5'-азидом для магнитного крепления шариков и связывающийся с λ-ДНК на расстоянии 1 кбп от прямого праймера.
  2. Настройте и запустите ПЦР с λ-ДНК (матрицей), nTaq-полимеразой и стандартными условиями ПЦР (см. Таблицу 1). Очистите продукт с помощью коммерческого набора для очистки.
  3. Измерьте концентрацию ДНК путем поглощения ультрафиолета на длине волны 260 нм (A260) и выполните электрофорез в агарозном геле (2% гель) (см. Таблицу 2), чтобы проверить размер продукта. Типичный выход составляет ~ 35 мкл раствора ~ 600 нМ.

4. Получение белков SNARE

ПРИМЕЧАНИЕ: Нейрональные комплексы SNARE собираются путем объединения трех очищенных белков крысы, экспрессируемых из кишечной палочки: VAMP2 / синаптобревин-2, синтаксин-1A и SNAP-25 (рис. 3B). Чтобы облегчить их сборку, синтаксин и SNAP-25 экспрессируются совместно с фрагментом VAMP2 (без N-концевой области; называемой «ΔN-VAMP2») в структуру, называемую «ΔN-комплексом», а затем смешиваются с полноразмерным VAMP2 после присоединения ДНК с образованием полных комплексов.

  1. Подготовьте плазмиды, содержащие кДНК, для экспрессии белков SNARE (последовательности ДНК для всех плазмид приведены в таблице материалов).
    1. Подготовьте 6× VAMP2 с тегом His, у которого отсутствует трансмембранный домен (2-97; L32C/I97C для дисульфидных связей) клонирован в вектор pET28a.
    2. Подготовьте синтаксин-1А, в котором отсутствует Habc и трансмембранный домен (замены 191-267, I202C/I266C для дисульфидных связей), клонированный вместе с 6×His-меченым ΔN-VAMP2 (49-96) в вектор pETDuet-1.
    3. Подготовьте полноразмерную изоформу b SNAP-25 (2-206, все от C до A), клонированную в вектор pET28a. Это будет использовано для подготовки комплексов ΔN.
    4. Подготовьте полноразмерную изоформу b SNAP-25 с 6×тегом HIS (1-206, все от C до A), клонированную в вектор pET28a, для прямого добавления в буфер анализа MT для повторной сборки комплексов SNARE после развертывания.
  2. Подготовьте две пробирки с клетками Rosetta (DE3) E. coli . Трансформируйте одну группу плазмидами VAMP2 (из шага 4.1.1), одну с синтаксином-1A/ΔN-VAMP2 и немечеными плазмидами SNAP-25 (из этапов 4.1.2 и 4.1.3) для экспрессии ΔN-комплекса, а другую с помощью плазмид SNAP-25 с тегом His (из шага 4.1.4).
  3. Перенесите трансформированные клетки в бульон Лурия-Бертани (LB) с соответствующими антибиотиками (здесь канамицин и хлорамфеникол для VAMP2 и SNAP-25 с тегом His; канамицин, хлорамфеникол и ампициллин для ΔN-комплекса). Выращивают их при 37 °C в встряхивающем инкубаторе (220 об/мин) до тех пор, пока оптическая плотность (OD) бульона не достигнет 0,7-0,9.
  4. Добавьте 1 мМ изопропил β-d-1-тиогалактопиранозид (IPTG) для индукции экспрессии белка и инкубируйте клетки в течение 3-4 ч при 37 ° C в встряхивающем инкубаторе (220 об/мин).
  5. Гранулируют клетки центрифугированием культуры при 4 500 × г в течение 15 мин при 4 ° C.
  6. Подготовьте буферы для очистки белка (см. табл. 2).
  7. Суспендировать клеточные гранулы, экспрессирующие SNARE, в 40 мл ледяного буфера лизиса и лизировать клетки ультразвуком на льду (амплитуда 15%, 5 с включена и 5 с выключена, всего 30 минут).
  8. Центрифугируют лизат при 15 000 × г в течение 30 мин при 4 °C для удаления нерастворимых материалов.
  9. Пропустите надосадочную жидкость через гравитационную колонну, заполненную 1 мл смолы Ni-NTA. Промойте смолу промывочным буфером A, затем промывочным буфером B и разбавьте белки 10 мл элюирующего буфера.
  10. Удалите трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP) и имидазол из элюента с помощью обессоливающей колонны (следуйте инструкциям производителя). Разбавьте образец PBS.
  11. Сконцентрируйте белки с помощью центробежных фильтров (отсечка 10 кДа) до ~ 70 мкМ, сохраняя при этом белки в PBS (обычно с получением 2 мл). Измерьте концентрацию белка либо с помощью ультрафиолетового (УФ) поглощения на длине волны 280 нм (A280), либо с помощью анализа Брэдфорда.
  12. Приготовьте небольшие аликвоты, заморозьте в жидком азоте и храните при температуре -80 °C до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полные комплексы SNARE будут собраны после конъюгации ΔN-комплекса на ручке ДНК (см. ниже).

5. Прикрепление дескрипторов ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Две ручки дцДНК 510.н., содержащие первичные аминогруппы на одном конце, сначала подготавливают с помощью ПЦР, а затем аминогруппы превращают в малеимидные группы с помощью бифункционального сшивающего агента SM (PEG) 2. Затем две ручки ковалентно связываются с комплексами SNARE через их цистеиновые группы для сайт-специфической конъюгации (рис. 3B).

  1. Подготовьте грунтовки.
    1. Подготовьте прямые праймеры: праймер B (для амплификации ручки B), который мечен 5'-биотином для прикрепления к поверхности стекла и связывается с λ-ДНК; Праймер Z (для усиления рукоятки Z), помеченный 5'-азидом для крепления магнитных шариков и имеющий ту же последовательность, что и праймер B.
    2. Подготовьте обратный праймер: праймер N (общий для ручки B и ручки Z), который мечен 5'-амином для конъюгации белка и связывается с λ-ДНК на расстоянии 510.н. от прямого праймера.
  2. Настройте и запустите два набора ПЦР-реакций (18 пробирок по 200 мкл для каждой ручки) с λ-ДНК (матрицей), nTaq-полимеразой и стандартными условиями ПЦР (см. Таблицу 1). Очистите продукт с помощью набора для очистки ПЦР и промойте каждую ручку 45 мкл сверхчистой воды. Используйте минимальный объем воды, чтобы получить высокую концентрацию ручек для эффективной реакции на последующих этапах.
  3. Измерьте концентрацию ДНК с помощью A260. Типичный выход составляет ~ 650 мкл раствора ~ 2 мкМ для каждой ручки. Держите небольшие образцы отдельно друг от друга для последующей проверки при электрофорезе в агарозном геле.
  4. Реагируйте на каждую рукоятку (1 мкМ в PBS) с 5 мМ SM(PEG)2. Инкубировать при комнатной температуре при аккуратном вращении. Через 1 ч используйте набор для очистки ДНК для удаления непрореагировавшего SM(PEG)2. Облейте каждую ручку 250 мкл PBS для получения ~ 2 мкМ растворов.
  5. Смешайте растворы Handle B и ΔN-комплекса в молярном соотношении 1:16 (например, 1 мкМ Handle B и 16 мкМ ΔN-комплекса) в PBS и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре с перемешиванием. Держите отдельно небольшой образец для электрофореза в агарозном геле.
  6. Добавьте раствор VAMP2 в 2,5-кратном молярном избытке над ΔN-комплексом, используемым на предыдущем этапе. Выдерживают смесь еще 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. На этом этапе собираются полные комплексы SNARE.
  7. Удалите свободные белки путем буферного обмена со свежим PBS и центробежным фильтром (отсечка 100 кДа): центрифуга при 14 000 × г в течение 5 мин при 4 °C, повторить не менее 6 раз и запустить в течение 15 мин для последнего отжима. Измерьте увеличение соотношения A260/A280, чтобы контролировать удаление свободных белков. Держите отдельно небольшой образец для электрофореза в агарозном геле.
  8. Добавьте ручку Z в раствор в 15-кратном молярном избытке над ручкой B. Поддерживайте концентрацию ручки Z по крайней мере выше 1 мкМ, чтобы облегчить реакцию. Инкубируйте смесь в течение ночи при температуре 4 °C при перемешивании.
  9. Проверьте промежуточные продукты (ручка B и ее белковые конъюгаты) и конечный продукт (комплекс SNARE с двумя ручками) с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 3B, вставка) (см. Таблицу 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если белки успешно прикреплены к ручке B, будет обнаружен сдвиг подвижности. В частности, образование полных комплексов SNARE на ручках ДНК может быть подтверждено их устойчивостью к додецилсульфату натрия (SDS), в отличие от ΔN-комплексов, которые разбираются в SDS и оставляют только синтаксин, связанный с ДНК (сравните b и c на рисунке 3B).
  10. Приготовьте небольшие аликвоты, заморозьте в жидком азоте и храните при температуре -80 °C до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что окончательный раствор содержит непрореагировавшие ручки, во время сборки образца в проточной ячейке будет выбрана только искомая конструкция, дважды меченная биотином и азидом.

6. Изготовление проточных ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Проточные ячейки для измерений МТ изготовлены из двух стеклянных покровных стекол, соединенных между собой двусторонним скотчем (рис. 3C). Одно покровное стекло покрыто смесью ПЭГ и биотинилированного полиэтиленгликоля (ПЭГ), чтобы избежать неспецифического связывания и обеспечить специфическую привязку молекул-мишеней через связь биотин-нейтравидин (рис. 3D). Затем растворы материалов для экспериментов МТ последовательно вливаются в проточную ячейку с помощью шприцевого насоса (рис. 3C, D).

  1. Подготовьте два стеклянных покровных стекла, по одному для верхней (24 мм × 50 мм, толщина No 1,5) и нижней (24 мм × 60 мм, толщина No 1,5) поверхности. Очистите покровные стекла ультразвуком в 1 м КОН в течение 30 минут. После обработки ультразвуком промойте покровные стекла дистиллированной водой и держите в воде до следующего шага.
  2. ПЭГилатировать нижнее покровное стекло в соответствии с опубликованными протоколами42,43. Используйте N- [3- (триметоксисилил) пропил] этилендиамин для силанизации и смесь биотина-ПЭГ-SVA и mPEG-SVA 1:100 (ww) в 100 мМ бикарбонатном буфере. Держите ПЭГилированные покровные стекла сухими при температуре -20 °C и храните их в течение нескольких недель.
  3. В день экспериментов выньте ПЭГилированные покровные стекла и высушите их феном с помощью азотного пистолета. Визуально осмотрите их на наличие грязи, чтобы убедиться, что они чистые.
  4. Чтобы сделать каналы для образцов, подготовьте полоски двустороннего скотча шириной ~2 мм и положите четыре полоски на нижнее покровное стекло (ПЭГилированная поверхность вверх), параллельные друг другу и отделенные друг от друга ~5 мм (рис. 3C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, в одной проточной ячейке можно создать три канала для образцов шириной 5 мм.
  5. Поместите верхнее защитное стекло в центр нижнего покровного стекла, оставив ~ 5 мм пространства на коротких краях для входных и выходных отверстий каналов. Аккуратно прижмите пинцетом заднюю часть верхнего покровного стекла, чтобы надежно закрыть каналы.
  6. Чтобы сделать впускной резервуар, обрежьте край наконечника пипетки объемом 200 мкл. Вырежьте ~ 10 мм из более широкого отверстия, чтобы обеспечить удержание ~ 200 мкл раствора. Сделайте три из них для трех каналов потока. Чтобы настроить выпускные отверстия, подготовьте три иглы для шприца, которые подходят к трубке для шприцевого насоса.
  7. Используя 5-минутную эпоксидную смолу, приклейте резервуары и игольчатые ступицы к проточной ячейке. Убедитесь, что сформировано полное уплотнение, чтобы избежать утечки, и что каналы не заблокированы излишками клея. Дайте ему высохнуть не менее 30 минут.

7. Сборка бортовых тросовых конструкций

ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы материалов для экспериментов МТ, в том числе для конструкций бортовых тросов, последовательно вводятся в проточные ячейки с помощью шприцевого насоса (рис. 3C, D).

  1. Подготовьте магнитные бусины. Возьмите 5 мг шариков M270-эпоксидной смолы из исходного раствора (~ 3,3 × 10 шариков8 в 167,5 мкл диметилформамида) и замените растворитель фосфатным буфером (см. Таблицу 2) путем магнитной сепарации шариков.
  2. Подготовьте шарики при ~ 1,1 × 109 шариках мл-1 в фосфатном буфере с 1 М сульфатом аммония и вступите в реакцию с 2 мМ дибензоциклооктина (DBCO)-NH2. Выдерживают смесь в течение 3 ч на вращающемся миксере при комнатной температуре. После реакции промойте шарики 3 раза свежим фосфатным буфером, чтобы удалить непрореагировавшие молекулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вымытые шарики можно хранить без дополнительного вращения при температуре 4 °C в течение нескольких недель перед использованием.
  3. Подсоедините иглу на выходе проточного канала к шприцевому насосу с помощью полиэтиленовой трубки. Уравновесьте каналы с помощью PBS.
  4. Последовательно вводите в канал путем всасывания с помощью насоса следующие растворы: NeutrAvidin, целевые конструкции (шпильки ДНК или комплексы SNARE с ручками ДНК), эталонные полистирольные шарики и магнитные шарики с покрытием DBCO. Перед использованием тщательно перемешайте растворы шариков, чтобы диспергировать потенциальные агрегаты шариков.
  5. Смойте несвязанные шарики, приложив 0,1 пН силы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приложение небольшой силы, направленной вверх, облегчает удаление несвязанных шариков и помогает избежать разрыва специально связанных конструкций бортового троса.
  6. Для экспериментов с комплексами SNARE включите 1,5 мкМ SNAP-25 в конечный буфер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свободные молекулы SNAP-25 могут повторно связывать комплексы SNARE после развертывания и позволяют проводить повторные измерения на одном комплексе.

8. Идентификация целевых конструкций

  1. На поверхности канала проточной ячейки найдите магнитные шарики, которые привязаны к одиночным молекулам целевой конструкции. Убедитесь, что рядом находится эталонная бусина.
  2. Поверните бусину-кандидата и убедитесь, что она свободно вращается. Если шарик привязан к нескольким молекулам, он проявляет ограниченное движение.
  3. Вращайте бусину на несколько полных оборотов и узнайте радиус вращения (эта функция реализована в предусмотренном программном обеспечении). Желательно выбирать бусину с небольшим радиусом вращения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот радиус показывает, насколько валик смещен от центра оси троса, что случайным образом определяется при сборке борт-трос30,31. Во всех экспериментах минимальное смещение бусины по центру смягчает многие артефакты, связанные с большим отношением радиуса валика к удлинению троса, которое мы используем.
  4. Увеличьте усилие от 0 до 5 пН, чтобы определить хорошие бусины с одной привязью. Обратите внимание на большое изменение дифракционной картины бусины, возникающее в результате растяжения троса со скоростью 1 кбит/с (или эквивалентных двух ручек с частотой 510.н.). Если дифракционная картина существенно не изменится, уменьшите силу до нуля и найдите другой валик-кандидат.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подъем бусины ~ 300 нм можно легко заметить по необработанным изображениям без фактического запуска процесса отслеживания.

9. Отслеживание борта для измерений удлинения

ПРИМЕЧАНИЕ: Отслеживание бусин осуществляется путем анализа изображений бусин в режиме реального времени в программном обеспечении LabVIEW, поставляемом с этой статьей. Метод слежения и его варианты использовались в большинстве традиционных систем МТ и объяснялись в предыдущей литературе 2,5,7,26. Измеряя положение магнитного шарика относительно неподвижного эталонного валика (т. е. дифференциальное отслеживание), измерения положения становятся чрезвычайно устойчивыми к внешнему возмущению.

  1. После того, как подходящая магнитная бусина будет расположена вместе с эталонной бусиной, нажмите кнопку «Калибровка », чтобы начать подготовку к отслеживанию бусин.
  2. Нажмите на бусины на изображении, чтобы определить расположение бусин. Затем изображения будут обрезаны до областей интереса (ROI) (например, 150 x 150 пикселей для бусины 3 мкм) вокруг бусин, а затем дополнительно проанализированы для извлечения точных координат бусин.
  3. Дождитесь завершения вращения магнита. Этот процесс записывает x- и y-координаты валика (путем вычисления 2D-перекрестной корреляции44 или с использованием радиальной симметрии45 изображений валика с сопоставимой производительностью) при вращении магнитов для документирования смещенного от центра прикреплениявалика 31.
  4. Для слежения в направлении z дождитесь, пока программа сгенерирует справочную таблицу дифракционных изображений бусин на разных расстояниях от фокальной плоскости. Это осуществляется путем ступенчатого перемещения линзы объектива с помощью пьезосканера с равноудаленными шагами и записи усредненных по флуктуациям изображений шариков в каждом положении. Затем z-координаты бусин в реальных экспериментах определяются путем сравнения изображений бусин в реальном времени с таблицей поиска с интерполяцией7.
  5. Когда генерация справочных таблиц будет завершена, включите слежение и автофокусировку (нажмите кнопки Track ? и AF? Buttons) и нажмите кнопку «Получить », чтобы начать запись положения бусин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Автофокусировка не является обязательной, но рекомендуется для коррекции дрейфа ступени в z во время съемки.

10. Схемы принудительного применения

  1. Эксперименты с наращиванием силы: Чтобы проверить соотношение силы и удлинения конструкции, примените увеличение силы вверх и вниз с постоянной скоростью нагрузки (± 1,0 пН с-1) (рис. 4A). Например, примените три раунда цикла 0-20-0 pN, чтобы проверить общую длину конструкции и кривую разгибания усилия ручек.
  2. Указав параметры троса в программном обеспечении, наложите кривую силового удлинения WLC поверх измеренных данных и определите, привязан ли целевой шарик подлинной конструкцией образца с правильными ручками ДНК. В качестве отправной точки используйте известную длину контура (например, ~340 нм для дцДНК 1 кбит/с) и длину персистенции WLC (30-45 нм для короткой дцДНК31). При необходимости примените метод коррекции расширения, описанный в шаге 2.11.
  3. Если конструкция проверена, подробно изучите реакцию силы-расширения, чтобы найти дополнительное расширение, возникающее в результате молекул-мишеней-шпилек или комплексов SNARE.
  4. Эксперименты с постоянной силой: Постепенно изменяйте приложенную силу дискретными шагами, чтобы исследовать силовую чувствительность молекул-мишеней (рис. 4B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: МТ позволяют проводить простые и эффективные эксперименты с постоянной силой, потому что приложенная сила поддерживается постоянной, когда магниты удерживаются неподвижно.
    1. Для шпилек ДНК приложите усилие 4-8 пН с шагом 0,2-0,5 пН и измерьте положение шарика в течение ~ 10 с на каждом уровне силы.
    2. Для комплексов SNARE приложите усилие 14-16 пН с шагом 0,1-0,2 пН и измерьте положение валика в течение ~10 с на каждом уровне силы.
  5. Эксперименты с силовыми прыжками: Наблюдайте за переходными событиями комплексов SNARE.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты с силовыми скачками, как и эксперименты с постоянной силой, включают изменения уровней силы. Однако силовые скачки используют более резкие изменения приложенной силы, что позволяет отслеживать события, вызванные силой в исследуемых молекулах, такие как внезапный разрыв белковых комплексов. Например, поскольку комплексы SNARE проявляют структурный гистерезис при циклическом движениисилы 23, информативно проводить эксперименты с силовыми скачками и измерять задержку перехода (рис. 4C).
    1. Распаковки: Отслаивание молекулы VAMP2 от интактного тройного комплекса SNARE, оставляя бинарный комплекс синтаксина-1A и SNAP-25.
    2. Повторное застежка: Застежка-молния распакованной молекулы VAMP2 для регенерации интактного комплекса SNARE.
      1. Разворачивается: Полная разборка комплекса SNARE сопровождается полной диссоциацией SNAP-25. Только молекулы VAMP2 и синтаксина остаются в конструкции после развертывания.
      2. Складывание: Регенерация комплекса SNARE при связывании свободной молекулы SNAP-25 с буфера.
  6. При 2 pN индуцируют сборку интактного комплекса SNARE, ожидая (~ 30 с) ассоциации свободной молекулы SNAP25. Внезапное уменьшение протяженности наблюдается при образовании комплекса SNARE.
  7. Чтобы наблюдать за событиями распаковки, подождите несколько секунд при 10-12 пН, а затем резко переходите к 14-15 пН с максимально возможной скоростью двигателя. В зависимости от целевой силы комплекс SNARE будет демонстрировать либо обратимый переход между частично распакованными промежуточными продуктами (как в экспериментах с постоянной силой), либо скачок ~ 25 нм в более высокое, разархивированное состояние после случайного времени ожидания (или задержки).
  8. Чтобы наблюдать за событиями повторного застеживания, уменьшите усилие до 10-12 пН сразу после того, как будет наблюдаться расстегивание. Опять же, комплекс SNARE демонстрирует стохастический переход в нижнее состояние с застежкой-молнией после некоторой случайной задержки. Если разворачивание произошло после распаковки, комплекс не сможет застегнуться повторно, так как молекула SNAP-25 будет отсутствовать.
  9. Чтобы наблюдать за разворачивающимися событиями, подождите более длительный период после того, как будет наблюдаться распаковка, чтобы обнаружить дальнейшее увеличение расширения (~ 2 нм).

11. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Типы анализа, который можно проводить с данными МТ, зависят от целевой системы. Тем не менее, существуют общие подходы к извлечению полезной информации из соответствующих экспериментов, описанных на рисунке 4. Все анализы выполняются с помощью MATLAB (R2021a) с использованием пользовательских кодов, предоставленных в этой статье. Эти коды генерируют графики, используя те же данные, что и в этой статье. Обратите внимание, что в то время как необработанные данные отслеживания 100 Гц были взяты непосредственно для анализа, данные отслеживания 1,2 кГц обычно подвергались медианной фильтрации (с пятиточечным скользящим окном) перед анализом для уменьшения шума (за исключением анализа шума).

  1. Эксперименты с наращиванием силы: Проанализируйте соотношение силы и растяжения (например, упругость полимеров) и переведите силу для извлечения информации о наномеханических свойствах.
  2. Эксперименты с постоянной силой: Проанализируйте популяции состояний и время пребывания (или скорость перехода) в зависимости от силы для извлечения структурных (например, областей, участвующих в переходе), термодинамических (например, разность свободных энергий) и кинетических (например, энергетический барьер) параметров конформационных изменений.
  3. Эксперименты с силовыми прыжками: Проанализируйте кинетику разрыва (например, белок-белковые взаимодействия и связывание рецептор-лиганд) или время жизни переходных промежуточных продуктов (например, разворачивание биомолекул) для извлечения стабильности молекул-мишеней и их состояний.
  4. В качестве репрезентативных приложений проанализируйте данные образцов для шпилек ДНК и комплексов SNARE:
    1. Переходы шпильки ДНК с двумя состояниями: сила расстегивания, расстояние открытия, силовая зависимость сдвига популяции, а также измерения назначения состояний и скорости перехода с помощью скрытой марковской модели (HMM) (предоставлены коды MATLAB).
    2. Конформационные изменения комплексов SNARE: сила распаковки, силовая зависимость промежуточных состояний и латентности распаковки, гистерезис при повторном застежке и поведение разворачивания/сворачивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Модели расширения силы для ручек ДНК, шпилек ДНК и конформаций комплекса SNARE приведены в предыдущих ссылках14,31.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Калибровка по усилию
Результаты двух методов измерения силы (дисперсия бокового смещения шариков и анализ спектра мощности) отличались на 0-2 пН (рис. 2G). Согласно результатам, приведенным на рисунке 2F, мы можем надежно достигать до 30 пН с помощью обычных неодимовых магнитов.

Переходы с двумя состояниями шпильки ДНК 8.н.
Сначала мы исследовали наномеханику короткой шпильки ДНК (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой работе мы представили установку одномолекулярной силовой спектроскопии, которая может наблюдать структурные изменения биомолекул с высокой пространственно-временной точностью. Используемая высокоскоростная CMOS-камера снимает 1 200 кадров с-1 с разрешением 1 280 x 1 024, что позволяет отслеживать шарики с частотой 1,2 кГц. Однако скорость измерений в настоящее время ограничена программным обеспечением для отслеживания шариков, поэтому рентабельность инвестиций обычно снижается до меньших площадей при вы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 и NRF-2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. была поддержана грантом NRF (2021R1C1C2009717).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis systemAdvanceMupid-2plus
DNA ladderBioneerD-1037
nTaq полимеразаEnzynomicsP050A
Набор для очистки ПЦРLaboPassCMR0112
PEGylated SMCC сшивающий / SM(PEG)2ThermoFisher Scientific22102для SNARE– Сопряжение ДНК
Праймер BBioneer5'-Биотин/TCGCCACCATCATCATTTCCA-3'Длякалибровочной конструкции силы 5-kbp и ручек ДНК
Праймер B_hpIDT5'-Биотин/TTTTTTTTTTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP сайт/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'Для		шпильки конструкт
Праймер NBioneer5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3'Дляручек ДНК
Праймер ZBioneer5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3'Дляручек ДНК
Праймер Z_5kBioneer5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGA
TCG-3'Для		калибровочной конструкции 5-kbp Force Calibration Primer
Z_hpBioneer5'-Azide/GTGGCAGCATGACAC-3'Дляшпильки конструкт
SYBR Safe DNA Gel StainThermoFisher ScientificS33102
λ-DNABioneerD-2510Матричная цепь для ПЦР
<стронных>последовательностей ДНК для белков SNARE
6× Его тег SNAP-25b (2-206; с заглавной буквы) в pET28aсамодельныйtggcgaatgggacgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtgtggtgtgtttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcttctttcctctctcctttt
ctcgccacgttcgccggctttccccccgtcaag
ctctaaatcgggggggctttagggggg
atttagtgctttacggcaccgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagagggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaaacactca
accctatctcggtctatttattata
agggattttgccgatttcggtattggtta
aaaaatgagctgatttaaatttaacg
cgagatttgccggggcttattatttabr/ aaaaatgagctgatttaaatttaacgbr/ cgagattatttabr/ cgaaatgagctgatttaaatttaacgbr/ cgagattgccggggcggtatttabr/ aaaaatgagctgatttaaatttaacgbr/ cgagattgccgggggctatttabr/ aaaaatgagctgatttaaatttaacgbr/ cgagatttt attttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttttttaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaactcatcgagcatcaaatgaa
ctgcaatttattattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctctaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaataacctatta
atttcccc tcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacactgaatgaatcc
ggtgagaatggcaaaaagtttatgcatttttt
tccagacttgttccaaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaa
CCGTTATTCATTCGTGattgcgcctga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacgaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattctcttaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctctct
gtaacatcattggcaacgctctgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccattattacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccttttattactgt
ttatgtaagcagacagttttttatttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttctcca
ctgagcgtcagaccccgtagaagatcaaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgctgctgcaaaccacc
gctaccagcggtgtttttgccggatcaa
gagctaccaactttttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgttaggccaccac
gcttcagcagagcagataccaaatactgtbr/ ccttctagtaggccaccacbr/br/ ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccgatataagg
cgcagcgggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacctac
accgaactgagatacctactacagcgtgagctat
gagaaagcgccacgtcccgaaggaaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagccacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtattttagtcctgt
cgggtttcgccacctgacttgagcgtcga
ttttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggttttt
acggttcctggttttgctggttgct
CacatgtTCTTTCCTgCTtatCCTGATT
CTGTGGATAACCgtattaccgCCTGAGTG
AGCTGATACCGCTCGCgCAGCCGAACGACC
Gagcgcagcgagtcagtgagcgaagcgg
AAGCGcctgatgcggtttccttac
g g22 g22 catctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctgctgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtggcatggctgcgccgg
acacccgccaacacccgctgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcag
cgtggtcgtgaagcgattcagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggctctgataa
agcgggccatgttaagggcgtttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtaaggggga
tttctgtttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatggatgctcacgatacggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacactggcggtatggatgc
ggcgggaccagaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccac agggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgactccgcgtttccagacttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccta
gccgggtcctcaacgaggagcaccatcat
gcgcacccggggggcccatgccggggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgggg
cggcaccggggcgcgcbr gaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgcgctcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
caccgtcctacgagtgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaaa
ttgcgttgcactgcccgctttccagtc
ggg gaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgggggggagaggcgttgc
gtattgggccccaggggttttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggcctgagagagtgcagcaag
cggtccacgctgttgcccccaggcgaa
aatcctttttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatct gatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggttttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagattatgccagc
cagccagacgcagcgcgccagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacca
gtcgcgtaccctcatgggagaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
TGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTAC
aggcttcgacgccgcttctccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgcgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactttttgcccgccagt
tgttgtgccacgcgggggaatgtaattca
gctccgccatcgccgctccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacggggaaacgtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatgccatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacacccccggc
cacacccccggcbr/ cacacccccggc ggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgcagcaaccgcacctggcgccggtg
atgccggccccacgatgcgtccggcggcgagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttttttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCATCACA
GCAGCGGCCTGGTGCCGCGC
GGCAGCAGCAG GGCAGCAGCAGCbr/ AGCCATCATCATCATCATCATCACAbr/ GCAGCGGCCTGGTGCCGCCbr/ GGCAGGCGC GGCAGGCAG GGCAGCAGCAGC GGCAGCAGCAGCbr/ AGCCATCATCATCATCATCATCATCACAbr/ GCAGCGGCCTGGTGCCGCGCbr/ GGCAGGagcagcaccatactagcggagat
ATCGCCGAGGACGCAGACAT
GCGCAATGAGCTGGAGGAGA
TGCAGAGGAGGGCTGACCAG
CTGGCTGATGAGTCCCTGGA
AAGCACCCGTCGCATGCTGC
AGCTGGTTGAAGAGAGAAA
GATGCTGGCATCAGGACTTT
GGTTATGTTGGATGAGCAAG
GCGAACAACTGGAACGCATT
GAGGAAGGGATGGACCAAAT
CAATAAGGACATGAAAGAAG
CAGAAAAGAATTTGACGGAC
CTAGGAAAATTCGCCGGCT
TGCCGTGGCCCCCGCC ccaac
AAGCTTAAATCCAGTGATGC
TTACAAAAAAGCCTGGGGC
AATAATCAGGATGGAGTAGT
GGCCAGCCCCccg
TGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTG
GCTTCATCCGCAGGGTAAC
AAATGATGCCCGGGAAAAT
GAGATGGATGAGAACCTG
GAGCAGGTGAGCGGCATC
ATCGGAAACCTCCGCCAC
ATGGCTCTAGACATGGGCA
ATGAGATTGACACCCAGA
ATCGCCAGATCGACAGGA
TCATGGAGAAGGCTGATT
CCAACAAAACCAGAATTG
ATGAAGCCAACCAACGTG
CAACAAAGATGCTGGGAA
GTGGTTAAggatccgaattcgag
ctccgtcgacaagcttgcggccgcactc
gagcaccaccaccaccaccactgagat
ccggctgctaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgag
caataactagcataaccccttggggct
ctaaacgggtctgaggggttttttgctga
aaggaggaactatatccggat
6× Его тег VAMP2 (2-97, L32C/I97C; с заглавной буквы) в pET28a самодельныйtggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtggtggtgtgtgtttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctctcttcttcttttttbr ctcgccacgttcgccggctccccccgtcaag
ctctaaatcgggggggctctattattggttccg
atttagtgctttacggcaccccaaa
aaacttgattagggtgatggtggttcacgtg
ggccatcgccctgaggtttttcgccc
ggactcttgttccaaactggaaacactca
accctatctcggtctatttattata
agggattttgccgatttcggtattggtta
aaaaatgagctgatttaaatttaacg
cgagatttgccggggcttattatttabr/ aaaaatgagctgatttaaatttaacgbr/ cgagattatttabr/ cgaaatgagctgatttaaatttaacgbr/ cgagattgccggggcggtatttabr/ aaaaatgagctgatttaaatttaacgbr/ cgagattgccgggggctatttabr/ aaaaatgagctgatttaaatttaacgbr/ cgagatttt attttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttttttaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaactcatcgagcatcaaatgaa
ctgcaatttattattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctctaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaataacctatta
atttcccc tcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacactgaatgaatcc
ggtgagaatggcaaaaagtttatgcatttttt
tccagacttgttccaaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaa
CCGTTATTCATTCGTGattgcgcctga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacgaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattctcttaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctctct
gtaacatcattggcaacgctctgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccattattacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccttttattactgt
ttatgtaagcagacagttttttatttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttctcca
ctgagcgtcagaccccgtagaagatcaaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgctgctgcaaaccacc
gctaccagcggtgtttttgccggatcaa
gagctaccaactttttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgttaggccaccac
gcttcagcagagcagataccaaatactgtbr/ ccttctagtaggccaccacbr/br/ ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccgatataagg
cgcagcgggttcgtg
cacacagcccagctggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgctccgaaaa
ggcggacagaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgaggcttcca
gggggaaacgcctggtattttagtcctgt
cgggtttcgccacctgacttgagcgtcga
ttttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggttttt
acggttcctggttttgctggttgct
Cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctgagtg
agctgataccgctcgcgcgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagtgagcgaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattctccttac
ggccagcgagtgaggagt catctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctgctgatgc
cgcatagttaagccagtatccgctat
cgctacgtgactgggtgggtggctgcgccgg
acacccgccaacacccgctgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcag
cgtggtcgtgaagcgattcagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggctctgataa
agcgggccatgttaagggcgtttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtaaggggga
tttctgtttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatggatgctcacgatacggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacactggcggtatggatgc
ggcgggaccagaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccac agggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgactccgcgtttccagacttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccta
gccgggtcctcaacgaggagcaccatcat
gcgcacccggggggcccatgccggggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgggg
cggcaccggggcgcgcbr gaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgcgctcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
caccgtcctacgagtgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaaa
ttgcgttgcactgcccgctttccagtc
ggg gaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgggggggagaggcgttgc
gtattgggccccaggggttttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggcctgagagagtgcagcaag
cggtccacgctgttgcccccaggcgaa
aatcctttttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatct gatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggttttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagattatgccagc
cagccagacgcagcgcgccagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacca
gtcgcgtaccctcatgggagaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
TGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTAC
aggcttcgacgccgcttctccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgcgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactttttgcccgccagt
tgttgtgccacgcgggggaatgtaattca
gctccgccatcgccgctccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacggggaaacgtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatgccatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacacccccggc
cacacccccggcbr/ cacacccccggc ggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgcagcaaccgcacctggcgccggtg
atgccggccccacgatgcgtccggcggcgagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttttttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCATCAC
AGCAGCGGCTGGTGCCGC
GCGGCAGCCATA tggcagat
CTCTCGGCTACCGCTGCCAC
CGTCCCGCCGCC
GCCGGCGAGGGGGGCCCCC
CTGCACCTCCTCCAAATCTTA
CCAGTAACAGGAGATGCCAG
CAGACCCAGGCCCAGGTGG
ATGAGGTGGTGGACATCATG
AGGGTGAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAG
CTATCGGAACTGGATGg
CGCAGATGCCCTCCAGGCA
GGGGCCTCCCAGTTTGAAA
CAAGTGCAGCCAAGCTCAA
GCGCAAATACTGGTGGAAA
AACCTCAAGATGATGTGCTA
Aggatccgaattcgagctccgtcg
acaagcttgcggccgcactcgagcacca
ccaccaccactgagatccggctgctaaaa
gcccgaaaggaagctgagtggctgctgcca
ccgctgagcaataactagcataaccccttgg
ggcctctaaacgggtcttgaggggttttg
ctgaaaggaggaactatatccggat
6× Его тег &Дельта; N-VAMP2 (49– 96; с заглавной буквы) и Синтаксин-1А (191– 267, I202C/I266C; с заглавной буквы) в pETDuet-1homemadeggggaattgaattgagcggataacaattcctc
tagaaataattttttttttaactttaagaagga
gatataccATGGGCAGCAGCCATCA
TCATCATCATCACAGCAGCGG
CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG
GCCCGGTAATGTGGACACACbr/ GCCCGGTAATGTGGACACGG aaggt
CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT
ATCGGAACTGGATCGCGC
AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC
CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC
AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC
TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT
GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca
gaaagtaatcgtattacacggccgcataa
tcgaaattaatacgactataggggaat
tgtgagcggataacaattccccatcttagta
tattagttaagtataagaagagatatacat
ATGGCCCTCAGTGAGTGAGTGAGT gatcgaga
CCAGGCACAGTGAGTGCATC
AAGTTGGAGAACAGCATCCG
GGAGCTACACGATATGTTCAT
GGACATGGCCATGCTGGTGG
AGAGCCAGGGGGAGATT
GACAGGATCGAGTACAATGTG
GAACACGCTGTGGACTACGTG
GAGAGGGCCGTGTCTGACACC
AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG
AGCAAGGCACGCAGGAAGAA
GTGCATGATCTAActcgagtc
tggtaaagaaaccgctgcgaaatttgaa
cgccagcacatggactc. gtctactagcgcag
cttaattaacctaggctgctgccaccgctga
gcaataactagcataaccttggggcct
aaacgggtgtgaggggttttttgctgaaag
gaggaactatatccggggattggcgaatgggac
gcgccctgtagcggcggcgg
gtgtggtgttacgcgcagccgtgaccgctac
acttgccagcgccttc
gctttcttcccttcctttcgc
ccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggg
gctccctttagggttccgatttagtgcttta
br/ 2 cggcacctcgaccccaaaaaacttgattagg
gtgatggttcacgtagtgggccatcgccctg
atagacggtttcgccctgacgttggag
tccacgttctttaatagtggactcttcttcc
aaactggaacaacactcaaccctatctcggt
ctattctttttattttgccg
atttcggcctattggttaaaaatgagctga
tttaacaatttaacgcgaattttaa
aatattaacgtttacaatttggcggcacg
atggcatgagattatcaaaaggatcttcac
ctagatccttttaaaaatgaagtttt
aaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtga
ggcacctatctcagcgatctctatttcgtgtctcttcgt
tcatccatagttgccgt
agataactacgatacgggagggcttaccatc
tggccccagtgctgcaatgataccgcgagac
ccacgctcaccggggcagatttatcaaa
taaaccagccagccggagggggagcgca
gaagtggtcctgcaactttatccgcccatc
cagtggccccggagcabr/ gaaggtcctgccgagcgabr/ gaagtggctgcaccgcc ctattaattgttgccgggaagctagag
taagtagttcgccagttaatagtttttgcgcaa
cgttgttgccattgctaggcatcgtggtg
tcacgctcgtcgtttggtatggctattca
gctccggttcccaacgatcaaggcgagttac
atgatcccccatgttgtgcaaaagcggtt
agctccttcggtcctccgatcgttcagaa
gtaagttggccgcagttatcactcatggt
tatggcagcactgcataattctcttactgtc
atgccatccgtaagatgctttttctgactg
gtgagagcactgbr/ gtgagcactgbr/ gtgagcact gtactcaaccaagtcattctgagaata
gtgtatgcggcgaccgagtgctcttgcccg
gcgtcaatacgggataataccgcgccacata
gcagaactttaaaagtgctcatcattggaaa
acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatc
ttaccgctgttgagatccagttcgatgaaac
ccactcgtgcacccaactgatcttcagcatc
ttttactttcaccagcgtctgggtgagcaaa
aacaggaaggcaaaatgccgcaaagg
gaataagggcgacacggaaatgttgaatact
catactcttcctttcaatgattgaag
catttatcagggttattgtctcatgagcgga
tacatatttgaatgaaac
aaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtg
agttttcgttccactgagcgtcagaccccgt
agaaaagatcaaaggatcttcttgagatcct
ttttttctgcgcgtaatctgctgctgcaaa
caaaaaaaccaccgaccagcgggtgttg
tttgccggatcaagagctaccaactcttttttt
ccgaaggtaactggcttcagcagagcgcaga
2 taccaaatactgtccttctagtgtagccgta
gttaggccaccactccaagaactctgtagca
ccgcctacatacctcgctgctaatcctgt
taccagtggctgctgccagtggcgataagtc
gtgtcttaccgggtggactcaagacgatag
ttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaa
cggggggggtgtgcacaccacagcttgga
gcgaacgacctacaccgaactgagataccta
cagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttccc
gaagggagaaggcggacaggtatccggta
ag agaggtagagccc cggcagggtcggaacaggagagccac
gagggagcttccagggggaaaacgcctggtatc
tttatagtcctcgggtgggtttcgccacctctg
acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtca
ggggggcggggagcctatggaaacgccagc
aacgcggcctttacggttcctggttg
ctggccttttgctcacatgttctttcctgcg
ttatcccctgattctgtggataaccatta
ccgcctttgagtgagctgatgataccgctcgcgc
agccgaacgaccgagcgagtg
agcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg
tattttccttactacgcatgtgcggtgtatttc
acaccgcatatatggtgcactctcagtacaa
tctgctctgatgccgcatagttaagccagta
tacactccgctatcgactgggtca
tggctgcgcccgacccgccaacacccgc
tgacgcgccctggggctgtctgctgctcccg
gcatccgcttacagacaagctgtgaccct
ccgggagctgcatgtcagaggttttcaccacc
gtcatcaccgaaacgcgcgcgg
br/ taaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgatt
cacagatgtctgcctgttcatccgcgtccag
ctcgtgagtgagtctccagaagcgttaatgtc
tggctctgataaaagcggccatgttaaggg
cggttttttcctgtggtcactgatgcctc
cgtgtaagggggatttcttcatgggggta
atgataccgatgaaaacgagaggatgctca
cgatacgggttactgatgaacatgcccg
gttactggaacgtgtgagggtgaaacaactg
gcggtatggatgcggcgggaccagagaa
tcactcagggtcaatgccagcgcttcttaa
tacagatgtaggtgtgttccacagggtagccag
cagcatcctgcgatggaacataa
tggtgcagggcgctgacttccgcgtttccag
actttacgaaacggaaaccaccatt
Catgttgttgctcaggtcgcagacgttttgc
agcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtat
cggtgattcattctgctaaccagtaaggcaa
ccccgcccccctagccgggggtccaacgaca
ggagcacgatcatgctagtcatgcccgcgc
ccaccggaaggagctgactgggttgaaggct
ctcaagggcatcggtcgagatcggcct
aatgagtgagctaacttaattgcgtt
gcgctcactgcccgctttccgggaaac
ctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcc
aacgcgcggggggcggtttttgcgtattgg
gcgccagggtgtttttcaccagtga
gacggcaacagctgattgcccttcaccgcc
tggccctgagagagtgcagcaagcggtcca
cgctggtttgcccaggcgaaaatcctg
tttgatggtggttaacggcgggatataacat
gagctgtctcttcggtatcgtcgtatcccacta
ccgagatgtccgcaccaacgcgccccgga
ctcggtaatggcgcgcgcattgcgcgcc
atctgatcgtgtggcaaccagcatcgcagtgg
gaacgatgccctcattcagcatttgcatggt
ttgttgaaaaccggacatggcactccagtcg
ccttcccgttccgctatcggctgaattg
tgcgagtgagatatttatgccagccagccag
acgcagacgcgcgccgaagaacttaatggg
ccc GCtaacagcgcgatttgctggtgaccca
atgcgaccagatgctccacccagtcgcgt
accgtcttcatgggagaaaatactgttg
atgggtgtctggtcagagacatcaagaaata
acgccggaacattagtgcaggcagctcccac
AGCAATGGCATCCTGcatCCagcggatag
ttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcga
gaagattgtgcaccgccgctttacaggcttc
gacgccgcttcgttctaccatcgacaccacc
acgctggcacccagtgatcggcgcgagat
taatccaccacc gccgcgacaatttgcgacggcgcgtg
cagggccagactggaggtggcaacgccaatc
agcaacgactgtttgcccgcagttgtg
ccacgcggttgggaatgtaattcagctccgc
catcgccgctccactttttcccgctttc
gcagaaacgtggctggcctggttcaccacgc
gggaaacggtctgataagagacggcata
ctctgcgacatctatataacgttactggtttc
acattcaccaccctgactctccg
ggcgctatcatgccataccgcgaaaggttt
gccaccctccgbr/ ggcgctatcatgccataccgcgaaaggtttbr/ gccgcttcgbr/ ggcgctatcatgccataccgcgaaagttttbr/ gcctccgbr/ ggcgctatcatgccataccgcgaaagttttbr/ gcctccgbr/ ggcgctatcatgccataccgcgaaaggtttbr/ gcaccctccgbr/ ggcgctatcatgccataccgcgaaaggtttbr/ gccaccctggtt gccattcgatggtccgggggatctcgacg
ctctcccttatgcgactcctgcattaggaag
cagcccagtagtaggttgaggtgagca
ccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaagga
gatggcgcccaacccgggg
cctgccaccatacccacgccgaaacaagcgc
tcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttc
cccatcggtcggcgatataggcgcca
gcaaccgcacctggcggcgccggtgatgccgg
ccacgatgcgtccggcggcgtagaggatcgagat
cgatcgatcccgcgaaattaatacgactc
actata
SNAP-25b (1– 206, все С - А; с заглавной буквы) в pET28aсамодельныйtggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcgggggtgtggtgtgtgtgtтакcgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctctcttctttt
ctcgccacacttgccagctagcbr/ gcccgctctcttcttttbr/ ctcgccac gttcgccggggctccccccgtcaag
ctctaaatcgggggggctctttagggttccg
atttagtgctttacggcaccccaaa
aaacttgattagggtgatggtggttcacgtg
ggccatcgccctgataptttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaaacactca
accctatctcggtctatttattata
agggattttgccgatttcggtattggtta
aaaaatgagctgatttaaatttaacg
cgagatttgccggggcttattatttabr/ aaaaatgagctgatttaaatttaacgbr/ cgagattatttabr/ cgaaatgagctgatttaaatttaacgbr/ cgagattgccggggcggtatttabr/ aaaaatgagctgatttaaatttaacgbr/ cgagattgccgggggctatttabr/ aaaaatgagctgatttaaatttaacgbr/ cgagatttt attttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttttttaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaactcatcgagcatcaaatgaa
ctgcaatttattattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctctaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaataacctatta
atttcccc tcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacactgaatgaatcc
ggtgagaatggcaaaaagtttatgcatttttt
tccagacttgttccaaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaa
CCGTTATTCATTCGTGattgcgcctga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacgaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattctcttaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctctct
gtaacatcattggcaacgctctgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccattattacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccttttattactgt
ttatgtaagcagacagttttttatttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttctcca
ctgagcgtcagaccccgtagaagatcaaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgctgctgcaaaccacc
gctaccagcggtgtttttgccggatcaa
gagctaccaactttttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgttaggccaccac
gcttcagcagagcagataccaaatactgtbr/ ccttctagtaggccaccacbr/br/ ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccgatataagg
cgcagcgggttcgtg
cacacagcccagctggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgctccgaaggaaaa
ggcggacagaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgaggtcc
agggggaaa aacgcctggtattttagtcctgt
cgggtttcgccacctgacttgagcgtcga
ttttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaaacgccagcaacgcggttttt
acggttcctggttttgctggttgct
Cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctgagtg
agctgataccgctcgcgcgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagtgagcgaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattctccttac
ggccagcgagtgaggagt catctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctgctgatgc
cgcatagttaagccagtatccgctat
cgctacgtgactgggtgggtggctgcgccgg
acacccgccaacacccgctgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcag
cgtggtcgtgaagcgattcagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggctctgataa
agcgggccatgttaagggcgtttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtaaggggga
tttctgtttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatggatgctcacgatacggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacactggcggtatggatgc
ggcgggaccagaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccac agggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgactccgcgtttccagacttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccta
gccgggtcctcaacgaggagcaccatcat
gcgcacccggggggcccatgccggggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgggg
cggcaccggggcgcgcbr gaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgcgctcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
caccgtcctacgagtgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaaa
ttgcgttgcactgcccgctttccagtc
ggg gaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgggggggagaggcgttgc
gtattgggccccaggggttttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggcctgagagagtgcagcaag
cggtccacgctgttgcccccaggcgaa
aatcctttttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatct gatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggttttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagattatgccagc
cagccagacgcagcgcgccagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacca
gtcgcgtaccctcatgggagaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
TGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTAC
aggcttcgacgccgcttctccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgcgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactttttgcccgccagt
tgttgtgccacgcgggggaatgtaattca
gctccgccatcgccgctccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacggggaaacgtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatgccatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacacccccggc
cacacccccggcbr/ cacacccccggc ggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgcagcaaccgcacctggcgccggtg
atgccggccccacgatgcgtccggcggcgagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttttttaactt
taagaaggagatataccATGGCCGA
GGACGCAGACATGCGCAATG
AGCTGGAGGAGATGCAGAGG
AGGGCTGACCAGAGAG ctggctga
TGAGTCCCTGGAAAGCACCC
GTCGCATGCTGCAGCTGGTT
GAAGAGAGTAAAGATGCTGG
CATCAGGACTTTGGTTATGTT
GGATGAGCAAGGCGAAC
TGGAACGCATTGAGGAAGGG
ATGGACCAAATCAATAAGGAC
ATGAAAGAAGCAGAAAAGAAT
TTGACGGACCGAAAATTC
GCCGGCCTTGCCGTGGCC
CGCCAACAAGCTTAAATCCAG
TGATGCTTAAAAAAGCCTG
GGGCAATAATCAGGATGGAGT
AGTGGCCAGCCTGCCC
GTGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTGGC
TTCATCCGCAGGGTAACAAAT
GATGCCCGGGAAAATGAGATG
GATGAGAACCTGGAGCAGGT
GAGCGGCATCGGAAACCT
CCGCCACATGGCTCTAGACAT
GGGCAATGAGATTGACACCCA
GAATCGCCAGATCGACAGGAT
CATGGAGAAGGCTGATTCCAA
CAAAACCAGAATTGAAGC
CAACCAACGTGCAAAAGAT
GCTGGGAAGTGGTTAA
ctcgagcaccaccaccaccaccactgag
atccggctgctaacaaaagccgaaagga
agctgagtggctgctgccgccgc
aataactagcataaccccttggggcctc
taaacgggtcttgaggggttttgctgaa
aggaggaactatatccggat
Materials for protein purificaiton
2-MercaptoethanolSIGMAM3148-25ML
Агар LPS РастворAGA500
Ампициллин, Натриевая сольPLSAC1043-005-00
ХлорамфениколPLSCR1023-050-00
Компетентные клетки ( E. coli)Novagen70956Rosetta(DE3)pLysS
ГлицеринSIGMAG5516-500ML
HEPESSIGMAH4034-100G
Соляная кислота / HClSIGMA320331-500ML
ИмидазолSIGMAI2399-100G
Изопропил &бета;-D-1-тиогалактопиранизид / IPTGSIGMA
Канамицина сульфатPLSKC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) БульонLPS SolutionLB-05
Ni-NTA смолаQiagen30210
PD MiniTrap G-25 (обессоливающая колонна)CytivaGE28-9180-07Инструкции см.: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Фенилметилсульфонилфторид / PMSFThermoFisher Scientific36978
Плазмиды для белков SNAREклонированы в домеН/ДДоступны по запросу
коктейль ингибиторов протеазыgenDEPOTP3100
Натрия хлоридSIGMAS5886-500G
Натрия фосфат двухосновной / Na2HPO4SIGMAS7907-100G
Натрий фосфат одноосновной / NaH2PO4SIGMAS3139-250G
Трис(2-карбоксиэтил)фосфин / TCEPSIGMAC4706-2G
Тризма базаSIGMAT1503-250G
<прочные>Материалы для сборки образцов
Biotin-PEG-SVALAYSAN BIO, BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1gДля ПЭГилирования
дибензоциклооктин-амин / DBCO-NH2SIGMA761540-10MGДля нанесения бисера
Двухсторонняя лента3M136Для сборки проточной ячейки
Эпоксидный клейDEVCONS-208Для сборки проточной ячейки
Стеклянный покровный лист для нижней поверхностиVWR48393-251Прямоугольный, 60&кратный; 24 мм, #1.5
Стеклянный покровный колпак для верхней поверхностиVWR48393-241Прямоугольный, 50 раз; 24 мм, #1.5
Магнитный шарикThermoFisher Scientific14301Dynabeads M-270 Эпоксидная смола, 2.8 μ m
mPEG-SVALAYSAN BIOmPEG-SVA 1gДля ПЭГилирования
N,N-диметилформамид / DMFSIGMAD4551-250MLДля покрытия бусин
N-[3-(триметоксисилил)пропил]этилендиаминSIGMA104884-100MLДля ПЭГилирования
НейтравидинThermoFisher Scientific31000Для привязки образцов
Фосфатный буферный раствор / PBS, pH 7,2PLSPR2007-100-00
Пластиковый шприцNorm-jectA55 мл, люэровский наконечник
Полиэтиленовая трубкаSCIBB31695-PE/4PE-60
Эталонный шарикSPHEROTECHSVP-30-5Частицы полистирола со стрептавидиновым покрытием; 3,0-3,4 &;
m Игла для шприцаKovax21G-1 1/4''21 G
Насос для шприцаKD SCIENTIFIC788210
Оборудование для магнитного пинцета прибор>
1-осевой моторизованный микротрансляционный столикPIM-126. PD1Для вертикального позиционирования магнитов
2-осевой ручной переводной столикST1LEE400Для выравнивания магнитов по оптической оси
Акриловый держатель для магнитовDaiKwang Precisioncustum заказатьЧертеж доступен по запросу
ФреймграбберActive SiliconAS-FBD-4XCXP6-2PE8
Высокоскоростная CMOS камераMikrotronEoSens 3CXP
Инвертированный микроскопOlympusIX73P2F-1-2
Неодимовые магнитыLG магнитND 10x10x12tРазмеры: 10 мм &раз; 10 мм × 12 мм; два необходимых
объектива ОбъективOlympusUPLXAPO100XOмасляный-иммерсионный, NA 1.45
Объектив объектив нанопозиционерMad City LabsNano-F100S
Вращающийся шаговый двигательAUTONICSA3K-S545WДля вращающихся магнитов
Суперлюминесцентный диодQPHOTONICSQSDM-680-2680 нм
Software
LabVIEWNational Instrumentsv20.0f1
MATLABMathWorksv2021a
10724815001,

Ссылки

  1. Le, S., Liu, R., Lim, C. T., Yan, J. Uncovering mechanosensing mechanisms at the single protein level using magnetic tweezers. Methods. 94, 13-18 (2016).
  2. Choi, H. -K., Kim, H. G., Shon, M. J., Yoon, T. -Y. High-resolution single-molecule magnetic tweezers. Annual Review of Biochemistry. 91 (1), 33-59 (2022).
  3. Yang, T., Park, C., Rah, S. -H., Shon, M. J. Nano-precision tweezers for mechanosensitive proteins and beyond. Molecules and Cells. 45 (1), 16-25 (2022).
  4. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  5. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annual Review of Biophysics. 41 (1), 453-472 (2012).
  6. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nature Reviews Methods Primers. 1, 25(2021).
  7. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical Journal. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  8. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  9. Lansdorp, B. M., Tabrizi, S. J., Dittmore, A., Saleh, O. A. A high-speed magnetic tweezer beyond 10,000 frames per second. Review of Scientific Instruments. 84 (4), 044301(2013).
  10. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Review of Scientific Instruments. 85 (10), 103712(2014).
  11. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: calibration and applications for DNA dynamics. Biophysical Journal. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  12. Huhle, A., et al. Camera-based three-dimensional real-time particle tracking at kHz rates and Ångström accuracy. Nature Communications. 6 (1), 5885(2015).
  13. Popa, I., et al. A HaloTag anchored ruler for week-long studies of protein dynamics. Journal of the American Chemical Society. 138 (33), 10546-10553 (2016).
  14. Shon, M. J., Kim, H., Yoon, T. -Y. Focused clamping of a single neuronal SNARE complex by complexin under high mechanical tension. Nature Communications. 9 (1), 3639(2018).
  15. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Tapia-Rojo, R., Alonso-Caballero, A., Fernandez, J. M. Direct observation of a coil-to-helix contraction triggered by vinculin binding to talin. Science Advances. 6 (21), (2020).
  18. Rieu, M., et al. Parallel, linear, and subnanometric 3D tracking of microparticles with Stereo Darkfield Interferometry. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Rieu, M., Valle-Orero, J., Ducos, B., Allemand, J. -F., Croquette, V. Single-molecule kinetic locking allows fluorescence-free quantification of protein/nucleic-acid binding. Communications Biology. 4 (1), 1083(2021).
  20. Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (16), 6190-6195 (2006).
  21. Camunas-Soler, J., Ribezzi-Crivellari, M., Ritort, F. Elastic properties of nucleic acids by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 45 (1), 65-84 (2016).
  22. Südhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323 (5913), 474-477 (2009).
  23. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  24. Zorman, S., et al. Common intermediates and kinetics, but different energetics, in the assembly of SNARE proteins. eLife. 3, e03348(2014).
  25. Zhang, Y., Hughson, F. M. Chaperoning SNARE folding and assembly. Annual Review of Biochemistry. 90 (1), 581-603 (2021).
  26. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for single-molecule experiments. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , Springer. New York, NY. 371-395 (2009).
  27. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of G-quadruplexes by magnetic tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328(2017).
  28. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical Journal. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  29. Dulin, D., Barland, S., Hachair, X., Pedaci, F. Efficient illumination for microsecond tracking microscopy. PLoS One. 9 (9), e107335(2014).
  30. Klaue, D., Seidel, R. Torsional stiffness of single superparamagnetic microspheres in an external magnetic field. Physical Review Letters. 102 (2), 028302(2009).
  31. Shon, M. J., Rah, S. -H., Yoon, T. -Y. Submicrometer elasticity of double-stranded DNA revealed by precision force-extension measurements with magnetic tweezers. Science Advances. 5 (6), 1697(2019).
  32. Czerwinski, F., Richardson, A. C., Oddershede, L. B. Quantifying noise in optical tweezers by Allan variance. Optics Express. 17 (15), 13255-13269 (2009).
  33. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. Review of Scientific Instruments. 83 (2), 025115(2012).
  34. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. High spatiotemporal resolution data from a custom magnetic tweezers instrument. Data in Brief. 30, 105397(2020).
  35. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 123114(2014).
  36. Strick, T. R., Allemand, J. -F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271 (5257), 1835-1837 (1996).
  37. Daldrop, P., Brutzer, H., Huhle, A., Kauert, D. J., Seidel, R. Extending the range for force calibration in magnetic tweezers. Biophysical Journal. 108 (10), 2550-2561 (2015).
  38. te Velthuis, A. J. W., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophysical Journal. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  39. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. Correction-free force calibration for magnetic tweezers experiments. Scientific Reports. 8 (1), 15920(2018).
  40. Seol, Y., Li, J., Nelson, P. C., Perkins, T. T., Betterton, M. D. Elasticity of short DNA molecules: theory and experiment for contour lengths of 0.6-7 µm. Biophysical Journal. 93 (12), 4360-4373 (2007).
  41. Burnham, D. R., Vlaminck, I. D., Henighan, T., Dekker, C. Skewed Brownian fluctuations in single-molecule magnetic tweezers. PLoS One. 9 (9), 108271(2014).
  42. Paul, T., Myong, S. Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements. STAR Protocols. 3 (1), 101152(2022).
  43. Lee, H. -W., et al. Profiling of protein-protein interactions via single-molecule techniques predicts the dependence of cancers on growth-factor receptors. Nature Biomedical Engineering. 2 (4), 239-253 (2018).
  44. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  45. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nature Methods. 9 (7), 724-726 (2012).
  46. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 19-39 (2014).
  47. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophysical Journal. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  48. Zhang, Y. Energetics, kinetics, and pathway of SNARE folding and assembly revealed by optical tweezers. Protein Science. 26 (7), 1252-1265 (2017).
  49. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophysical Journal. 100 (2), 517-523 (2011).
  50. Cho, S., et al. Tension exerted on cells by magnetic nanoparticles regulates differentiation of human mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. 139, 213028(2022).
  51. Shon, M. J., Cohen, A. E. Nano-mechanical measurements of protein-DNA interactions with a silicon nitride pulley. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7(2016).
  52. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  53. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  54. Neupane, K., et al. Direct observation of transition paths during the folding of proteins and nucleic acids. Science. 352 (6282), 239-242 (2016).
  55. Choi, H. -K., et al. Watching helical membrane proteins fold reveals a common N-to-C-terminal folding pathway. Science. 366 (6469), 1150-1156 (2019).
  56. Kim, C., et al. Extreme parsimony in ATP consumption by 20S complexes in the global disassembly of single SNARE complexes. Nature Communications. 12 (1), 3206(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Сила одной молекулыДНК-шпилькиSNARE-комплексытрекинг бусинкалибровка силымеханочувствительные белкивысокоскоростная визуализациярасплетание ДНК
Высокоскоростной магнитный пинцет для наномеханических измерений на чувствительных к силе элементах
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.