Композитная поддержка микрогеля и внеклеточного матрикса для встроенной 3D-печати нейронных конструкций человека

Краткое содержание

В этой работе описывается протокол встроенной 3D-печати произвольной формы нервных стволовых клеток внутри самовосстанавливающихся отожженных композитов частица-внеклеточный матрикс. Протокол позволяет программировать паттерны взаимосвязанных конструкций нервной ткани человека с высокой точностью.

Аннотация

Встроенная 3D-печать клеток внутри гранулированной опорной среды появилась в последнее десятилетие как мощный подход к биофабрикации мягких тканей произвольной формы. Однако гранулированные гелевые составы были ограничены ограниченным числом биоматериалов, которые позволяют экономически эффективно генерировать большое количество микрочастиц гидрогеля. Таким образом, гранулированным гелевым носителям, как правило, не хватает клеточно-адгезивных и клеточных инструктивных функций, обнаруженных в нативном внеклеточном матриксе (ECM).

Для решения этой проблемы была разработана методология создания самовосстанавливающихся отожженных композитов частица и внеклеточный матрикс (SHAPE). Композиты SHAPE состоят из гранулированной фазы (микрогели) и непрерывной фазы (вязкий раствор ECM), которые вместе обеспечивают как программируемую печать с высокой точностью, так и регулируемую биофункциональную внеклеточную среду. В этой работе описывается, как разработанная методология может быть использована для точной биофабрикации нейронных конструкций человека.

Во-первых, альгинатные микрочастицы, которые служат гранулированным компонентом в композитах SHAPE, изготавливаются и комбинируются с непрерывным компонентом на основе коллагена. Затем нервные стволовые клетки человека печатаются внутри опорного материала с последующим отжигом опоры. Напечатанные конструкции могут поддерживаться в течение нескольких недель, чтобы обеспечить дифференцировку напечатанных клеток в нейроны. В то же время непрерывная фаза коллагена обеспечивает рост аксонов и взаимосвязь областей. Наконец, эта работа предоставляет информацию о том, как выполнять флуоресцентную визуализацию живых клеток и иммуноцитохимию для характеристики нейронных конструкций человека, напечатанных на 3D-принтере.

Введение

Точная и программируемая 3D-печать нагруженных клетками гидрогелевых конструкций, имитирующих мягкие ткани in vitro , представляет собой серьезную проблему. Например, попытки, основанные на прямой экструзии мягких гидрогелей, по своей сути проблематичны, поскольку плохие механические свойства, необходимые для повторения микроокружения in vivo , приводят к отсутствию структурной целостности, деформации предопределенных признаков или полному разрушению изготовленных конструкций. Обычным обходным путем для этой проблемы является печать поддерживающих лесов из более жесткого биосовместимого материала, который позволяет окончательной конструкции сохранять свою форму. Однако такой подход сильно ограничивает возможности дизайна и требует тщательной реологической тонкой настройки соседних красок.

Чтобы преодолеть ограничения традиционной послойной экструзионной 3D-печати, в последние годы встроенная 3D-печать стала мощной альтернативой для изготовления мягких материалов и тканей 1,2,3,4,5,6. Вместо того, чтобы экструдировать чернила в окружающем воздухе поверх поверхности, чернила непосредственно осаждаются через иглу шприца внутри опорной ванны, которая в состоянии покоя имеет твердое тело, но обратимо псевдоожижается вокруг движущегося кончика иглы, чтобы обеспечить точное осаждение мягкого материала, содержащего клетки. Осажденный материал удерживается на месте по мере того, как опора затвердевает после нажатия иглы. Таким образом, встроенная 3D-печать позволяет изготавливать сложные структуры произвольной формы с высоким разрешением из мягких биоматериалов с расширенными возможностями проектирования ^7,8.

Гранулированные гели были широко исследованы в качестве материалов для опорных ванн для встроенной 3D-печати, поскольку они могут быть разработаны для демонстрации плавных, локализованных и обратимых переходов из твердого тела в жидкость при низких напряжениях текучести ^9,10,11. Несмотря на то, что гранулированные гели демонстрируют превосходные реологические свойства для печати с высоким разрешением, они ограничены несколькими биоматериалами¹². Отсутствие разнообразия в гранулированных гелевых составах, что особенно очевидно, если учесть широкий спектр биоматериалов, доступных для объемных гидрогелевых составов, вызвано необходимостью экономически эффективного производства большого количества микрогелей с использованием простых химических составов. Из-за ограниченного биоматериального ландшафта гранулированных гелевых носителей настройка внеклеточного микроокружения, обеспечиваемого печатной подложкой, представляет собой проблему в полевых условиях.

Недавно был разработан модульный подход к созданию встроенных опор для 3D-печати, называемых самовосстанавливающимися отожженными частицами-внеклеточными матриксами (SHAPE)¹³. Этот подход сочетает в себе различные реологические свойства гранулированных гелей с биофункциональной универсальностью объемных гидрогелевых составов. Представленная композитная основа SHAPE состоит из упакованных альгинатных микрочастиц (гранулированная фаза, объемная доля ~70%) с увеличенным межтканевым пространством, заполненным вязким раствором прегеля ECM на основе коллагена (непрерывная фаза, объемная доля ~30%). Кроме того, было показано, что опора SHAPE облегчает осаждение нервных стволовых клеток человека (hNSC) с высоким разрешением, которые после отжига опорной ванны могут быть дифференцированы в нейроны и поддерживаться в течение нескольких недель до достижения функционального созревания. Встроенная 3D-печать внутри опорной ванны SHAPE преодолевает некоторые из основных ограничений, связанных с традиционными методами биофабрикации нервной ткани, обеспечивая при этом универсальную платформу.

В этой работе подробно описаны этапы встроенной 3D-печати hNSC внутри опоры SHAPE и их последующей дифференцировки в функциональные нейроны (рис. 1). Во-первых, альгинатные микрочастицы образуются при сдвиге во время внутреннего гелеобразования. Такой подход позволяет легко генерировать большие объемы микрочастиц без необходимости использования специализированного оборудования и цитотоксических реагентов. Кроме того, альгинат является широко доступным и экономичным источником материала для формирования биосовместимых гидрогелевых субстратов для широкого спектра типов клеток. Полученные альгинатные микрочастицы объединяются с раствором коллагена с образованием композитного опорного материала SHAPE. Затем hNSC собирают и загружают в шприц в виде клеточных биочернил для 3D-печати. 3D-биопринтер используется для экструзионной встроенной печати hNSC внутри композита SHAPE. Клетки, напечатанные на 3D-принтере, дифференцируются в нейроны, чтобы дать начало пространственно определенным и функциональным нейронным конструкциям человека. Наконец, протокол описывает, как генерируемые тканевые конструкции могут быть охарактеризованы с использованием визуализации живых клеток и иммуноцитохимии. Кроме того, предоставляются советы по оптимизации и устранению неполадок. Примечательно, что как компоненты гранулированной, так и непрерывной фаз могут быть заменены с другими гидрогелевыми составами для размещения различных биофункциональных фрагментов, механических свойств и механизмов сшивания, как того требуют другие типы клеток и тканей, помимо нейронных применений.

Протокол

1. Приготовление буферов и реагентов

1. Приготовьте среду для роста клеток, добавив следующие добавки к DMEM/F12 с дипептидом L-аланил-L-глутамина: 30 мМ глюкозы, 5 мкМ HEPES, 0,5% богатого липидами бычьего сывороточного альбумина, 40 мкМ L-аланина, 40 мкМ моногидрата L-аспарагина, 40 мкМ L-аспарагиновой кислоты, 40 мкМ L-глутаминовой кислоты, 40 мкМ L-пролина, 1% добавки N2, 1% пенициллина-стрептомицина и по 20 нг/л эпидермального фактора роста (EGF) и фактора роста фибробластов (FGF). Выполните эти действия на скамье с ламинарным воздушным потоком (LAF).
2. Приготовьте 1% раствор альгината по массе в сверхчистой воде, энергично помешивая в течение 4 ч при 60 °C. Стерильно отфильтруйте растворенный горячий раствор альгината с помощью фильтра размером пор 0,45 мкм на стенде LAF. Хранить при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если температура альгинатного раствора ниже 60 °C, его невозможно будет пропустить через фильтр.
3. Приготовьте раствор NaHCO₃ 37 г/л в сверхчистой воде. Отрегулируйте рН раствора до 9,5 с помощью NaOH и простерилизуйте фильтр на стенде LAF. Хранить раствор при температуре 4 °C.

2. Подготовка композитного материала SHAPE

1. Генерация альгинатных микрочастиц
   1. Приготовьте 2 мг/мл раствора CaCO₃ в сверхчистой воде в стерильном стакане. Смешайте его 1:1 с раствором альгината и помешивайте в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью магнитной мешалки.
   2. Добавьте уксусную кислоту в соотношении 1:500 и оставьте помешивать на ночь при 650 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альгинатный раствор немедленно начнет желировать. Обязательно используйте перемешивающий магнит той же длины, что и диаметр используемой стеклянной посуды, чтобы обеспечить оптимальное однородное перемешивание формовочного геля. На следующий день раствор, образующийся при перемешивании во время гелеобразования, будет казаться вязким (рис. 2А).
   3. Механически фрагментируют гелеобразный раствор альгината на микрочастицы, гомогенизируя его при 15 000 об/мин в течение 10 мин с помощью гомогенизатора, помещенного в стенд LAF (рис. 2B).
   4. Центрифугируют микрочастицы при 18 500 × г в течение 20 мин (рис. 2С) при комнатной температуре.
   5. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость внутри стенда LAF, ресуспендируйте частицы в DMEM, содержащие 2 мМ NaOH и 1% P/S, и инкубируйте в течение ночи при 4 ° C (рис. 2D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет подвески должен вернуться к красному. Если суспензия остается желтой, добавьте NaOH по каплям и перемешивайте, пока она не станет красной (рис. 2E).
   6. Гомогенизируют частицы при 15 000 об/мин в течение 3 мин и центрифугу при 18 500 × г в течение 10 мин при комнатной температуре.
   7. Понаблюдайте за гранулой (рис. 2F) и осторожно удалите надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы плотно упакованных альгинатных микрочастиц можно хранить при температуре 4 °C до дальнейшего использования. Если раствор альгината не был стерилизован фильтром, микрочастицы должны быть израсходованы в течение 1 недели.
2. Композитная формула SHAPE
   1. За день до печати ресуспендируют гранулы альгинатных микрочастиц в удвоенном объеме питательной среды, содержащей 4% HEPES (1 М запас) и 4% раствор NaHCO₃ на стенде LAF, и инкубируют его в течение ночи при комнатной температуре.
   2. Центрифугируют микрогелевую суспензию при дозе 18 500 × г в течение 10 мин при комнатной температуре и удаляют надосадочную жидкость.
   3. Нейтрализуйте коллаген, который будет смешан с альгинатными микрочастицами на стенде LAF. Разбавьте исходный раствор коллагена до конечной концентрации 1 мг / мл и нейтрализуйте его, добавив 4% HEPES и 4% NaHCO₃. Например, для 3 мл композита SHAPE смешайте 2 мл альгинатных микрочастиц с 1 мл нейтрализованного коллагена (0,12 мл HEPES, 0,12 мл NaHCO₃, 0,16 мл питательной среды и 0,6 мл коллагена).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы, смешиваемые с коллагеном, необходимо обрабатывать на льду, чтобы избежать полимеризации коллагена. Как только коллаген будет нейтрализован, полимеризация начнет медленно.
   4. Создайте композит SHAPE, смешав гранулы альгинатных микрочастиц с разбавленным и нейтрализованным коллагеном в соотношении 2:1. Тщательно перемешайте гель, медленно пипетируя вверх и вниз по льду на скамье LAF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не вихревните, так как это приведет к появлению пузырьков в опорном материале.
   5. На стенде LAF перенесите полученный композитный материал в охлажденную пластину с микролунками или любой подходящий контейнер для печати и используйте в течение 30 минут (рис. 3E, F).

3. Приготовление культуры hNSC и биочернил

1. Культивируйте клетки в колбе T75, покрытой экстрактом базальной мембраны, в питательной среде. Пройдите клетки не менее двух раз после оттаивания, прежде чем использовать их для эксперимента с 3D-печатью.
2. Перед печатью диссоциируют клетки ферментативно, используя 0,025% раствор трипсина в течение 5 мин при 37 ° C, нейтрализуют трипсин питательной средой и центрифугируют клеточную суспензию при 400 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. После центрифугирования аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в 2-3 мл питательной среды.
3. Проведите подсчет клеток, центрифугируйте клетки при 400 × г и ресуспендируйте гранулу в питательной среде с добавлением 0,1% ксантановой камеди (для предотвращения осаждения клеток) в конечной концентрации 9 × 10⁶ клеток / мл.
4. Используйте тупую металлическую иглу 21 G, чтобы загрузить 100 мкл плотно упакованных альгинатных микрочастиц в шприц (рис. 3A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Создание пробки с альгинатными микрочастицами служит двум целям: оно помогает поддерживать стабильность экструзии во время печати и позволяет полностью выдавливать загруженные клеточные чернила (без мертвого объема).
5. Используя ту же иглу, загрузите подготовленную клеточную суспензию в шприц (рис. 3Б).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте особенно осторожны, чтобы не допустить попадания пузырьков воздуха во время загрузки шприца. Пузырьки воздуха вызывают нестабильность во время печати.
6. Замените загрузочную иглу тупой металлической иглой 27 G, которая будет использоваться для печати (рис. 3C).

4. Встроенная 3D-печать

1. Разработайте структуру для печати с помощью указанного программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что начальная высота печатной структуры находится в пределах глубины композитной опоры SHAPE. Предложения по проектированию можно найти на рисунке 4А (спиральные и поленницы).
2. Сгенерируйте G-код, нажав « Создать».
3. Вставьте стеклянный шприц с ячейками в объемную экструзионную головку на экструзионном биопринтере (рис. 3D).
4. Измерьте длину иглы стеклянного шприца с ячейками, нажав « Измерение длины иглы».
5. Поместите пластину или контейнер с микролунками, загруженный композитом SHAPE, на принтер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите ячеистую пластину или контейнер при температуре 4 °C до печати, чтобы предотвратить преждевременное сшивание опоры.
6. Измерьте высоту поверхности пустой лунки в той же пластине или контейнере с микролунками, в который загружен гель SHAPE, нажав на SHM (измерение высоты поверхности).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно определить высоту поверхности вручную, измерив высоту скважины иглой.
7. Установите скорость экструзии 3,6 мкл / мин и скорость подачи 0,3 мм / с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно проверьте экструзию перед печатью. Осаждение клеток может вызвать засорение сопла, и его можно избежать, предварительно выдавив небольшой объем перед фактической встроенной печатью или добавив объем втягивания в объемный шприц. В некоторых случаях скорость подачи должна быть ниже 0,5 мм/с , когда игла вставляется в гель SHAPE или выходит из него, чтобы избежать перетаскивания чернил.
8. Загрузите G-код в пользовательский интерфейс принтера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Новый G-код необходимо генерировать каждый раз, когда в проектируемую структуру вносятся изменения.
9. Инициируйте процедуру печати, нажав кнопку «Выполнить» (рисунок 3G).
10. Сразу после печати поместите гель SHAPE при температуре 37 °C в инкубатор клеточных культур на 30 минут для отжига.
11. Аккуратно добавьте питательную среду поверх отожженной гелевой подложки SHAPE.
12. На следующий день замените питательную среду дифференцировочной средой, составленной следующим образом: DMEM/F12 с L-аланил-L-глутаминовым дипептидом с 30 мМ глюкозы, 5 мкМ HEPES, 0,5% по массе и объему богатого липидами бычьего сывороточного альбумина, 40 мкМ L-аланина, 40 мкМ L-аспарагина моногидрата, 40 мкМ L-аспарагиновой кислоты, 40 мкМ L-глутаминовой кислоты, 40 мкМ L-пролина, 1% добавки N2, 1% пенициллин-стрептомицина, 100 мкМ дибутирилциклического аденозинмонофосфата (дибутирил-цАМФ), и нейротрофический фактор (GDNF), полученный из линии глиальных клеток (GDNF) 2 нг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не повредить гидрогель во время смены среды. Наклоните тарелку и аккуратно удалите старую среду. Добавляйте свежую среду по каплям к стенке лунки, содержащей гель, а не непосредственно поверх геля. Не используйте аспиратор для удаления среды.
13. Обновляйте дифференцирующую среду каждые 2 дня до экспериментальной конечной точки.

5. Флуоресцентная визуализация живых клеток

1. Удалите излишки среды из геля.
2. Добавьте равный объем 20 мкМ кальцеина АМ (разбавленный в дифференцировочной среде из исходного раствора) к объему поддерживающего геля.
3. Выдерживать 40 мин при 37 °C.
4. Удалите раствор Calcein AM и добавьте соответствующий объем свежей среды для дифференциации.
5. Перенесите пластину в микроскоп для визуализации.

6. Иммуноцитохимия

1. Удалите излишки среды из геля.
2. С помощью небольшого шпателя переложите гель в большую емкость с DPBS.
3. Промойте три раза в течение 20 минут каждый раз с помощью DPBS и перенесите пластину в вытяжной шкаф.
4. Удалите DPBS, добавьте достаточное количество 4% раствора формальдегида, чтобы покрыть гель, и выдерживайте в течение 1 ч при комнатной температуре.
5. Трижды мойте DPBS по 20 минут каждый раз.
6. Приготовьте блокирующий раствор, состоящий из 5% ослиной сыворотки, 0,25% моющего средства и 0,02% азида натрия в DPBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте в три раза больше объема, необходимого для покрытия геля; Позже он будет использоваться в качестве основы для первичных и вторичных растворов антител.
7. После промывки DPBS добавьте блокирующий раствор в гель и выдержите в течение 6 ч при комнатной температуре, чтобы предотвратить неспецифическое связывание. Аккуратно покачайте тарелку.
8. Приготовьте раствор первичного антитела, разбавив антитело TUBB3 в блокирующем растворе в соотношении 1:1,000.
9. Удалите блокирующий раствор из геля, добавьте раствор первичного антитела и инкубируйте в течение 48 ч при 4 ° C. Аккуратно покачайте тарелку.
10. Трижды мойте DPBS по 20 минут каждый раз.
11. Готовят раствор вторичного антитела, разбавляя 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, 1:1000) и вторичное антитело (1:200) в блокирующем растворе.
12. После промывки DPBS гель инкубировать в растворе вторичных антител в течение 24 ч при 4 °C. Аккуратно покачайте тарелку.
13. Вымойте три раза DPBS в течение 20 минут каждый раз и храните при температуре 4 ° C до получения изображения.
14. Перед визуализацией перенесите окрашенный гель шпателем в посуду или хорошо тарелку с тонким визуальным дном.

Результаты

Получение альгинатного микрогеля путем разжижения сдвигом во время внутреннего гелеобразования с последующей механической фрагментацией дает альгинатные микрогели, которые являются полидисперсными по размеру и чешуйчатой форме, как показано на рисунке 2G. Размер этих нерегулярных частиц колеблется от менее 1 мкм до примерно 40 мкм в диаметре. При плотной упаковке микрочастицы образуют прозрачный сыпучий материал, который лишь немного более непрозрачен, чем соответствующая среда для культивирования клеток (рис. 2F). Прозрачность опорного материала является важным аспектом платформы, поскольку она позволяет визуализировать печатные структуры в период культивирования, а также проводить конфокальную микроскопию с высоким разрешением конструкций, меченных как живыми клеточными красителями, так и с помощью иммуноцитохимии. При замачивании в буферной среде для культивирования клеток полученный гель с поправкой на рН должен иметь красный цвет, указывающий на физиологические условия (рис. 2F). Нейтрализовать рН альгинатных микрочастиц важно по двум причинам. Кислые микрочастицы могут непосредственно повредить клетки. Кроме того, кислая среда будет препятствовать успешному отжигу композитного носителя SHAPE, так как это будет препятствовать полимеризации коллагена.

Печать чернил hNSC с использованием параметров, описанных выше, дает нить ячеек диаметром ~200 мкм (рис. 4A). Запрограммированная геометрия сохраняется как при печати в одной плоскости, так и при печати структур друг на друга. В случае многослойной печати печатные структуры остаются нетронутыми, с минимальным межслойным расстоянием 200 мкм¹³. Жизнеспособность клеток не должна существенно влиять во время подготовки и экструзии чернил. Напечатанные нити богаты живыми клетками, которые имеют круглую морфологию (рис. 4B, слева). Зазоры в напечатанных прядях могут появиться на следующий день после печати, даже если изготовленная конструкция не показывает никаких деформаций сразу после печати. Скорее всего, это результат неоднородного перемешивания опоры. Поскольку клетки не взаимодействуют с альгинатными микрочастицами, они мигрируют из областей, богатых альгинатом, в области, богатые коллагеном и клетками, вызывая разрывы в напечатанных нитях. Кроме того, опора SHAPE должна быть без пузырьков, так как воздушные карманы могут мешать точности печати.

Успешная дифференцировка hNSC должна привести к образованию богатых нейронами структур через 30 дней после печати, при этом клетки демонстрируют морфологию нейронов с мелкими клеточными телами и длинными тонкими отростками (рис. 4B, справа). Кроме того, если печатаются плотные узоры, такие как прямоугольный лист клеток, не должно быть никаких видимых зазоров или агрегатов, образующихся во время дифференцировки, а сплошной слой клеток должен оставаться нетронутым (рис. 4C). В этом протоколе описана процедура флуоресцентной иммуноцитохимии образцов, напечатанных на 3D-принтере. Окрашивание для TUBB3, цитоплазматического нейронального маркера, позволяет напрямую визуализировать сгенерированные нейронные сети. Флуоресцентная микроскопия дифференцированных отпечатков должна выявить структуры, богатые TUBB3 и с сохраненной геометрией (рис. 4D, слева). В процессе дифференцировки клетки не мигрируют из напечатанных нитей, что можно наблюдать при окрашивании ядер клеток DAPI (рис. 4D, посередине). В результате нейронные тела наблюдаются в границах печатной геометрии с аксональными проекциями, которые излучаются на сотни микрометров в опору SHAPE, окружающую конструкцию. Аксональное исследование окружающего объема указывает на то, что опора SHAPE обеспечивает биофункциональные сигналы, которые позволяют находить аксональный путь. Более зрелые нейрональные маркеры или подтип-специфические маркеры могут быть использованы в иммуноцитохимии для дальнейшей характеристики генерируемых популяций нейронов. Кроме того, напечатанная нейронная конструкция может быть охарактеризована с помощью ОТ-кПЦР или электрофизиологии¹³. Однако оба подхода потребуют удаления коллагена с помощью коллагеназы, поскольку гидрогелевый слой препятствует как экстракции РНК, так и физическому доступу к клеткам с помощью микропипетки.

Рисунок 1: Концептуальная иллюстрация встроенного подхода к печати SHAPE. Раствор коллагена смешивают с альгинатными микрочастицами с образованием композита SHAPE; композит SHAPE используется в качестве опорного материала для встроенной 3D-печати hNSC, которые дифференцируются в нейроны внутри отожженной подложки. Биофункциональные свойства композита SHAPE позволяют нейронам расширять проекции и заполнять пустую часть опоры своими аксональными проекциями. Эта цифра была изменена по сравнению с Kajtez et ^al.13. Сокращения: SHAPE = самовосстанавливающаяся отожженная частица-внеклеточный матрикс; hNSCs = нервные стволовые клетки человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Получение альгинатных микрочастиц . (А) Раствор альгината после гелеобразования в течение ночи. (B) Альгинатные микрочастицы, образующиеся в результате гомогенизации. (C) Гранулы частиц после центрифугирования. d) гранулы, ресуспендированные в ДМЭМ (Е) до корректировки рН и после корректировки рН. (F) Микрочастицы после инкубации в среде в течение ночи и центрифугирования. (G) Изображение светлого поля изготовленных альгинатных микрочастиц. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Подготовка к процессу 3D-печати. (A) В шприц загружают пробку для суспензии (~100 мкл), за которой следует (B) загрузка клеточных биочернил (здесь дополненных цветными шариками для целей визуализации). (C) Конический пластиковый наконечник (21 G), используемый для загрузки чернил, заменен тупым металлическим наконечником иглы 27 G. (D) Шприц вставляется в 3D-печатающую головку. (Е,Ж) Композит SHAPE пипеткой вводится в скважину из 48-луночной пластины. Трубка с композитом SHAPE держится на льду, когда ее не трогают. (G) Наконечник печатной иглы вставляется в опору SHAPE, и начинается печать пути, определенного компьютерным дизайном (здесь изображена печать спирали). Аббревиатура: SHAPE = самовосстанавливающийся отожженный частица-внеклеточный матрикс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Нейронные конструкции, напечатанные на 3D-принтере, внутри композитной опоры SHAPE. (A) Изображения светлого поля напечатанных hNSC внутри опорного гидрогеля. Показаны конструкции спиральных (слева) и поленниц (справа). (B) Визуализация живых клеток 3D-печатной конструкции на следующий день после печати (слева) и после дифференцировки нейронов (справа). (C) Квадратная конструкция, напечатанная на 3D-принтере, извлеченная из культивальной скважины с помощью шпателя, демонстрирует структурную целостность. (D) Флуоресцентные конфокальные изображения одной и той же квадратной конструкции, иммуномеченные нейрональным маркером (TUBB3) и с окрашенными ядрами (DAPI), подтверждающие успешную дифференцировку hNSC в 3D-печатных конструкциях. Масштабные линейки = 500 мкм (А, справа); 100 мкм (B,D). Панели C и D на этом рисунке были изменены по сравнению с Kajtez et ^al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Подход к композитным материалам SHAPE обеспечивает универсальный путь для создания отжигаемых и биофункциональных опорных ванн для встроенной 3D-печати ячеистых чернил. Хотя этот протокол представляет собой пример 3D-печати нейронных конструкций, набор инструментов SHAPE может быть легко адаптирован к биофабрикации с другими клеточными источниками для точной инженерии ряда типов тканей-мишеней. Подход к печати также позволит точно моделировать несколько типов клеток для изучения их взаимодействия или создания тканей с определенным пространственным расположением клеточных компартментов (например, нейронов и глиальных клеток). В отличие от традиционных гранулированных гелей, композит SHAPE содержит расширенное интерстициальное пространство (~30% объемной доли для состава, представленного в этом протоколе). Гранулированный компонент служит реологическим модификатором, который придает композиту благоприятные свойства материала для встраиваемой печати с высоким разрешением. Это открывает путь к рациональному дизайну клеточного микроокружения путем изменения рецептуры непрерывного компонента при сохранении того же гранулированного компонента. Например, в поддерживающую ванну могут быть введены другие функциональные молекулы ECM (например, гиалуроновая кислота, ламинины, фибронектин) или могут быть использованы различные механизмы сшивания (например, ферментативные, на основе света)¹³. Кроме того, альгинат в гранулированном компоненте может быть заменен микрочастицами из различных гидрогелевых материалов (например, желатина⁸, полиэтиленгликоля^14,15, агарозы ¹⁶) или быть изготовлен в различных размерах и формах в соответствии с потребностями различных применений тканевой инженерии или моделирования заболеваний. Соотношение между зернистой и непрерывной фазой может быть настроено в соответствии с потребностями отдельных проектов 3D-печати, но увеличение непрерывной фазы более чем на 30% может поставить под угрозу точность и разрешение печати.

На этапах производства микрогеля очень важно, чтобы перемешивание раствора альгината после добавления уксусной кислоты было эффективным по всему объему желирующего раствора. Если скорость перемешивания слишком низкая или магнитная мешалка слишком мала, перемешивание может не достичь верхних слоев раствора, что превратится в большой объем сшитого объемного гидрогеля, в то время как нижние слои будут срезаны. Гомогенизация непоследовательно срезанного альгинатного гидрогеля приведет к образованию альгинатных микрочастиц, которые неоптимальны для 3D-печати. Кроме того, альгинатные микрочастицы необходимо тщательно перемешать с раствором коллагена, так как неоднородная смесь приведет к образованию пятен поддерживающего материала, в которых отсутствует коллаген; Эти патчи не будут отожжены и, следовательно, будут лишены клеточно-интерактивных функций. Также могут быть патчи, в которых отсутствуют альгинатные микрочастицы и, следовательно, они не поддерживают печать. Таким образом, неоднородно смешанная печатная подложка не сможет поддерживать печать высокой точности и будет структурно скомпрометирована, поскольку она не будет отожжена по всему объему. Пузырьков также следует избегать не потому, что они могут быть вредными для клеток, а потому, что воздушные карманы могут вызывать деформации во время печати и мешать визуализации конструкций. Двумя распространенными источниками пузырьков являются вихревые (микропузырьки в холодной подложке, которые расширяются во время отжига опоры при 37 ° C) и энергичное пипетирование.

Композитная опора SHAPE в этой работе была сформулирована не как жертвенный материал, который должен быть удален после печати, а скорее как долгосрочная биофункциональная поддержка как для дифференцировки стволовых клеток, так и для роста нейронов и функционального созревания. По сравнению с гранулированными гелями, которые не подвергаются отжигу после печати, структурная стабильность и прозрачность отожженного композитного материала SHAPE обеспечивают защитную среду для тонких нейрональных функций в процессе фиксации и иммуномаркировки, и поэтому этот материал облегчает морфологическую характеристику посредством визуализации антигенов. Флуоресцентные репортеры также могут использоваться для отслеживания изменений клеточной морфологии с течением времени, а также для мониторинга клеточной пролиферации и миграции в отожженной печатной подложке. Кроме того, подходы к визуализации кальция могут быть использованы для предоставления информации о спонтанной клеточной активности (например, возбуждении потенциалов действия в нейронах или даже активности синхронной нейронной сети). Однако химическая стимуляция сконструированных клеточных конструкций (например, стимуляция нейронов с использованием KCl) может быть затруднена из-за гидрогелевого слоя, окружающего клетки, который замедляет диффузию и предотвращает мгновенную модуляцию клеточного микроокружения. Оптогенетическая стимуляция представляет собой лучший вариант для контроля клеточной активности, поскольку гидрогели SHAPE не препятствуют оптическому доступу к клеткам.

Чувствительные к кислороду шарики могут быть включены в биочернила или в материал носителя (путем прямой печати или диспергирования во время подготовки композита), чтобы обеспечить живое пространственное и временное отображение уровней напряжения кислорода внутри и вокруг напечатанных конструкций с высокой чувствительностью¹³. Этот неинвазивный подход к 3D-картированию кислорода, основанный на измерениях времени жизни фосфоресценции, обеспечивает путь к инженерным тканевым конструкциям с улучшенной оксигенацией и, вероятно, также улучшенным снабжением питательными веществами. Плохая оксигенация может привести к образованию некротических областей внутри печатных конструкций, помешать дифференцировке стволовых клеток и повлиять на метаболизм нейронов. Кислородное картирование обеспечивает считывание, на основе которого дизайн 3D-печати может быть изменен для облегчения равномерной оксигенации по всей конструкции, точной настройки уровней кислорода в соответствии с физиологическими условиями или генерации градиентов кислорода.

Инженерные каналы также могут быть встроены в отжигаемую печатную подложку путем печати жертвенных чернил, таких как желатин, которые затвердевают внутри ванны с холодной поддержкой, но могут быть легко эвакуированы при 37 ° C ^4,13. Каналы потребуются для подачи питательных веществ и кислорода к тканевым конструкциям с высокой плотностью клеток или размерами, которые превышают возможности подхода к манипулированию натяжением кислорода на основе дизайна. Кроме того, сосудистые каналы могут быть использованы для создания градиентов малых молекул, которые управляют паттерном клеточной идентичности, модулируют клеточную активность или направляют хемотаксис.

Таким образом, встроенная 3D-печать внутри композита SHAPE предлагает модульную платформу материалов, которая легко адаптируется и обладает универсальным потенциалом для функционального моделирования механически чувствительных тканей. Представленный здесь протокол содержит подробное объяснение необходимых шагов и основных принципов, необходимых для создания вспомогательного материала и печати клеточных чернил с высокой точностью. Этот подход использует преимущества доступных материалов и доступного оборудования, предоставляя при этом возможности для персонализации подхода к потребностям и приложениям отдельных исследователей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 мл газонепроницаемый шприц 1001 TLL	Гамильтон	81320
3DDiscovery 3D-биопринтер	RegenHU
Уксусная кислота	Сигма-Олдрич	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Вторичное антитело Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11001	Козёл против мыши
Тупая игла, Sterican (21 G)	Браун	9180109
Тупая игла (27 г)	Селлинк	NZ5270505001
Программное обеспечение BioCAD	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Карбонат кальция	Сигма-Олдрич	C5929
Дибутирил-cAMP соль натрия	Сигма-Олдрич	D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 мг/мл)	R& D Systems	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Сыворотка для осла	Сигма-Олдрич	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R& D Systems	236-EG
FGF	R& D Systems	3718-FB
Раствор формальдегид 4%, буферизованный, pH 6,9	Сигма-Олдрич	100496
GDNF	R& D Systems	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Глюкоза	Сигма-Олдрич	G7021
Буфер HEPES (1 м)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Сигма-Олдрич	5129
L-аспарагин моногидрат	Сигма-Олдрич	A4284
L-аспарагиновая кислота	Сигма-Олдрич	A9256
L-глутаминовая кислота	Сигма-Олдрич	G1251
L-Proline	Сигма-Олдрич	P0380
Магнитная мешалка RET basic	IKA	3622000
Дополнение N-2	ThermoFisher	17502048
Пенициллин-стрептомицин	ThermoFisher	15140122
Дисперсный инструмент S25N-10G	IKA	4447100
Альгинат натрия (80-120 cP)	FUJIFILM Вако	194-13321
Натрий-азид	Сигма-Олдрич	S2002
Бикарбонат натрия	Сигма-Олдрич	S5761
Гидроксид натрия	Сигма-Олдрич	S5881
Цифровой гомогенизатор T18 ULTRA-TURAX	IKA	3720000
Triton X-100	Сигма-Олдрич	X100
Решение с трипсином/ЭДТА	ThermoFisher	R001100
Антитела к TUBB3	BioLegend	801213	Мышь
Ксантановая гума	Сигма-Олдрич	G1253