Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Характеристика переносчиков цинка млекопитающих с помощью анализа транспорта цинка in vitro

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65217

⸱

2 июня 2023 г.

 ,  , 
1Department of Life Sciences and National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University, 2Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University

В этой статье

Краткое содержание

Транспорт цинка оказалось сложно измерить из-за слабых причинно-следственных связей с функцией белка и низкого временного разрешения. В этом протоколе описывается метод мониторинга с высоким временным разрешением экструзии Zn 2+ из живых клеток с использованием чувствительного флуоресцентного красителя Zn 2+, что обеспечивает прямое измерение оттока Zn2+.

Аннотация

Переходные металлы, такие как ионы Zn2+, должны жестко регулироваться из-за их клеточной токсичности. Ранее активность транспортеров Zn 2+ измерялась косвенно путем определения уровня экспрессии транспортера при различных концентрациях Zn2+. Это было сделано с помощью иммуногистохимии, измерения мРНК в ткани или определения клеточного уровня Zn2+. С развитием внутриклеточных сенсоров Zn 2+ активность транспортеров цинка в настоящее время в основном определяется путем корреляции изменений внутриклеточного Zn 2+, обнаруженных с помощью флуоресцентных зондов, с экспрессией транспортеров Zn2+. Тем не менее, даже сегодня лишь немногие лаборатории отслеживают динамические изменения внутриклеточного Zn2+ и используют его для измерения активности переносчиков цинка. Частично проблема заключается в том, что из 10 переносчиков цинка семейства ZnT, за исключением ZnT10 (переносит марганец), только транспортер цинка 1 (ZnT1) локализован на плазматической мембране. Поэтому связать транспортную активность с изменениями внутриклеточной концентрации Zn2+ сложно. В данной статье описан прямой способ определения кинетики переноса цинка с помощью анализа на основе цинк-специфического флуоресцентного красителя FluoZin-3. Этот краситель загружается в клетки млекопитающих в эфирной форме, а затем захватывается в цитозоле из-за клеточной активности диэстеразы. Клетки загружаются Zn 2+ с помощью пиритиона ионофора Zn2+. Активность ZnT1 оценивают по линейной части снижения флуоресценции после вымывания клеток. Флуоресценция, измеренная при возбуждении 470 нм и излучении 520 нм, пропорциональна свободному внутриклеточному Zn2+. Выбор клеток, экспрессирующих ZnT1, помеченных флуорофором mCherry, позволяет контролировать только клетки, экспрессирующие транспортер. Этот анализ используется для изучения вклада различных доменов белка ZnT1 в транспортный механизм человеческого ZnT1, эукариотического трансмембранного белка, который выдавливает избыток цинка из клетки.

Введение

Цинк является важным микроэлементом в клеточной среде. Он включает в себя одну треть всех белков и участвует в различных клеточных процессах, таких как катализ1, транскрипция2 и структурные мотивы3. Однако, несмотря на окислительно-восстановительную инертность, высокие концентрации цинка токсичны для клетки, поэтому ни один организм млекопитающих не выжил без наличия механизмов, регулирующих гомеостаз цинка. У млекопитающих за этот процесс ответственны три механизма: (1) металлотионеины, которые представляют собой цитозольные белки, богатые цистеином, которые связывают цинк с высоким сродством, тем самым предотвращая избыток свободного цитозольного цинка4; (2) Zrt/Irt-подобные белки (ZIP), которые являются транспортерами цинка, ответственными за приток цинка в цитозоль через плазматическую мембрану или из внутриклеточных органелл 4,5,6,7,8; и (3) ZnT, которые являются подмножеством млекопитающих семейства фасилитаторов диффузии катионов (CDF) и являются переносчиками цинка, поскольку они выдавливают цинк из цитозоля через плазматическую мембрану или во внутриклеточные органеллы 4,5,6,7,8,9. Из-за важности цинка для клеточного метаболизма жизненно важно понимать клеточную динамику цинка.

Предыдущие методы оценки динамики цинка основывались на оценке уровней экспрессии мРНК в различных условиях цинка путем корреляции их с клеточными измерениями цинка в фиксированных тканях или клетках10,11,12. Эти методы включают химическое обнаружение и иммуногистохимическое окрашивание. Однако эти методы дают лишь косвенные измерения и, таким образом, определяют только оффлайн корреляцию между внутриклеточной концентрацией цинка и экспрессией переносчиков цинка. Следовательно, эти методы не могут вывести какие-либо параметры, требующие высокого временного разрешения.

Для более прямого измерения переноса Zn2+ используются радиоактивные изотопыцинка-13. Этот метод основан на измерении радиоактивно меченного Zn2+ для мониторинга переноса цинка и его кинетики. Однако из-за важности цинка для клеточного гомеостаза множественные клеточные процессы регулируют внутриклеточную концентрацию цинка. Среди них внеклеточное связывание и несколько транспортных систем, которые работают вместе, чтобы поддерживать жесткий контроль внутриклеточных уровней Zn2+ . Сочетание этих процессов создает значительный фоновый шум, что затрудняет тестирование отдельных транспортных функций, связанных с цинком.

В данной статье демонстрируется метод прямого контроля скорости переноса цинка путем измерения внутриклеточной концентрации свободного цинка с использованием цинк-специфического флуоресцентного красителя FluoZin-3. Краситель обладает высокой специфичностью к Zn2+ и незначительным вмешательством со стороны других двухвалентных катионов, таких как кальций. Кроме того, в эфирной форме он проникает в клетки путем неионогенной диффузии, а затем улавливается за счет активности внутриклеточной диэстеразы. Таким образом, его флуоресценция коррелирует в первую очередь с концентрацией свободного цитозольного цинка. Эти эксперименты были проведены для изучения структурно-функциональной взаимосвязи переносчика цинка 1 (ZnT1), члена семейства ZnT.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Трансфекция клеток

  1. Культивирование клеток HEK293T в модифицированной среде Eagle (DMEM) компании Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глютамина и 1x пенициллина/стрептомицина (см. таблицу материалов) во увлажненном инкубаторе при 37 °C/5% CO2 до слияния на 10-сантиметровой пластине (всего 8,8 x 106 клеток).
  2. Поместите по одному 13-миллиметровому покровному стеклу в каждое из лунок 12-луночной пластины. Развести 0,44 x 106 трипсинизированных клеток из стадии 1,1 в 12 мл полного DMEM. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз три-пять раз. Наполните каждую лунку 1 мл смешанного раствора. Выращивать в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C/5%CO2 в течение ночи.
  3. Замените полный DMEM в каждой лунке на 1 мл DMEM без сыворотки (см. Таблицу материалов) в каждой лунке. Верните 12-луночную пластину в увлажненный инкубатор, как показано на шаге 1.1.
  4. Для каждой лунки для трансфекции разводят 1 мкг плазмиды pAAV2, содержащей интересующий белок, помеченный флуоресцентным белком mCherry (Дополнительный файл 1), в 100 мкл безсывороточного DMEM в пробирке объемом 1,5 мл.
  5. Добавьте 3 мкг полиэтиленимина (PEI, см. таблицу материалов) к 100 мкл безсывороточного DMEM на трансфекцию, при этом каждая трансфекция помещается в отдельную пробирку объемом 1,5 мл. Соотношение плазмида и ПЭИ должно составлять 1:3 (мкг:мкг).
  6. Встряхните обе пробирки из шагов 1,4 и 1,5 в течение 10 с и оставьте отдыхать при комнатной температуре не менее 5 минут.
  7. Смешайте одну часть (100 мкл на лунку) раствора ДНК из стадии 1.4 с одной частью (100 мкл на лунку) раствора PEI из стадии 1.5. Готовый раствор перемешайте в течение 10 с и оставьте его отдыхать при комнатной температуре не менее чем на 20 мин и на срок до 6 ч.
  8. Возьмите 12-луночную тарелку из инкубатора. Встряхните окончательный раствор из шага 1.7 и добавьте по 200 мкл в каждую из лунок в 12-луночной планшете из шага 1.3. Верните 12-луночную пластину в увлажненный инкубатор (шаг 1.1).
  9. Через 3 ч замените среду в каждой лунке на 1 мл полного DMEM. Верните 12-луночную пластину в увлажненный инкубатор, как показано на шаге 1.1.
  10. Через 2 дня возьмите трансфицированную клеточную культуру из инкубатора 37 °C/5% CO2 и поместите ее на инвертированный флуоресцентный микроскоп с 10-кратным увеличением.
  11. Используя колесо фокусировки микроскопа, сфокусируйтесь на клетках, используя яркопольный свет.
  12. Переключитесь на длины волн возбуждения флуоресцентного mCherry (587 нм) и излучения (610 нм) и выключите свет в светлом поле. Проверьте флуоресценцию клеток, чтобы подтвердить экспрессию ZnT1 mCherry.
  13. Приготовьте загрузочный раствор красителя.
    1. Возьмите аликвоту 4 мкл цинк-специфического флуоресцентного красителя (см. таблицу материалов) в форме сложного эфира ацетоксиметилового (АМ), растворенного в ДМСО (1 мкг/мкл), из защищенного от света запаса, хранящегося в морозильной камере при температуре −20 °C. Такая форма позволяет красителю проникать в клетку через плазматическую мембрану путем простой диффузии.
    2. Добавьте 4 мкл 10% плуроновой кислоты (или 2 мкл 20% плуроновой кислоты, см. таблицу материалов) к аликвоте из шага 1.13.1. Хорошо перемешайте раствор, пипетируя вверх и вниз три раза, а затем добавьте все 8 мкл в пробирку объемом 1,5 мл.
    3. Добавьте в пробирку 750 мкл раствора Рингера (приготовленного на месте, см. Таблицу материалов для ознакомления с составом) с добавлением 1 мг/мл (~0,1%) бычьего сывороточного альбумина в пробирку, начиная со стадии 1.13.2, и энергично встряхивайте. Добавьте еще 750 мкл того же раствора и снова перемешайте, чтобы обеспечить максимальное перемешивание.
  14. Добавьте 750 мкл готового раствора, начиная со стадии 1.13.3, в две лунки в новой 6-луночной планшете для культивирования. Накройте алюминиевой фольгой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать отбеливания, 6-луночная пластина всегда покрывается алюминиевой фольгой.
  15. С помощью тонкого пинцета возьмите до четырех реплицированных покровных стекол из трансфицированной планшета клеточной культуры и поместите их в первую заполненную лунку (до четырех предметных стекол на лунку) новой 6-луночной планшета, начиная с шага 1.14. Повторите этот процесс для второй заполненной лунки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все покровные стекла в одном и том же заполненном колодце должны быть из одного и того же состояния. Однако каждая скважина может содержать разные условия.
  16. Накройте алюминиевой фольгой и аккуратно встряхивайте в течение 15-20 минут.
  17. Извлеките раствор для загрузки красителя и замените его новым моющим раствором Ringer's plus albumin, как это было использовано на шаге 1.13.3. Накройте алюминиевой фольгой. Снова встряхните на 20 минут. Это позволяет расщеплять эфир АМ внутриклеточными эстеразами.

2. Подготовка микроскопа

  1. Расставьте необходимые инструменты (см. таблицу материалов), как уже упоминалось: инвертированный флуоресцентный микроскоп, способный обнаруживать флуорофоры GFP и mCherry, перфузионную систему, позволяющую переключаться как минимум между двумя растворами, систему аспирации и перфузионную камеру.
  2. Включите микроскоп, его источник света и камеру. Включите систему всасывания.
  3. Промойте перфузионную систему. Первую камеру промывают раствором Рингера, а вторую камеру раствором Рингера, содержащим 7 мкМ раствора цинка с добавлением 7 мкМ пиритиона (ионофор цинка, см. таблицу материалов). Чтобы избежать пузырьков воздуха или зазоров, оставьте немного жидкости в каждой камере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку оба контейнера подключены к одной и той же трубке, подключенной к перфузионной камере, всегда следите за тем, чтобы общий сегмент промывался раствором Рингера.
  4. Закройте краны и заполните соответствующие камеры раствором Рингера и раствором цинка Рингера, как показано на шаге 2.3.

3. Пробоподготовка

  1. Возьмите перфузионную камеру и поместите ее узкой стороной канавки вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Канавка представляет собой отверстие в середине перфузионной камеры. Он обеспечивает доступ перфузионной жидкости к клеткам. Одна сторона канавки узкая, а противоположная – широкая.
  2. Нанесите уплотнительный силикон (см. Таблицу материалов) вокруг канавки. Очистите канавку уплотнительным силиконом с помощью наконечника пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вокруг канавки достаточно силиконового уплотнения для герметизации 22-миллиметрового покровного стекла.
  3. С помощью тонкого пинцета возьмите покровный листок от моющего раствора и положите его поверх канавки ячейками вниз. Таким образом, клетки будут подвергаться воздействию раствора, перфузирующего канавку во время эксперимента.
  4. Поместите 22-миллиметровый покровный щиток поверх 13-миллиметрового покровного стекла и затяните его с помощью пинцета. Следите за тем, чтобы не растрескать покровные стекла.
  5. Переверните камеру и нажмите на нее, чтобы выпустить все присутствующие жидкости. Заполните канавку 100 мкл моющего раствора Ringer и снова прижмите, чтобы убедиться в отсутствии утечки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При обнаружении утечки нанесите герметизирующее средство на место утечки и повторите тестирование.
  6. Установите перфузионную камеру на платформу и закрепите ее. Поместите перфузионную и аспирационную трубки так, чтобы обеспечить перфузию над клетками в канавке.
  7. Измените скорость перфузии примерно на 2 мл/мин и включите перфузию раствора Рингера. Убедитесь, что перфузионная система работает без утечек или перетеканий.

4. Подготовка к измерениям

  1. Откройте программное обеспечение для работы с изображениями (см. Таблицу материалов), дважды щелкнув по значку. Войдите в систему, используя соответствующие учетные данные. Выберите подключенную камеру и нажмите кнопку ОК.
  2. Установите увеличение микроскопа на 10x с помощью кнопки с левой стороны микроскопа.
  3. Выбрав просмотр в реальном времени и используя джойстик, переместите платформу, чтобы сфокусироваться на ячейках в канавке.
  4. Пока перфузия включена, выключите свет и измените длину волны на mCherry, нажав специальную кнопку в интерфейсе. Отрегулируйте фокусировку с помощью колеса фокусировки микроскопа.
  5. После того, как микроскоп будет сфокусирован на клетках, переместите платформу с помощью джойстика, чтобы выбрать соответствующие участки клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящей областью считается область с не менее чем 10 ячейками для ROI и пустой областью для фона.
  6. Выберите ниспадающее меню Включить или выключить рентабельность инвестиций и выберите Нарисовать циклические ROI.
  7. Нарисуйте ROI клеточных кластеров с клетками, экспрессирующими mCherry (указывает на экспрессию ZnT1).
  8. На той же панели инструментов, что и на шаге 4.6, нажмите кнопку Включить/выключить фоновую рентабельность инвестиций и настройте местоположение и размер фоновой рентабельности инвестиций в соответствии с областью, в которой вообще нет ячеек.
    1. Проверьте длины волн mCherry и EGFP, чтобы убедиться, что ни одна ячейка не находится в выбранном фоновом ROI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длины волн были скорректированы таким образом, что mCherry использовал длину волны возбуждения 520 нм и длину волны излучения 610 нм, а EGFP использовал длину волны возбуждения 470 нм и длину волны излучения 520 нм.
  9. Выберите вложенную вкладку Длина волны (λ). Отметьте этот флажок и убедитесь, что длина волны GFP присутствует, а флажок отмечен. Если нет, добавьте и отметьте его.
  10. Выберите вложенную вкладку Длительность . Определите интервал измерения каждые 5 секунд и измените количество интервалов в соответствии с продолжительностью эксперимента.
  11. В разделе «Фокусировка» на панели микроскопа под окуляром нажмите кнопку «Вкл.», чтобы включить систему идеальной фокусировки (PFS).
  12. С помощью колеса фокусировки PFS отрегулируйте фокусировку. В программном интерфейсе в разделе ND Acquisition убедитесь, что установлен флажок PFS on .
  13. Нажмите «Выполнить сейчас».

5. Методика проведения эксперимента

  1. Начните с измерения базового периода 90 с с использованием перфузии раствора Рингера.
  2. После окончания базового периода отключите перфузию раствора Рингера, а затем включите перфузию раствором цинка Рингера. Отметьте переключение решения, нажав на красный флажок в правом нижнем углу главной панели интерфейса. Ожидается рост флуоресценции.
  3. Как только повышение флуоресценции начнет насыщаться, перейдите обратно к перфузии раствором Рингера. Отключите перфузию раствора цинка Ringer, а затем включите перфузию раствора Ringer.
  4. Подождите, пока не истечет время эксперимента. Заметное, но устойчивое снижение флуоресценции ожидается, если ZnT1 работает должным образом.

6. Экспорт данных

  1. Чтобы экспортировать данные с вычитанием базовой линии, нажмите кнопку Вычесть базовую линию и просмотрите изменения в «Окне сбора ND».
  2. Нажмите на кнопку «Экспорт» в интерфейсе программы в « Окне сбора ND». Откроется таблица Excel. Сохраните в нужном месте.

7. Анализ данных

  1. Для каждого ROI создайте среднюю базовую флуоресценцию за первые 90–100 секунд.
  2. Выразите флуоресценцию, рассчитанную для каждого ROI, в процентах от фона для этой ROI.
  3. Создайте среднее арифметическое по всем ROI и постройте результат в виде линейного графика. При этом создается среднее значение всех ROI в зависимости от времени.
  4. Используя функцию линейной аппроксимации, выберите начальную скорость снижения флуоресценции после промывки раствором Рингера. Величина уклона уравнения коррелирует со скоростью транспортировки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

ZnT1 представляет собой транспортер цинка млекопитающих, расположенный на плазматической мембранеклетки 13. Он является членом семейства белков фасилитатора катионной диффузии (CDF), который выдавливает цинк из цитозоля во внеклеточный миллиу14. ZnT1 имеет двухдоменную архитектуру: трансмембранный домен, который транспортирует ионы через мембрану, и С-концевой домен14. В отличие от других известных белков CDF, ZnT1 имеет расширенный неструктурированн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный выше метод позволяет проводить прямое измерение внутриклеточной концентрации цинка с высоким временным разрешением. По сравнению с другими методами, этот метод, включающий мониторинг изменений внутриклеточного уровня Zn2+, может существенно снизить фоновый шум. Кроме того, селективность красителя по цинку исключает потенциальные перекрестные взаимодействия с другими катионами металлов18,19. Наконец, отсутствие у него немедленной цитотоксичнос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Raz Zarivach поддерживается Израильским научным фондом (грант No 163/22). Томер Эли Бен Йосеф и Ари Моран получают поддержку Израильского научного фонда (грант No 2047/20). Мы хотели бы поблагодарить Даниэля Гитлера и его группу в Университете Бен-Гуриона за сотрудничество, поддержку и экспертизу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10-сантиметровая пластинаgreiner bio-one664160
12-луночная клеточная культуральная пластинаgreiner bio-one665180
13 мм покровные стеклаSuperior Marienfeld111530
22 мм защитные накладкиSuperior Marienfeld101050
6-луночная культуральная пластинаgreiner bio-one657160
Бычья сыворотка альбуминbioWorld22070008
Кальция хлорид безводный, гранулированныйSigma AldrichC1016Концентрация в растворе Ringer: 1 мМ
D-(+)-глюкозаGlentham Life ScienceGC6947Концентрация в растворе Ringer: 10 мМ
Dubelco' s Модифицированный Eagle Media (DMEM) Sartorius01-055-1A
Инвертированный микроскоп Eclipse TiNikonTI-DHСнят с производства. Заменено на Eclipse Ti2
Фетальная бычья сыворотка (FBS)CytivaSH30088.03
Тонкий пинцетDumont0203-55-PS
Флуозин-3AMInvitrogenF24195
HyClone Пенициллин-стрептомицин 100x растворCytivaSV30010 
Светодиодная система подсветкиCoolLEDpE-4000
L-глутаминBiological Industries03-020-1B
Гексагидрат хлорида магнияMerck1.05833Концентрация в растворе Ringer: 0,8 мМ
N[2-гидроксиэтил]пиперазин-N'-[2-этансульфоновая кислота] (HEPES)FormediumHEPES10Концентрация в растворе Ringer: 10 мМ
Фотоаппарат Neo 5.5 sCMOSANDORDC-152Q-FI
NIS-Elements программное обеспечение для обработки изображенийNikonAR
Плуроновая кислота F-127Миллипоры540025
хлорид поттазияBio-Lab163823Концентрация в растворе Ringer: 5,4 мМ
ПиритионSigma AldrichH3261Концентрация в растворе цинка Ringer: 7 μ M
Набор силиконовой смазкиWarner InstrumentsW4 64-0378
Хлорид натрияBio-Lab190305Концентрация в растворе Ringer: 120 мМ
Сульфат цинкаSigma Aldrich31665Концентрация в растворе цинка Ringer: 7 μ М

Ссылки

  1. Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
  2. Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
  3. Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
  4. Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336(2016).
  5. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  6. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  7. Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
  8. Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320(2021).
  9. Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
  10. Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
  11. Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
  12. Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
  13. Palmiter, R. d, Findley, S. d Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
  14. Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
  15. Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
  16. Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
  17. Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
  18. Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
  19. Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
  20. Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
  21. Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
  22. Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. Microsphere-based real-time calcium sensing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).
  23. Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
  24. Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Внутриклеточный цинккраситель FluoZin-3клетки HEK293Tприток цинкафлуоресцентная микроскопиямечение mCherryраствор Рингеракинетика транспорта цинка
Характеристика переносчиков цинка млекопитающих с помощью анализа транспорта цинка in vitro
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.