Анализ жизнеспособности конидий Trichoderma stromaticum в мононуклеарных макрофагах периферической крови человека

Summary

Методика фагоцитоза грибковых конидий макрофагами широко используется для исследований, оценивающих модуляцию иммунных реакций против грибов. Целью данной статьи является представление метода оценки фагоцитоза и клиренсных способностей мононуклеарных макрофагов периферической крови человека, стимулированных конидиями Trichoderma stromaticum .

Abstract

Макрофаги представляют собой важнейшую линию защиты и отвечают за предотвращение роста и колонизации патогенов в различных тканях. Конидиальный фагоцитоз является ключевым процессом, позволяющим исследовать цитоплазматические и молекулярные события, участвующие в макрофагально-патогенных взаимодействиях, а также определять время гибели интернализованных конидий. Методика фагоцитоза грибковых конидий макрофагами широко используется для исследований, оценивающих модуляцию иммунных реакций против грибов. Уклонение от фагоцитоза и ускользание фагосом являются механизмами вирулентности грибов. Здесь мы сообщаем о методах, которые могут быть использованы для анализа фагоцитоза, клиренса и жизнеспособности T. stromaticum conidia, гриба, который используется в качестве агента биоконтроля и биоудобрения и способен вызывать инфекции человека. Протокол состоит из: 1) культивирования триходермы , 2) промывки для получения конидий, 3) выделения мононуклеарных клеток периферической крови (МПКМ) методом раствора полисахарозы и дифференцировки МПМК в макрофаги, 4) метода фагоцитоза in vitro с использованием круглых стеклянных покровных стекол и окраски, и 5) анализа клиренса для оценки жизнеспособности конидий после фагоцитоза конидий. Таким образом, эти методы могут быть использованы для измерения эффективности выведения макрофагов из грибков.

Introduction

Род Trichoderma (Отряд: Hypocreales, Семейство: Hypocreaceae) состоит из вездесущих сапрофитных грибов, которые являются паразитами других видов грибов и способны продуцировать ряд коммерчески полезных ферментов¹. Эти виды грибов используются для производства гетерологичных белков², производства целлюлозы³, этанола, пива, вина и бумаги⁴, в текстильной промышленности⁵, пищевой промышленности⁶ и в сельском хозяйстве в качестве агентов биологического контроля ^7,8. В дополнение к промышленному интересу к этим грибковым видам, растущее число инфекций у людей придало некоторым видам Trichoderma статус условно-патогенных микроорганизмов.

Trichoderma spp. быстро растет в культуре, с первоначально белыми и хлопковыми колониями, которые становятся зеленовато-желтыми или темно-зелеными¹⁰. Они приспособлены к жизни в широком диапазоне рН и температурных условий, а условно-патогенные виды способны выживать при физиологических рН и температурах и, таким образом, колонизировать различные ткани человека 11,12,13. Важно отметить, что рост заболеваемости Trichoderma spp. может быть связан с факторами вирулентности, а они недостаточно изучены. Кроме того, исследования, направленные на понимание иммунного ответа против условно-патогенных видов Trichoderma, все еще редки.

Во время инфекции, наряду с нейтрофилами, макрофаги представляют собой линию защиты, отвечающую за фагоцитоз, и, таким образом, препятствуют росту и колонизации возбудителей в различных тканях. Используя рецепторы распознавания образов, такие как Toll-подобные рецепторы и лектиновые рецепторы C-типа, макрофаги фагоцитозируют грибы и перерабатывают их в фаголизосомы, тем самым способствуя дыхательному взрыву, высвобождению провоспалительных цитокинов и уничтожению фагоцитозированных микроорганизмов¹⁴. Механизм фагоцитоза, однако, может быть затронут и уклонен от различных микробных стратегий, таких как размер и форма грибковых клеток; наличие капсул, препятствующих фагоцитозу; уменьшение количества рецепторов, индуцирующих фагоцитоз; ремоделирование структуры актиновых волокон в цитоплазме; препятствующие образованию псевдоподий; и фагосома или фаголизосома ускользают после процесса фагоцитоза¹⁴.

Многие патогены, в том числе Cryptococcus neoformans, используют макрофаги в качестве ниши для выживания в организме хозяина, распространения и индуцирования инфекции¹⁵. Анализ фагоцитоза и клиренса используется для оценки иммунного ответа против патогенов и определения микробных стратегий, используемых для уклонения от врожденной иммунной системы 15,16,17. Этот тип метода также может быть использован для изучения дифференциальной кинетики фагоцитоза, замедленного закисления фагосом и окислительного взрыва, которые приводят к уменьшению гибели грибков¹⁸.

Различные методы могут быть использованы для оценки фагоцитоза, выживаемости грибов и уклонения от процесса созревания фагосом. К ним относятся флуоресцентная микроскопия, которая используется для наблюдения за фагоцитозом, расположением клеток и молекулами, образующимися во время фагоцитоза¹⁹; проточная цитометрия, которая дает количественные данные о фагоцитозе и используется для оценки различных маркеров, участвующих в процессе^20,21; прижизненная микроскопия, которая используется для оценки микробного захвата и созревания фагосом²²; антитело-опосредованный фагоцитоз, который используется для оценки специфичности процесса фагоцитоза для возбудителя²³; и другие 24,25,26,27.

Протокол, представленный здесь, использует обычный, недорогой и прямой метод с использованием оптического микроскопа и анализа роста пластин для оценки фагоцитоза и гибели грибковых конидий. Этот протокол предоставит читателям пошаговую инструкцию по проведению анализа фагоцитоза и клиренса с использованием мононуклеарных макрофагов периферической крови человека, подвергшихся воздействию T. stromaticum. ПБМК были использованы в связи с тем, что конидии Trichoderma применяются в качестве биоконтроля против фитопатогенов и биоудобрения для растительных культур во всем мире и вызывают несколько инфекций человека, называемых триходермозами. Кроме того, существует только две предыдущие работы, посвященные взаимодействию между конидиями Trichoderma и иммунной системой человека, в которых мы изучали нейтрофилы²⁸ и аутофагию у макрофагов²⁹. В данной статье сначала показано, как можно изучать фагоцитоз конидий T. stromaticum макрофагами, полученными из PBMC, а затем как можно оценить жизнеспособность поглощенных конидий с помощью простых методов, основанных на микроскопии. Этот протокол может способствовать дальнейшему изучению макрофаг-ассоциированного иммунного ответа или механизмов, связанных с модуляцией иммунной системы.

Protocol

Этические соображения и люди-субъекты
Все эксперименты на людях, описанные в этом исследовании, были проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией и федеральными законами Бразилии и одобрены Комитетом по этике Государственного университета Санта-Крус (идентификационный код проекта: 550.382/2014).

Периферическая кровь человека была собрана у здоровых добровольцев из города Ильеус, штат Баия, Бразилия, не подвергавшихся профессиональной деятельности, связанной с изучаемым грибком. Лица, у которых сообщалось о заболеваниях или принимающих лекарства, были исключены. Все испытуемые добровольно согласились принять участие и подписали форму информированного согласия перед включением в это исследование.

1. Приготовление реагентов и растворов

ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем продолжить, подготовьте следующие реагенты и растворы. Информацию о поставщиках реагентов и материалов см. в Таблице материалов (TOM).

1. Приготовьте сбалансированный стерильный фосфатно-буферный солевой раствор 1x (PBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе ПБС, не содержащая эндотоксинов, не использовалась.
2. Приготовьте среду из картофельного декстрозного агара (КПК) и влейте по 20 мл в каждую чашку Петри для культуры T. stromaticum . Подготовьте шесть планшетов с КПК для каждого донора и используйте по одной пластине для каждого состояния: 3 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 120 ч. Кроме того, используйте три пластины для каждого контроля: три для контроля триходермы и три для контроля среды R10. Используйте чашки Петри размером 60 мм x 15 мм или 100 мм x 15 мм для оптимального извлечения конидий.
3. Стерилизовать 100% глицерин.
4. Приготовьте среду R10 для клеточной культуры: среду RPMI с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотика (пенициллин/стрептомицин).
5. Стерилизуйте дистиллированную воду для лизиса клеток.
6. Подготовьте воду с рН 7,0 для процесса окрашивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте рН с помощью рН-метра и растворов 0,1 М/л NaOH и 0,1 М/л HCl.
7. Простерилизуйте круглый стеклянный покровный стекло (13 мм) и пинцетом.

2. Культивирование и обработка Trichoderma stromaticum

1. Подготовка маточного подвоя (М1) T. stromaticum:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Маточное поддвое (M1) необходимо для того, чтобы убедиться, что все эксперименты проводятся на культуре одного и того же свежего поколения (F1).
   1. Выращивают посевной материал T. stromaticum в чашках Петри с КПК при температуре 28 °С в темноте в течение 7-10 дней, пока не будут наблюдаться конидии и культура не позеленеет.
   2. Промойте культуру T. stromaticum. Добавьте 3-5 мл PBS на поверхность культуры с помощью пипетки. Соберите PBS с планшета и снова распределите его по культуре, чтобы постепенно удалить конидии с помощью пипетки. Повторяйте этот процесс столько, сколько необходимо, пока суспензия не станет темно-зеленой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы рекомендуется осторожное промывание культуры путем добавления 3-5 мл PBS в планшет с последующим выполнением круговых движений до тех пор, пока суспензия не станет зеленой, чтобы восстановить конидии. При повторном пипетировании можно собрать больше конидий.
   3. Переложите восстановленную суспензию с планшета в стерильную пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки. Повторите шаги 2.1.2-2.1.3 столько раз, сколько необходимо, чтобы получить больше конидий.
   4. Центрифугируют суспензию при 1,160 x g в течение 5 мин при 12 °C и повторно суспендируют гранулы в 5 мл PBS. Повторите этот шаг (2.1.4) три раза, чтобы получить суспензию без гиф.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для правильного ресуспендирования гранулы после центрифугирования рекомендуется кратковременное вихрь.
   5. Ресуспендант готовой гранулы в 2-3 мл PBS и подсчитайте конидии в камере Нойбауэра, используя разведение 1:100 или 1:1000.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В оптимальных условиях окончательная концентрация 2 x 10⁸ конидий/мл может быть извлечена из культуры. Оценка жизнеспособности конидий с помощью метода исключения трипанового синего не является обязательной.
   6. Распределите суспензию по 1,5 мл в стерильные пробирки, добавив в каждую пробирку 0,5 мл суспензии конидий (с шага 2.1.5). Затем добавьте 0,5 мл стерильного 100% глицерина, чтобы получить запасы М1. Кратковременно встряхните, определите трубки и храните при температуре −20 °C или −80 °C.
2. Культивирование T. stromaticum и получение конидий для эксперимента
   1. Планшет 10 мкл суспензии М1 (приготовленной на этапе 2.1) помещают в КПК при 28 °С в темноте в течение 7-10 дней до появления конидий и зеленеющей культуры для получения свежего поколения F1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить свежую культуру T. stromaticum для эксперимента, оцените время, необходимое для роста гриба, и время, необходимое для дифференцировки макрофагов.
   2. Соберите конидии, повторив шаги 2.1.2-2.1.4.
   3. Ресуспендируйте конечную гранулу в 2-3 мл PBS. Оцените жизнеспособность конидий с помощью метода исключения трипанового синего или подсчитайте конидии, как указано в шаге 2.1.5.

3. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МПКМ)

ПРИМЕЧАНИЕ: PBMC получают методом барьера плотности с использованием раствора полисахарозы плотностью 1,077 г/мл³⁰.

1. Аликвота 15 мл раствора полисахарозы на одну пробирку объемом 50 мл для каждого донорского образца, который будет взят.
2. Возьмите 20 мл крови у каждого донора, используя три-четыре пробирки с ЭДТА. Привлекайте не менее четырех доноров для каждого эксперимента. Не объединяйте кровь доноров; Вместо этого используйте каждый образец отдельно в качестве биологической реплики. Для каждого донора переведите кровь в одну пробирку объемом 50 мл и добавьте PBS, чтобы получить окончательный объем 35 мл.
3. Медленно перенесите кровяную суспензию (шаг 3.2) вдоль стенки пробирки, содержащей раствор полисахарозы (шаг 3.1), чтобы образовалась двухфазная суспензия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить смешивание крови с раствором полисахарозы, добавляйте кровь медленно. Рекомендуется использовать не менее 7 мл крови от каждого донора для выделения PBMC.
4. Немедленно центрифугируйте пробирку, содержащую двухфазную суспензию, при 1 600 x g в течение 30 мин при 24 °C. Запрограммируйте центрифугирование PBMC: используйте ускорение 1 и замедление 0, чтобы избежать резкой остановки центрифугирования.
5. Наблюдайте за образованием белого кольца, содержащего МПМК после центрифугирования. Эритроциты и гранулоциты находятся в нижнем слое, следующий слой содержит раствор полисахарозы, а МПМК находятся в белом кольце между раствором полисахарозы и плазмой (верхний слой). Соберите белое кольцо, осторожно аспирируя с помощью пипетки или стерильной пипетки Пастера, чтобы не поймать эритроциты, плазму или раствор полисахарозы, и переложите в одну пробирку объемом 15 мл.
6. Добавьте PBS в пробирку объемом 15 мл, содержащую PBMC, чтобы получить окончательный объем 10 мл. Гомогенизируйте суспензию и центрифугируйте пробирку при 1 600 x g в течение 30 мин при 24 °C.
7. Промойте клетки три раза при концентрации 1 600 x g в течение 5 минут при 24 °C с 10 мл PBS. Затем повторно суспендируйте конечную гранулу в 2 мл среды R10.
8. Оцените жизнеспособность клеток с помощью метода исключения трипанового синего и подсчитайте количество клеток в камере Нойбауэра.

4. Кинетика фагоцитоза

ПРИМЕЧАНИЕ: Мононуклеарные макрофаги периферической крови человека обрабатывают конидиями T. stromaticum при кратности инфекции (MOI) 1:10 или только средой R10 в качестве контроля. Кратность инфекции (MOI) представляет собой отношение инфекционных агентов, добавленных к целям заражения, и представлена в виде абсолютных чисел: MOI = агенты:мишени³¹. Здесь мы используем 1 T. stromaticum conidia (агент) для 10 макрофагов (мишеней). Затем клетки инкубируют при 37 °C и 5%_CO2 в течение различных периодов времени (3 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 120 ч). Далее с помощью круглого стеклянного покровного стекла визуализируют под микроскопом адгезивные макрофаги, участвующие в процессе фагоцитоза. Приведена экспериментальная схема (рис. 1).

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать 24-луночные планшеты.

1. Лечение макрофагов человеческого происхождения конидиями T. stromaticum
   1. Добавьте стерильное круглое стеклянное покровное стекло (13 мм) в каждую лунку стерильным пинцетом.
   2. Отрегулируйте объем клеточной суспензии, полученной на шагах 3,7-3,8, до пластины 8 x 10⁵ клеток на лунку до конечного объема 1 мл со средой R10. Используйте инвертированный микроскоп для оценки морфологии клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть взвешены в среде и иметь округлую морфологию.
   3. Инкубируют клетки при 37 °C в атмосфере 5%_CO2 в течение 7 дней и заменяют среду свежей средой R10 каждые 2 дня для дифференцировки моноцитов в макрофаги³². Наблюдайте за морфологией клеток с помощью инвертированного микроскопа. Макрофаги будут иметь веретенообразную морфологию с уплощенными и вытянутыми формами; Также может наблюдаться повышенное цитоплазматическое соотношение и наличие псевдоподий. Ищите адгезивные мононуклеарные макрофаги.
      Примечание: Очень небольшая доля недифференцированных моноцитов может оставаться во взвешенном состоянии в среде.
   4. Удалите среду из каждой лунки с помощью пипетки и промойте клетки 1 мл PBS, чтобы удалить мусор и неприлипшие клетки.
   5. Суспензию, приготовленную на стадии 2.2, используют для приготовления новой суспензии конидий T. stromaticum в конечной концентрации 8 x 10⁴ конидии/мл в среде R10.
   6. Добавляют 1 мл суспензии конидий, приготовленной на стадии 4.1.5, в каждую лунку для обработки (3 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 120 ч) до получения MOI 1:10. К контролю добавляют в лунку только 1 мл среды R10.
   7. Макрофаги в течение 3 ч подвергают воздействию конидий T. stromaticum при 37 °C в атмосфере 5%_CO2 . Через 3 ч среду удалить и промыть клетки, чтобы удалить нефагоцитированные конидии.
   8. Добавьте 1 мл среды R10 в каждую лунку и инкубируйте планшет в течение разного времени (3 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 120 ч) при 37 °C в атмосфере 5%_CO2 .
2. Окрашивание и анализ
   1. Удалите среду из каждой лунки после завершения соответствующей инкубации (шаг 4.1.8) и добавьте в эту лунку 1 мл PBS.
   2. Извлеките круглые стеклянные покровные стекла из лунок с помощью стерильного пинцета и иглы для окрашивания с набором для окрашивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно окрашивать с помощью краски May Grünwald-Giemsa³³.
   3. К каждому из круглых стеклянных покровных листов добавьте пятнозакрепитель (5 с), краситель 1 (5 с), краситель 2 (2 с) и буферную воду pH 7,0 (5 с), которые являются компонентами набора для окрашивания. Подождите, пока они высохнут, и закрепите покровные стекла на предметном стекле с помощью монтажного средства.
   4. Количественная оценка результата: Подсчитайте в общей сложности 100 макрофагов (Mø) для каждого временного условия. С помощью оптического микроскопа подсчитывают количество макрофагов с фагоцитированными конидиями с помощью 100-кратного объектива и иммерсионного масла (уравнение [1]).
      (1)
   5. Получить число фагоцитированных конидий на один макрофаг: Соотнесите конидии, присутствующие в 100 макрофагах, деленное на число макрофагов по крайней мере с одним фагоцитированным конидием (уравнение [2])³⁴.
      (2) См.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки и подсчета конидий можно использовать программное обеспечение ImageJ³⁵.
   6. Сфотографируйте фагоцитоз из каждого образца и временных условий, используя 40-кратные и 100-кратные объективы, чтобы представить результаты.

Рисунок 1: Схематическое изображение анализа фагоцитоза и конидиальной жизнеспособности с использованием мононуклеарных макрофагов периферической крови человека. (1—10) Анализ на фагоцитоз: T. stromaticum должен быть выращен в PDA, а конидии извлекаются путем промывания планшета PBS. МПМК выделяют методом барьера плотности по описанному протоколу, культивируют в 24-луночные планшеты со стерильными круглыми стеклянными покровными стеклами в течение 7 дней для дифференцировки в макрофаги, а затем обрабатывают MOI 1:10 с различными временными интервалами. Круглые стеклянные покровные стекла удаляются и окрашиваются с помощью набора для окрашивания, а результаты анализируются с помощью световой микроскопии. (1-8,11-13) Анализ жизнеспособности конидий: После выделения PBMC культивируют в 24-луночных планшетах без круглых стеклянных покровных стекол в течение 7 дней для дифференцировки в макрофаги, а затем обрабатывают MOI 1:10 в течение различных временных интервалов. Клетки должны быть лизированы путем инкубации с дистиллированной водой; затем суспензию центрифугируют, а затем ресуспендированную гранулу покрывают ФДА для анализа кинетики роста триходермы. Эта фигура была разработана с использованием базы данных изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

5. Анализ конидиальной жизнеспособности после фагоцитоза

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведена экспериментальная рисунка (Рисунок 1).

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 24-луночные планшеты.

1. Бросьте вызов макрофагам человеческого происхождения с помощью конидий T. stromaticum .
   1. Повторите шаги 4.1.2-4.1.8 для дифференцировки моноцитов и обработки макрофагов конидиями T. stromaticum .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте круглые стеклянные покровные стекла в колодцах. Используйте те же интервалы времени, которые используются для определения кинетики фагоцитоза, чтобы фагоцитоз можно было коррелировать с жизнеспособностью конидий.
   2. Оценивают влияние среды R10 на рост T. stromaticum , используя в качестве контроля лунки со суспензией, приготовленной на стадии 4.1.5 (среда R10 + конидии).
2. Анализ конидиальной жизнеспособности
   1. Удаляйте среду после каждого инкубационного периода (3 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 120 ч) и дважды промывают клетки PBS, чтобы удалить конидии, которые не были фагоцитированы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль, содержащий среду R10 + конидии, не следует мыть.
   2. Добавьте 0,5 мл стерильной дистиллированной воды в каждую лунку и инкубируйте планшет при 37 °C и 5% CO₂ в течение 30 мин. По истечении этого времени наблюдайте за морфологией клеток под инвертированным микроскопом, чтобы убедиться, что клетки были лизированы.
   3. Соберите суспензию и перелейте ее в пробирки по 1,5 мл. Центрифугируйте суспензию с помощью мини-центрифуги при 6 000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
   4. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 10 мкл стерильной дистиллированной воды и засейте 10 мкл суспензии в пластину, содержащую КПК, при температуре 28 °C в темноте.
   5. Подготовьте положительный контроль роста T. stromaticum : используйте суспензию конидий T. stromaticum (шаг 2.2) для приготовления новой суспензии с конечной концентрацией 8 x 10⁶ конидий/мл. Замочите 10 мкл этой суспензии в КПК при 28 °С в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мкл этой суспензии будут содержать такое же количество конидий (8 x 10⁴), которое было использовано для заражения мононуклеарных макрофагов крови. Разница между этим положительным контролем и контролем, упомянутым на этапе 5.1.2, заключается в том, что контроль, упомянутый выше на этапе 5.1.2, используется для оценки возможного влияния среды R10 на рост триходермы во время фагоцитоза. Этот положительный контроль на этапе 5.2.5 с использованием суспензии конидий T. stromaticum, собранных в PBS, представляет собой контроль роста триходермы без влияния среды R10, отражающей естественный рост грибка. Используя этот контроль, можно оценить, влияет ли среда R10 на рост триходермы .
   6. Наблюдайте за кинетикой роста T. stromaticum в ПИТ каждый день и фотографируйте культуру.
   7. Анализ: Для оценки результатов можно использовать два пункта: 1) время (в днях), необходимое для того, чтобы культура заняла всю культуральную пластину, и 2) время (в днях) до появления характерной зеленой пигментации конидий T. stromaticum в культуре.

6. Статистический анализ

1. Используйте тест Краскела-Уоллиса для определения статистически значимых различий между 8 группами/методами лечения. Считать р < 0,05 статистически значимыми. Все данные представлены в виде средних значений ± стандартному отклонению (SD). На рисунках # обозначает статистическую значимость при p < 0,05.

Results

Методика фагоцитоза грибковых конидий макрофагами широко используется для исследований, оценивающих модуляцию иммунных реакций против грибов. Мы использовали фагоцитоз конидий T. stromaticum для оценки жизнеспособности конидий после фагоцитоза, поскольку уклонение от фагоцитоза и выход фагосом являются механизмами вирулентности грибов. Исследователи должны использовать эти методы в качестве одного из первых тестов при исследовании вида, представляющего клинический интерес.

Discussion

Для некоторых грибковых патогенов, включая Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans и другие, конидиальный или дрожжевой фагоцитоз является ключевым процессом, позволяющим исследовать цитоплазматические и молекулярные события во взаимодействиях макрофагов и патогенов, а также определить время гибели интернализованных конидий 14,39,40. Фагоцитоз является ключевым процессом во взаимодействии...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Центрифужные пробирки 15 мл	Corning	CLS431470	15 мл центрифужные пробирки, полипропиленовые, коническое дно с крышкой, индивидуально стерильные
24-луночные планшеты для культивирования клеток с плоским дном	Kasvi	K12-024	Изготовлены из полистирола с буквенно-цифровой идентификацией; Планшет для культивирования клеток не содержит ДНКазы, РНКазы и пирогенов, а также цитотоксических веществ; Стерилизуется гамма-излучением;
Инкубатор для клеточных культур CO2	Sanyo	303082	CO2-инкубатор служит для создания и контроля условий, схожих с человеческим организмом, тем самым позволяя in vitro расти и пролиферировать различные типы клеток.
Центрифуга Микропробирка (тип eppendorf) 1,5 мл	Capp	5101500	Изготовлена из полипропилена, с прикрепленным к пробирке колпачком для открывания и закрывания одной рукой. Он имеет полированную внутреннюю часть против адгезии белка и для видимости образца, не содержит ДНКазы, РНКазы и пирогенов
Круговое покровное стекло 15 мм	Olen	K5-0015	Круглое покровное стекло используется для методов микроскопии в клеточных культурах. Изготовлен из суперпрозрачного полупрозрачного стекла; с толщиной 0,13 мм
Класс II Тип B2 (Total Exhaust) Шкафы биобезопасности	Esco Lifesciences group	2010274	Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) обеспечивают защиту продукта, оператора и окружающей среды и подходят для работы со следовыми количествами токсичных химических веществ и агентов, отнесенных к уровням биологической безопасности I, II или III. В шкафу класса II типа B2 весь входящий и нисходящий воздух удаляется после фильтрации HEPA/ULPA во внешнюю среду без рециркуляции по рабочей поверхности.
Декстроза Картофельный агар среда	Merck	145	Картофель Декстроза Агар используется при выращивании и подсчете дрожжей и грибков
Вакуумная пробирка для сбора крови EDTA	FirstLab	FL5-1109L	EDTA является рекомендуемым антикоагулянтом для гематологических процедур, поскольку это лучший антикоагулянт для сохранения морфологии клеток.
Энтеллан	Мерк	1.07961	Фиксирующее средство; Entellan - это безводный монтажный носитель для стационарного монтажа для микроскопии.
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	A2720801	фетальная бычья сыворотка (FBS) - это a  Универсальная добавка для роста клеточных и тканевых культуральных сред. FBS представляет собой естественный коктейль из большинства факторов, необходимых для прикрепления, роста и пролиферации клеток, эффективный для большинства типов клеток человека и животных (включая насекомых).
Flaticon			база данных изображений
Глицерин		Merck 24900988	Криопротектор глицерин используется для замораживания клеток и спор
Histopaque-1077			раствор полисахарозы
Изображение J			Программное обеспечение для анализа изображений
Предметные стекла для микроскопии	Precision	7105	Предметное стекло для микроскопии 26 x 76 мм Матовое внахлест Толщина от 1,0 до 1,2 мм. Изготовлен из специального оптического стекла и упакован в шелковую бумагу Разделитель с высоким качеством прозрачности без дефектов
Мини-центрифуга	Prism	C1801	Мини-центрифуга Prism была спроектирована так, чтобы быть чрезвычайно компактной и занимать исключительно небольшую площадь. Включает в себя 2 сменных быстросъемных ротора, которые вращаются со скоростью до 6000 об/мин. Электронный тормоз обеспечивает быстрое замедление, а самооткрывающаяся крышка обеспечивает легкий доступ к образцу, сокращая время обработки.
Камера Нойбауэра	Kasvi	K5-0011	Счетная камера Нойбауэра используется для подсчета элементов или других взвешенных частиц.
Паноптический быстро	Laborclin	620529	Laborclin's  panoptic fast c - набор для быстрого окрашивания в гематологии
Раствор пенициллина/стрептомицина - 10,000U	LGC- Биотехнология	BR3011001	антибиотик применяется для того, чтобы избежать возможного загрязнения при манипуляциях наружу по отношению к ламинарному потоку.
Чашка Петри 90 x 15 мм Smooth	Cralplast	18248	Одноразовая чашка Петри; Изготовлен из высокопрозрачного полистирола (ПС); плоское дно; Гладкий; Размер: 90 х 15 мм.
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	thermo fisher Scientific	10010001	PBS представляет собой солевой раствор на водной основе с простой рецептурой. Он изотоничен и не токсичен для большинства клеток. Он включает в себя хлорид натрия и фосфатный буфер и разработан для предотвращения осмотического шока при сохранении водного баланса живых клеток.
Пипетка Пастер 3 мл Стерильная	Accumax	AP-3-B-S	СТЕРИЛЬНАЯ ACCUMAX ПАСТЕР 3 МЛ ПИПЕТКА ЕМКОСТЬЮ 3 мл, изготовленная из прозрачного полиэтилена низкой плотности (ПВД) и индивидуально стерильная
Охлаждаемая центрифуга	Thermo Scientific	TS-HM16R	Охлаждаемая центрифуга Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R представляет собой охлаждаемую центрифугу с удобной панелью управления, позволяющей легко установить скорость, значение RCF, продолжительность,  температурный режим, а также профиль хода. Megafuge 16R может развивать максимальную скорость... 15 200 об/мин и максимальная RCF 25 830 x g.
RPMI-1640 Medium	Merck	MFCD00217820	HEPES Модификация, с L-глутамином и 25 мМ HEPES, без бикарбоната натрия, порошок, подходит для клеточных культур
Одноканальные микропипетки	Eppendorf	Z683809	Одноканальные микропипетки используются для точного переноса и измерения очень малых количеств жидкостей.
Наконечник для микропипеттора	Corning	4894	емкостью 10 & микро; L и 1,000 & микро; L Автоклавируемый
триокулярный инвертированный микроскоп	LABOMED	VU-7125500	Он позволяет наблюдать за клетками внутри пробирок и флаконов, не открывая их, тем самым избегая проблем с загрязнением.