Методическая статья

Выделение дермальных лимфатических эндотелиальных клеток мыши

DOI:

10.3791/65393

⸱

21 июля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Laboratory of Molecular Pharmacology, Department of Pharmacy, University of Patras, 3Division of Flow Cytometry and Division of MDx & Life Sciences, SB BioAnalytica, 4Basic Sciences Laboratory, Department of Physiotherapy, University of Peloponnese, 5Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical School, University of Patras, 6School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana at Monroe

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе описан метод выделения эндотелиальных клеток мышей из дермальных лимфатических капилляров с помощью магнитных шариков. Выделенные лимфатические эндотелиальные клетки могут быть использованы для последующих экспериментов in vitro и анализа экспрессии белков.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лимфатическая система участвует в регуляции иммунного надзора, всасывания липидов и баланса тканевой жидкости. Выделение мышиных лимфатических эндотелиальных клеток является важным процессом для лимфатических исследований, поскольку позволяет проводить in vitro и биохимические эксперименты на выделенных клетках. Кроме того, развитие технологии Cre-lox позволило устранить тканеспецифический дефицит генов, которые не могут быть глобально нацелены, что привело к точному определению их роли в изучаемых тканях. Анализ роли тех или иных генов в лимфатической физиологии и патофизиологии требует использования лимфатических специфических промоторов и, таким образом, экспериментальной проверки уровней экспрессии генов-мишеней.

Методы эффективного выделения лимфатических эндотелиальных клеток от мышей дикого типа или трансгенных мышей позволяют использовать анализы ex vivo и in vitro для изучения механизмов регуляции лимфатических функций и идентификации уровней экспрессии изучаемых белков. Мы разработали, стандартизировали и представили протокол эффективного выделения мышиных дермальных лимфатических эндотелиальных клеток (DLECs) с помощью магнитной очистки шариками на основе экспрессии LYVE-1. Изложенный протокол направлен на то, чтобы вооружить исследователей инструментом для дальнейшего понимания и выяснения важных игроков функций эндотелиальных клеток лимфы, особенно в учреждениях, где отсутствует оборудование для сортировки клеток, активируемых флуоресценцией.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лимфатическая система играет ключевую роль в физиологии человека. Он считается жизненно важным гомеостатическим фактором, который способствует важным функциям, таким как поддержание баланса тканевой и плазменной жидкости, иммунный надзори абсорбция липидов1, а также недавно выявленным функциям, таким как восстановительнаяспособность сердца2 и регенеративная способность костей и кроветворения3. Несмотря на значительную роль лимфатической системы, некоторые аспекты роли лимфатических систем, а также молекулярные механизмы, управляющие определенными физиологическими параметрами и реакциями, остаются неясными. Кроме того, дефекты лимфатических сосудов являются провоцирующими или ухудшающими факторами при определенных патофизиологических состояниях. Хорошо известными примерами являются первичные и вторичные лимфедемы, в зависимости от генетического или негенетического происхождения заболевания соответственно, в то время как роль лимфатической системы в росте первичной опухоли и метастатической диссеминации является ключевой, поскольку она может выступать в качестве проводника метастазирования и модулятора иммунных функций1.

Отставание в изучении и знании лимфатической системы по сравнению с кровеносной сосудистой системой в основном связано с более поздним открытием лимфатической системы по сравнению с кровеносной сосудистой системой и задержкой в идентификации лимфатических специфических молекулярных маркеров. В последние десятилетия ситуация значительно улучшилась, что привело к изменению традиционной картины лимфатических сосудов в равновесном состоянии и в болезненныхсостояниях. Подобно ангиогенезу, лимфангиогенез представляет собой образование новых лимфатических сосудов из уже существующих и играет ключевую роль в развитии широкого спектра заболеваний 4,5,6. Однако, в отличие от ангиогенеза, исследование лимфангиогенеза было ограничено в основном моделями in vivo, сосредоточенными на формировании сосудов развития и структурных дефектах в патологических моделях. Выделение лимфатических эндотелиальных клеток имеет важное значение для исследований in vitro, и это может быть обеспечено представленным протоколом.

Разработано несколько протоколов выделения эндотелия лимфы от мышей, которые требуют использования сортировки клеток, активируемых флуоресценцией7. Преимуществом сортировщика клеток, если он доступен, является более высокая степень чистоты, в отличие от выделения на основе гранул, причем последнее обеспечивает более высокий выход. В протоколе используется экспрессия лимфатического эндотелиального гиалуронового рецептора 1 (LYVE-1), маркера лимфатического эндотелия, важного для переноса клеток в лимфатических сосудах 4,8. Поскольку экспрессия LYVE-1 ограничена лимфатическими капиллярами, а не собирающими лимфатическими сосудами, метод подходит для выделения лимфатических эндотелиальных клеток конкретно из лимфатических капилляров, в отличие от других лимфатических маркеров, таких как подопланин, которые экспрессируются равномерно во всех лимфатическихэндотелиальных клетках. Для протокола были исключены другие важные лимфатические маркеры, которые не были трансмембранными, такие как Prox1.

Поскольку физиологическим результатом был лимфангиогенез, который обычно инициируется в лимфатических капиллярах, LYVE-1 был выбран в качестве мишени из-за его селективности в этих клетках и потому, что выбранное антитело обеспечивало высокий выход. В качестве ферментов использовались коллагеназа типа II, которая, как известно, более эффективна в диссоциации коллагена, чем тип I10, и диспаза, более широкая протеаза, регулярно используемая для разделения дермы и эпидермиса11; Тем не менее, сообщалось о других ферментах для разделения тканей12,13 и которые могут быть использованы. Целью данного протокола является описание метода выделения дермальных лимфатических эндотелиальных клеток из лимфатических капилляров взрослых мышей с высоким выходом с использованием магнитной очистки шариками, особенно в местах, где сортировка клеток, активируемых флуоресценцией, недоступна. Метод подходит для применений, где чистота лимфатических эндотелиальных клеток может быть нарушена при последующих применениях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования на животных проводились в соответствии с утвержденными протоколами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Центра медицинских наук Техасского технологического университета (TTUHSC) для экспериментов в TTUHSC и Ветеринарной администрацией префектуры Западной Греции в соответствии с Директивой 2010/63 для экспериментов в Университете Патр. Неукоснительно соблюдайте правила утилизации отходов при утилизации отходов жизнедеятельности животных.

1. Изоляция дермы мыши

  1. День 1
    ПРИМЕЧАНИЕ: В день 1; Подготовьте следующие материалы и оборудование: анестезиологическую камеру, машинку для стрижки шерсти животных, изофлуран, тонкие щипцы, шприцевые фильтры 0,2 мкм.
    1. Приготовьте раствор диспазы 2 мг/мл в DMEM с 1x Антибактериально-антимикотическим раствором и профильтруйте и стерилизуйте его.
      Примечание: Использование среды или PBS может быть заменено на HBSS, поскольку оно успешно использовалось в других протоколах, о которых сообщалось12. 1x Антимикотический раствор антибиотика может быть заменен добавлением пенициллина (100 МЕ/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и амфотерицина (2,5 мкг/мл).
    2. Обезболите мышь, поместив мышь в анестезиологическую камеру с введением изофлурана (0,5-2% изофлуран, расход: 1 л/мин). После того, как мышь перестанет двигаться, перенесите ее из клетки, и продолжайте анестезию, регулируя носовой конус с аналогичным потоком изофлурана. Ущипните животное за пальцы ног, чтобы убедиться в достаточном уровне анестезии, и постоянно следите за мышью, чтобы убедиться, что глубокая анестезия сохранена (отсутствует моторика). Подстригите примерно 9 см2 спинного и брюшного меха (спину и брюшко мыши соответственно) в продольном направлении по средней линии с помощью машинки для стрижки волос. Дайте мышке восстановиться после анестезии и верните ее в клетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо этого можно использовать крем для удаления волос (депиляции). Убедитесь, что мех полностью удален на изолируемых участках кожи, сохраняя при этом целостность кожи. Старайтесь обрезать как можно более протяженный участок кожи. Чтобы гарантировать, что потенциальное воспаление от эпиляции устранено, изоляция клеток должна быть проведена на следующий день. Для увеличения количества выделенных клеток объединяйте от 2 до 4 мышей в группе.
  2. День 2
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите наготове следующие материалы и оборудование: камеру для эвтаназии, шкаф биобезопасности, инкубатор CO2 , этанол, тонкие ножницы, тонкие щипцы, тупые щипцы, 100 мм планшет для культуры тканей, диспазу, DMEM, 1x антимикотический раствор антибиотика.
    1. Усыпьте мышь с введением CO2 и поместите ее в лежачее положение, обнажив обрезанную область. Распылите 70% этанол в качестве дезинфицирующего средства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, все шаги должны выполняться в стерильных условиях (в шкафу биобезопасности).
    2. Положите на лед стерильный планшет для культивирования тканей диаметром 100 мм.
    3. Сделайте поверхностный надрез на 0,5 дюйма в области живота и разрежьте продольно по средней линии к шее и нижней части живота. Сделайте боковые надрезы, чтобы иметь возможность вскрыть кожу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер разреза и изолированный участок кожи зависят от размера мыши.
    4. С помощью тупых щипцов аккуратно отделите кожу от окружающих тканей. Делают это обходя все туловище мыши, разрезая кожу сбоку вокруг шеи и нижней части живота.
    5. Осторожно поместите кожу в планшет для культуры тканей диаметром 100 мм стороной дермы вниз, сохраняя кожу как можно более растянутой. Накройте тарелки крышками и держите их на льду. Завершите изоляцию всех мышей из группы.
    6. После того, как кожа будет извлечена из всех мышей, инкубируйте планшеты в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы эксплант расплющился.
    7. Добавьте в планшет 6 мл раствора Dispase, убедившись, что кожа полностью погружена, и инкубируйте в течение ночи при слабом перемешивании при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо Диспазы также можно проводить расщепление трипсина12 с последующим лечением Либеразой вместо коллагеназы II типа (ниже).

2. Выделение клеток из дермы

  1. День 3
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите наготове следующие материалы и оборудование: центрифугу, инкубатор CO2 , шкаф биобезопасности, ножницы, DMEM, 1x раствор антибиотика-антимикотика, коллагеназа типа II, PBS, коническая трубка 50 мл, тканевые планшеты 100 мм и 60 мм, раствор ДНКазы I, коллаген типа I, клеточные фильтры 70 мкм и 40 мкм, шприцевые фильтры 0,2 мкм, среда LEC.
    1. Приготовьте 500 мл 1x PBS (1,37 М NaCl, 27 мМ KCl, 100 мМ Na2HPO4, 18 мМ KH2PO4, pH 7,4) и проведите автоклав в течение 20 мин при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм или простерилизуйте фильтром. В качестве альтернативы можно использовать коммерчески доступный стерильный PBS.
    2. Приготовьте 10 мл 2 мг/мл раствора коллагеназы типа II в DMEM с 1x Антимикотическим раствором антибиотика и простерилизуйте его.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте следующие шаги под стерильным колпаком, чтобы снизить вероятность загрязнения образца.
    3. С помощью пипетки удалите жидкость из чашки.
    4. Используйте щипцы, чтобы отделить дерму (нижнюю часть кожи) от эпидермиса (верхнюю) и удалить любую явную жировую ткань. Перенесите дерму на чистую тарелку для культуры тканей.
    5. Добавьте 1 мл DMEM с 1x Антимикотическим раствором антибиотика в чистую тарелку для культуры тканей и наклоните ее так, чтобы жидкость скапливалась на одной стороне пластины.
    6. Измельчите дерму на1-2 мм 2 штуки и переложите их в новую коническую трубку объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале этот этап должен быть завершен в течение 4-5 минут, так как более длительная обработка не должна обеспечить более высокий выход или выживаемость клеток.
    7. Добавьте 10 мл раствора коллагеназы II типа.
    8. Добавьте 50 мкл (25 ед/мл раствора) раствора ДНКазы I (уменьшает комкование клеток) и переваривайте раствор дермы в течение 2 ч при 37 °С при непрерывном перемешивании (используйте вращающийся/встряхивающий инкубатор при 30-50 об/мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Периодически проверяйте, была ли переварена большая часть дермы. Если нет, увеличьте время разложения (максимум 1 час) и скорость перемешивания, если это возможно.
    9. Покройте 60 мм планшеты для культуры тканей 2 мл коллагена 10 мкг/мл типа I в 0,02 М уксусной кислоты в течение >20 мин при 37 °C. Промыть 2 раза стерильным PBS.
    10. Фильтруйте суспензию клетки с помощью сетчатого фильтра 70 мкм и центрифугируйте при 250 × г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
    11. Ресуспендируйте в 10 мл DMEM с 1x Антибактериально-антимикотическим раствором.
    12. Фильтруйте суспензию клеток с помощью фильтра для клеток 40 мкм и центрифугируйте при 250 × г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
    13. Ресуспендируйте в 1 мл полной среды LEC (базовая среда для роста эндотелиальных клеток с добавкой).
    14. Поместите клетки в покрытый коллагеном 60-миллиметровый планшет для культуры тканей в полной среде LEC. Это будет день 0 клеточной культуры.
    15. Заменяйте фильтрующий материал каждые 2 дня, дважды промывая ячейки 1x PBS и добавляя свежий фильтрующий материал LEC.
    16. Повторяйте шаг 2.1.15 до тех пор, пока клетки не сойдутся на 80-90%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если очистка проводится до того, как клетки сливаются на 80-90%, будет выделено меньше лимфатических эндотелиальных клеток. Этот процесс занимает от 7 до 10 дней.

3. Покрытие магнитными шариками с антителом LYVE-1

ПРИМЕЧАНИЕ: За день до этапа очистки подготовьте следующие материалы и оборудование: холодильник 4 °C, ротор, магнитный сепаратор, PBS, магнитные шарики Anti-rabbit IgG, микроцентрифужные пробирки, шприцевые фильтры 0,2 мкм, раствор для покрытия магнитных шариков, антитело LYVE-1.

  1. Приготовьте раствор для нанесения магнитных шариков: 20 мл PBS с 0,1% BSA и 2 мМ ЭДТА и отфильтруйте и простерилизуйте его. Хранить при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение более нескольких дней не рекомендуется; Перед использованием проверьте наличие осадков или загрязнений.
  2. Нанесите пипетку объемом 500 μл магнитных шариков Anti-Rabbit IgG в микроцентрифужную пробирку и добавьте 1 мл ледяного раствора для покрытия магнитных шариков.
  3. Используйте магнитный сепаратор для промывки шариков.
  4. Повторите промывку 2 раза, добавив 1 мл ледяного раствора для нанесения магнитных шариков.
  5. Суспендируйте шарики в 500 μL раствора для нанесения магнитных шариков и сделайте аликвоты по 150 μL в микроцентрифужных пробирках.
  6. Добавьте 15 мкг антитела LYVE-1 в каждую пробирку (15 мкл из 1 мг/мл исходной концентрации антитела).
  7. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C при непрерывном перемешивании.

4. Очищение лимфатических эндотелиальных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте следующие материалы и оборудование: инкубатор CO2 , шейкер, таймер, парапленку, DMEM, 1x Антимикотический раствор, BSA, PBS, раствор для нанесения магнитных шариков, трипсин-ЭДТА, планшеты для тканевых культур 100 мм или 60 мм, шприцевые фильтры 0,2 мкм, коллаген типа I, уксусную кислоту, среду LEC.

  1. Приготовьте 50 мл DMEM с 1x Антибактериально-антимикотическим раствором и 0,1% BSA и процедилизуйте его.
  2. Покройте 60 мм планшеты для культивирования тканей коллагеном типа I 10 мкг/мл уксусной кислотой 0,02 М в течение >20 мин при 37 °C. Промыть 2 раза стерильным PBS.
  3. Промойте предварительно покрытые шарики 1 мл раствора для нанесения магнитных покрытий с помощью магнитного сепаратора.
  4. Ресуспендируйте гранулы в 150 мкл DMEM с 0,1% BSA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь бусины можно хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.
  5. Промойте клетки 2 раза с помощью PBS.
  6. Добавьте в клетки 3 мл DMEM с 0,1% BSA (для планшета для культуры тканей диаметром 60 мм) и 50 мкл конъюгированных с антителами гранул.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки двух или более мышей объединены, используйте 100-миллиметровый планшет для культивирования тканей и добавьте 6 мл DMEM с 0,1% BSA.
  7. Запечатайте посуду парапленкой.
  8. Поставьте чашку на шейкер, перемешивая при 10 оборотах в минуту при RT, и выдерживайте ровно 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительная инкубация приведет к неспецифическому связыванию. Чтобы убедиться, что шарики взаимодействуют со всей поверхностью пластины, вручную поворачивайте пластину каждые несколько минут, пока она продолжает трястись.
  9. Выбросьте среду и промойте клетки один раз PBS. Быстро осмотрите клетки, чтобы убедиться в наличии колоний LEC на пластине.
  10. Трипсинизируйте клетки: используйте 1 мл трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение 3 минут при 37 °C. Осмотрите клетки на предмет успешной отслойки клеток.
  11. Нейтрализуйте раствор 2 мл полной среды LEC и переложите раствор в стерильную полипропиленовую пробирку объемом 5 мл.
  12. С помощью магнитного сепаратора промойте ячейки 4 x 3 мл DMEM с 0,1% BSA для удаления несвязанных клеток.
  13. Ресуспендируйте оставшиеся связанные с бусинами клетки в полной среде и планшете LEC на ранее покрытые коллагеном 60-миллиметровые планшеты для культивирования тканей.
  14. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C и меняйте среду через день после двух промывок PBS.
  15. Культивируйте клетки до тех пор, пока они не достигнут слияния (обычно это занимает от 7 до 10 дней).
  16. На этом этапе проверьте клетки под микроскопом на конфлюенцию и приступайте к подготовке клеток к проточной цитометрии. Если выявлен высокий процент F4/80+, то повторите этап очистки с помощью LYVE-1 (Шаг 4: Очистка лимфатических эндотелиальных клеток) еще раз или в идеале с помощью другого лимфатического маркера (например, подопланина14).
    Примечание: Высокая экспрессия белка, на который нацелено антитело, на популяцию клеток, очищенных магнитными шариками, была продемонстрирована15,16. Тем не менее, для LYVE-1 важно провести контроль проточной цитометрии для идентификации процентного соотношения других клеток LYVE-1+, в основном макрофагов. LYVE-1 экспрессируется только в подмножествах макрофагов, которые связаны с опухолями и ранами, в то время как в здоровой коже экспрессия LYVE-1 более ограничена лимфатическими эндотелиальными клетками. Таким образом, скрининг F4/80 не является обязательным, а скорее зависит от контекста эксперимента. У мышей, использованных для демонстрации, не было опухолей или ран, только потенциальное воспаление от удаления волос, но мы включили окрашивание F4/80 в качестве исходного уровня процентного содержания макрофагов LYVE-1+.

5. Проточная цитометрия

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте следующие материалы и оборудование: центрифугу, инкубатор CO2 , таймер, гемоцитометр, раствор ЭДТА, 1x антимикотический раствор антибиотика, BSA, PBS, трипсин-ЭДТА, полипропиленовые трубки, шприцевые фильтры 0,2 мкм, 70% этанол, F4/80 FITC-конъюгированное антитело.

  1. Приготовьте PBS, содержащую 0,1% BSA, и отфильтруйте и простерилизуйте его.
  2. Приготовьте 1 мМ раствор ЭДТА в PBS.
  3. Трипсинизация клеток: инкубируйте клетки с 1 мл 1 мл 1 мМ раствора ЭДТА в течение 5 мин при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация с раствором ЭДТА является более мягким методом отделения клеток, который лучше сохраняет трансмембранные белки и является предпочтительным, но требует более длительных периодов инкубации. В качестве альтернативы раствор трипсин-ЭДТА можно использовать для инкубации в течение 1 минуты при 37 °C, но это может повлиять на аффинность антител для применения в проточной цитометрии.
  4. Нейтрализуйте раствор 2 мл полной среды LEC и переложите раствор в стерильную полипропиленовую пробирку объемом 5 мл.
  5. Центрифугируйте образцы при 250 × г в течение 5 минут.
  6. Постирайте с помощью PBS.
  7. Повторите центрифугирование и промывку PBS.
  8. Ресуспендируйте клетки в PBS, содержащем 0,1% BSA, и подсчитайте их с помощью гемоцитометра или альтернативного метода. Аликвота ~1 × 106 ячеек в полипропиленовые пробирки с конечным объемом 100 мкл. Начиная с этого шага, выполняйте все шаги при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть зафиксированы до окрашивания или окрашены при жизни. Фиксация может быть неоптимальной для проточной цитометрии, так как некоторые антитела могут не обнаруживать антигены после фиксации; Поэтому мы рекомендуем проводить проточную цитометрию сразу после предыдущего этапа и пропустить этап фиксации. Если это невозможно, фиксация до эксперимента с проточной цитометрией позволит отложить этап проточной цитометрии. Если необходимо провести фиксацию, следует заранее оценить эффективность антител в контексте фиксированных клеток.
  9. Выполните фиксацию (необязательный шаг; если клетки не подлежат фиксации, приступайте к иммуноокрашиванию): повторно суспендируйте клетки в ледяном 70% этаноле и аккуратно перемешайте в течение 10 минут на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация этанола может проникать в клетки и приводить к высвобождению GFP; Тем не менее, фиксация на основе параформальдегида может разрушать красители, используемые для проточной цитометрии, и в идеале ее можно избежать.
  10. Выдерживать 15 минут при комнатной температуре.
  11. Промойте ячейки 2 раза центрифугированием при 250 × г в течение 5 мин в 1x PBS.
  12. Перейдите к следующему этапу или ресуспендируйте клетки в 0,5-1 мл 1x PBS и храните при 4 °C.

6. Иммуноокрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с клетками осторожно и по возможности избегайте чрезмерного пипетирования, чтобы сохранить целостность клеточной мембраны и свести к минимуму гибель клеток, гарантируя, что клетки не образуют скоплений. Из выделенных эндотелиальных клеток получают следующие группы: неокрашенные клетки и окрашенные клетки с другим маркером эндотелиальных клеток (например, VEGFR3, подопланин), F4/80 и оба. Включите коммерчески доступные лимфатические эндотелиальные клетки и макрофаги мыши, если таковые имеются, в качестве положительного контроля. В демонстрационных целях и из-за эндогенной флуоресценции tdTomato (PE+) мы использовали окрашивание F4/80, сопряженное с FITC.

  1. Разведите первичное антитело в PBS с 0,1% BSA в соответствии с рекомендуемым или оптимизированным разведением. Добавьте 0,5 мкг (1 мкл раствора антитела) F4/80 FITC-конъюгированного антитела к 100 мкл клеточной суспензии.
  2. Ресуспензия клеток после добавления разбавленного флуоресцентно-конъюгированного антитела. Перемешайте, щелкнув полипропиленовой трубкой, чтобы убедиться, что на ней нет комочков и все ячейки покрыты должным образом.
  3. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре (неподвижные клетки) или 30 мин на льду (живые клетки) в темноте.
  4. Промойте ячейки 2 раза, центрифугируя их при 250 × г в течение 5 минут при 4 °C (для живых клеток) или при комнатной температуре (для фиксированных клеток), используя PBS с 0,1% BSA в темноте.
  5. Для нефлуоресцентно-конъюгированных антител
    1. Разведите конъюгированное с флуорохромом вторичное антитело в инкубационном буфере. Для антител Alexa Flour используйте разведение 1:500.
    2. Добавьте вторичное антитело к 100 мкл раствора клеточной суспензии.
    3. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре (неподвижные клетки) или на льду (живые клетки).
    4. Дважды промыть центрифугированием при 250 × г в течение 5 мин при 4 °C (для живых клеток) или при комнатной температуре (для фиксированных клеток) в инкубационном буфере.
  6. Ресуспендируйте клетки в 0,5 мл 1x PBS и проанализируйте их с помощью проточного цитометра.
  7. Следуйте следующим шагам стратегии гейтирования, чтобы определить популяцию макрофагов в клетках, экспрессирующих LYVE-1:
    1. Рассмотрим прямое и боковое рассеяние, чтобы различить клеточную популяцию.
    2. Учитывайте прямое рассеяние для размера, площади и высоты ячеек, чтобы различать отдельные ячейки (синглеты).
    3. Учитывайте экспрессию F4/80 (FITC) и экспрессию RFP (PE) для идентификации макрофагов (F4/80+) в изолированных мышиных клетках, экспрессирующих tdTomato (PE) (из-за наличия флуоресцентного репортера tdTomato у конкретных мышей, описанных ниже).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод был разработан для идентификации экспрессии белка малой ГТФазы RhoA, кодирующий ген которой был флоксирован в обоих аллелях и удален под действием тамоксифен-индуцируемого лимфатического эндотелиально-специфического промотора Prox1-CreERT2 18. Изолированные LEC можно культивировать до четырех поколений, после чего они стареют. Они были заморожены, разморожены и успешно стимулированы ангиопоэтином-2. Из-за ограниченного количества проходов клеток мы не пробовали многократн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лимфатическая система является важным регулятором гомеостатической функции организма, наиболее важными функциями которой являются поддержание жидкостной плазмы, удаление побочных продуктов клеточного метаболизма и токсичных молекул, абсорбция липидов и транспортировка иммунных клеток 1,19. Идентификация соответствующих маркеров вызвала всплеск новых данных в области лимфатической системы, раскрывая новые функции лимфатической сосудистой системы, такие как их роль...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Греческого фонда исследований и инноваций (00376), Национальными институтами здравоохранения, Национальным институтом рака (NCI) [грант R15CA231339], грантом Школы фармацевтических наук Центра медицинских наук Техасского технологического университета (TTUHSC) (для C.M.M.), а также стартовым финансированием Колледжа фармацевтики Университета Луизианы Монро. Национальные институты здравоохранения (NIH) через Национальный институт общих медицинских наук [Грант P20 GM103424-21] и Подпрограмма конкурентоспособности исследований (RCS) Совета регентов Луизианы через Фонд поддержки Совета регентов (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (в G.M.). Общее используемое оборудование TTUHSC было получено за счет грантов Техасского научно-исследовательского института профилактики рака (CPRIT) RP190524 и RP200572. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, принятии решения о написании или подготовке рукописи. Графический реферат на рисунке 1А был создан с помощью BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 μ m Шприцевые фильтрыFisherScientific 09-719C
100 мм Чашки для культуры тканейFisher ScientificFB012924
60 мм Чашки для культуры тканейFisher ScientificFB012921
Машинка для стрижки шерсти животныхWahl
Антибиотик-антимикотический раствор 100xFisher Scientific15240-062
Тупые щипцыFine Science Tools11992-20
Сыворотка крупного рогатого скота АльбуминSigma-AldrichA4919
Клеточное фильтр 40 μ mFisher Scientific542040
Сетчатый фильтр для клеток 70 μ mFisher Scientific542070
CO2 инкубатор
Коллаген I, высокая концентрация CorningRat Tail Corning354249в 0,02 м Уксусная кислота в H2O
Collagenase Type IILife Technologies17101-015
DispaseLife Technologies17105-041
DMEMFisher Scientific11-995-073
Раствор ДНКазы I (2,500 Ед/мл)Thermo Scientific90083
Dynal MPC-L Концентратор магнитных частицInvitrogen120-21D
EDTASigma-Aldrich3690
Эндотелиальные клетки для роста основания и Добавка (среда LEC)R& D SystemsCCM027
Камера для эвтаназииEuthanex Corporation
Тонкие щипцыFine Science Tools11255-20
Fine Scissors-SharpFine Science Tools14060-10
FITC anti-mouse F4/80 АнтителаBiolegend123107
козы Anti-rabbit IgG Магнитные бусиныNew England BiolabsS1432S
LARC-A E-Z Индукционная камера для анестезииEuthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-rabbit IgG BeadsThermo Scientific21356
Раствор параформальдегида 4% в PBSFisher ScientificAAJ19943K2
фосфатно-солевой буфер (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
кролик против мышей LYVE-1ReliaTech GmbH103-PA50
Вращающийся/встряхивающий инкубатор
Полипропиленовые трубки с круглым дномCorning352063
Шприцевые фильтры w 0.2 μ m ПоресФишер Сайентиал09-719C
Трипсин-ЭДТАФишер Сайентифик25-300-120

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  2. Liu, X., et al. Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair. Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).
  3. Biswas, L., et al. Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury. Cell. 186 (2), 382-397 (2023).
  4. Tammela, T., Alitalo, K. Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise. Cell. 140 (4), 460-476 (2010).
  5. Ji, R. C. The role of lymphangiogenesis in cardiovascular diseases and heart transplantation. Heart Failure Reviews. 27 (5), 1837-1856 (2022).
  6. Patnam, M., et al. Lymphangiogenesis guidance mechanisms and therapeutic implications in pathological states of the cornea. Cells. 12 (2), 319(2023).
  7. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52691(2015).
  8. Jackson, D. G. Biology of the lymphatic marker LYVE-1 and applications in research into lymphatic trafficking and lymphangiogenesis. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 112 (7-8), 526-538 (2004).
  9. Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes and Development. 19 (3), 397-410 (2005).
  10. Wolters, G. H., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., van Schilfgaarde, R. Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation. Diabetes. 44 (2), 227-233 (1995).
  11. Kubo, A., Aoki, S., Fujita, H. Whole-mount preparation and microscopic analysis of epidermis. Current Protocols. 2 (7), e464(2022).
  12. Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
  13. Kazenwadel, J., Michael, M. Z., Harvey, N. L. Prox1 expression is negatively regulated by miR-181 in endothelial cells. Blood. 116 (13), 2395-2401 (2010).
  14. Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
  15. Choi, E. Y., et al. Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment. Science. 322 (5904), 1101-1104 (2008).
  16. Mikelis, C. M., et al. RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock. Nature Communications. 6, 6725(2015).
  17. Schledzewski, K., et al. Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis. Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).
  18. Akwii, R. G., et al. Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis. Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).
  19. Petrova, T. V., Koh, G. Y. Biological functions of lymphatic vessels. Science. 369 (6500), eaax4063(2020).
  20. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 453-458 (2003).
  21. Mellor, R. H., et al. Lymphatic dysfunction, not aplasia, underlies Milroy disease. Microcirculation. 17 (4), 281-296 (2010).
  22. Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. Phenotypic characterization of primary lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).
  23. Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).
  24. Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165(2019).
  25. Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).
  26. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  27. Garrafa, E., et al. Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues. Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).
  28. Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis. PLoS One. 7 (7), e40497(2012).
  29. Steele, M. M., et al. T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control. Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).
  30. Mammoto, T., et al. Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1. Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).
  31. Regina, C., et al. Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).
  32. Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

LYVE1

Похожие статьи