Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Производство Т-клеток химерного антигенного рецептора на автоматизированном клеточном процессоре

4.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65488

⸱

18 августа 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell and Gene Therapy Laboratory, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Division of Oncology, Department of Pediatrics, Children’s Hospital of Philadelphia, 3Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, 4Division of Transfusion Medicine, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Children’s Hospital of Philadelphia

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье подробно описан процесс производства Т-клеток с химерным антигенным рецептором для клинического использования, в частности, с использованием автоматизированного клеточного процессора, способного выполнять вирусную трансдукцию и культивирование Т-клеток. Мы даем рекомендации и описываем подводные камни, которые следует учитывать при разработке процесса и проведении ранней фазы клинического исследования.

Аннотация

Химерные антигенные рецепторы (CAR)-Т-клетки представляют собой перспективный иммунотерапевтический подход для лечения различных злокачественных и доброкачественных заболеваний. CAR-T-клетки — это генетически модифицированные Т-клетки, которые экспрессируют химерный белок, который распознает и связывается с мишенью на поверхности клетки, что приводит к уничтожению клетки-мишени. Традиционные методы производства CAR-T-клеток являются трудоемкими, дорогостоящими и могут быть сопряжены с риском загрязнения. CliniMACS Prodigy, автоматизированный клеточный процессор, позволяет производить продукты клеточной терапии в клиническом масштабе в закрытой системе, сводя к минимуму риск загрязнения. Обработка происходит в полуавтоматическом режиме под контролем компьютера и таким образом минимизирует участие человека в процессе, что экономит время и снижает вариативность и ошибки.

В этой рукописи и видео описывается процесс трансдукции Т-клеток (TCT) для производства CAR-T-клеток с использованием этого процессора. Процесс ТСТ включает обогащение, активацию, трансдукцию вирусным вектором CD4+/CD8+ Т-клеток, экспансию и сбор CD4+/CD8+ Т-клеток. С помощью Activity Matrix, функциональности, которая позволяет упорядочивать и определять время выполнения этих шагов, процесс TCT может быть полностью настроен. Мы проводим экскурсию по производству CAR-T-клеток в соответствии с действующей надлежащей производственной практикой (cGMP) и обсуждаем необходимые испытания и доклинические эксперименты, которые будут поддерживать заявку на экспериментальное новое лекарственное средство (IND). Мы демонстрируем осуществимость и обсуждаем преимущества и недостатки использования полуавтоматического процесса для клинического производства CAR-T-клеток. Наконец, мы описываем продолжающееся клиническое исследование, инициированное исследователем, которое нацелено на злокачественные новообразования у детей [NCT05480449] в качестве примера того, как этот производственный процесс может быть применен в клинических условиях.

Введение

Адоптивный перенос Т-клеток, сконструированных для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), показал замечательную эффективность в лечении пациентов с рефрактерными В-клеточными злокачественными новообразованиями 1,2,3,4,5. Однако традиционные методы производства CAR-T-клеток являются трудоемкими, отнимают много времени и требуют высококвалифицированных технических специалистов для выполнения узкоспециализированных этапов. Например, традиционный процесс производства аутологичного CAR-T-клеточного продукта включает в себя центрифугирование с градиентом плотности, элютриацию или магнитную сепарацию для обогащения Т-клеток, активацию и трансдукцию вирусным вектором в стерильной колбе и расширение в биореакторе перед сбором и составлением рецептуры. В последнее время появились различные системы, которые нацелены на частичную автоматизацию этого процесса. Например, Miltenyi CliniMACS Prodigy (далее именуемый «процессор») представляет собой автоматизированное устройство для обработки клеток, которое может выполнять многие из этих шагов в автоматическом режиме 6,7,8,9. Подробное обсуждение традиционных и автоматизированных методов производства CAR-T представлено в недавней обзорной статье10.

Процессор основан на функциональности CliniMACS Plus, одобренного Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) медицинского устройства для обработки гемопоэтических клеток-предшественников. Процессор включает в себя блок культивирования клеток, который позволяет выполнять автоматизированную промывку, фракционирование и культивирование клеток (рис. 1). Процесс трансдукции Т-клеток (TCT) представляет собой предустановленную программу в процессорном устройстве, которая в значительной степени повторяет ручное производство CAR-T-клеток. TCT позволяет настраивать обработку ячеек с помощью графического пользовательского интерфейса («Матрица активности», рис. 2). Поскольку процессор автоматизирует множество шагов и консолидирует функциональность нескольких устройств в одной машине, он требует от технологов меньшего обучения и специализированных навыков поиска и устранения неисправностей. Поскольку все этапы выполняются в закрытом комплекте одноразовых трубок, процессор может эксплуатироваться на объектах с менее строгой инфраструктурой обработки воздуха, чем это считается приемлемым для открытого производственного процесса. Например, мы эксплуатируем процессор на предприятии, сертифицированном по классу ISO 8 (сопоставимо с классом C ЕС).

figure-introduction-1
Рисунок 1: Производство CAR-T-клеток с использованием системы трансдукции Т-клеток. На рисунке показан процессор с установленным комплектом трубок. Комплект трубок позволяет соединять другие компоненты, такие как мешки, содержащие буфер для обработки, питательную среду и лентивирусный вектор, с помощью стерильной сварки. После того, как продукт для лейкафереза добавлен в пакет для нанесения, он может быть помечен гранулами для отбора Т-клеток, пропущен через колонку разделения, а затем перенесен в пакет для повторного нанесения. Затем отобранные клетки направляются в блок культивирования прибора для культивирования и активируются активационным реагентом (см. Таблицу материалов). Конечный продукт собирается в ячейковый мешок Target. На протяжении всего процесса возможен отбор образцов для контроля качества асептическим методом. Серые цифры внутри кругов обозначают пронумерованные клапаны на процессоре, которые направляют путь жидкости через комплект трубок. Воспроизведено с разрешения 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-introduction-2
Рисунок 2: Матрица активности. После выбора и активации Т-клеток оставшаяся часть процесса производства CAR-T-клеток полностью настраивается. Действия могут быть добавлены или удалены и запланированы на соответствующий день и время, а также может быть указан объем культуры после действия (Volume). Например, упражнение «Трансдукция» было настроено на начало в 10:00 утра в 1-й день, а объем культивирования в конце упражнения был установлен равным 100 мл. Матрицу активности можно редактировать в течение всего периода выращивания. Состояние процесса можно отслеживать на встроенном экране обрабатывающего устройства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Цель данной рукописи состоит в том, чтобы предоставить подробное описание производства CAR-T-клеток с использованием процессора, а также дать рекомендации по тестированию в процессе и выпуску продукта, которые, вероятно, потребуются регулирующим органам для одобрения заявки на исследуемый новый лекарственный препарат (IND). Представленный протокол близок к рекомендованному поставщиком подходу и является базовым протоколом для IND 28617, который в настоящее время оценивается в рамках одноцентрового клинического исследования I/II фазы, инициированного исследователем. Данное исследование направлено на определение безопасности и эффективности использования данного процессора для производства гуманизированных CD19-направленных аутологичных CAR-T-клеток у пациентов с В-клеточным острым лимфобластным лейкозом (B-ALL) или лимфобластной лимфомой линии B (B-Lly) [NCT05480449]. Исследование началось в сентябре 2022 года, и в нем планируется принять участие до 89 пациентов в возрасте от 0 до 29 лет с B-ALL или B-Lly. В рукописи мы приводим некоторые производственные результаты испытаний.

Мы хотели бы отметить, что, несмотря на то, что рукопись представлена в виде протокола с пошаговыми инструкциями, ее следует рассматривать как отправную точку для других людей, чтобы начать оптимизировать свой собственный процесс производства CAR-T-клеток. Неполный перечень возможных вариаций представленного протокола включает: использование в качестве исходного материала свежих вместо криоконсервированных Т-клеток; использование другого метода обогащения Т-клеток или его полное исключение; использование различных сред и цитокиновых коктейлей, таких как IL7/IL15 вместо IL2; варьирование концентрации АВ в сыворотке крови человека или ее полное исключение; время трансдукции; использование «многоударных» трансдукций; различное перемешивание, объемы культивирования и график кормления; использование различных методов генетического переноса, включая электропорацию нуклеиновых кислот или лентивирусных векторов; использование другого буфера для конечной рецептуры и/или криопротектора; и инфузия CAR-T-клеток в свежем виде вместо криоконсервации для инфузии в более позднее время. Эти вариации могут оказывать существенное влияние на клеточный состав и эффективность терапевтического препарата.

Общий этап процессаПроцессуальный деньТехнические детали
Обогащение клетокДень 0Выбор CD4+/CD8+ Т-клеток
Активация клетокПосев и активация культуры Т-клеток
Клеточная трансдукцияДень 1Лентивирусная трансдукция (объем культивирования 100 мл)
Клеточная экспансия (с последующей клеточной формулировкой)День 2--
День 3Культуральная промывка (1 цикл); Шейкер активирован; Объем культуры увеличивается до 200 мл
День 4--
День 5Корм (50 мл); Объем культуры достигает конечного объема 250 мл
День 6Образец в процессе обработки; Обмен средами (-125 мл / +125 мл)
День 7Обмен средами (-150 мл / +150 мл) или Harvest
День 8Образец в процессе обработки; Обмен средами (-150 мл / +150 мл) или Harvest
День 9Обмен средами (-180 мл / +180 мл) или Harvest
День 10Образец в процессе обработки; Обмен средами (-180 мл / +180 мл) или Harvest
День 11Обмен средами (-180 мл / +180 мл) или Harvest
День 12Обмен средами (-180 мл / +180 мл) или Harvest
День 13Урожай

Таблица 1: График и обзор процесса. В этой таблице обобщены этапы процесса TCT, используемые в текущем клиническом исследовании [NCT05480449]. Процесс начинается с обогащения Т-клеток путем отбора CD4+/CD8+, посева культуры и активации на 0-й день, за которым следует трансдукция в 1-й день. Клетки отдыхают в течение 48 ч с последующей промывкой культуры, увеличением объема культуры до 200 мл и перемешиванием с помощью встряхивающего механизма. На 6-й день отбирается первая проба в процессе производства. Забор клеток осуществляется при наличии достаточного количества клеток для получения по крайней мере трех полных доз CAR-T-клеток (5 × 10 6 CAR-T-клеток/кг, если пациент весит <50 кг, в противном случае 2,5 × 108 CAR-T-клеток) и контроля качества (~2 × 106 CAR-T-клеток); или после того, как культура достигнет в общей сложности 4-5 х 109 клеток. Сокращения: TCT = трансдукция Т-клеток; CAR-T = химерный антигенный рецептор Т-клеток; MACS = магнитно-активируемая сортировка клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования были проведены в соответствии с институциональными рекомендациями с одобрения Институционального наблюдательного совета больницы (IRB), и все субъекты предоставили информированное согласие на публикацию данных, собранных в контексте исследования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В первом разделе Протокола представлен общий обзор процесса производства CAR-T. В остальных разделах приведены пошаговые инструкции. Протокол описывает рабочий процесс с использованием программного обеспечения TCT версии 1.4, которая является текущей версией на момент написания этой статьи. Пользовательский интерфейс других версий программного обеспечения TCT может отличаться.

1. График и обзор процесса (табл. 1)

  1. Подготовьтесь к процедуре в понедельник (День -1) с предполетным проверком. Убедитесь, что процессор и другое оборудование работают должным образом, а все реагенты и расходные материалы доступны и актуальны в течение всего производственного цикла.
  2. На день 0 установите комплект трубок на машину. Предварительно криоконсервированные Т-клетки разморозить в сухой ванне и соединить их стерильной сваркой с комплектом трубок, установленным на приборе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предполагает, что аутологичные Т-клетки были собраны с помощью афереза, криоконсервированы и сохранены до начала производства. Несмотря на то, что можно использовать свежесобранные Т-клетки, это увеличивает логистическую нагрузку, поскольку требует координации сбора афереза с производством CAR-T-клеток. Мы настоятельно рекомендуем использовать процесс сухого оттаивания вместо водяной бани, чтобы свести к минимуму риск бактериального загрязнения.
  3. Помечают Т-клетки реагентами CD4 и CD8 (см. таблицу материалов) и обогащают магнитной селекцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обогащение Т-клетками можно пропустить или выполнить до загрузки ячеек в процессор. См. раздел 5 Протокола.
  4. После обогащения CD4+/CD8+ клеток берут образец для подсчета клеток. Засевают культуру с 1-2 × 108 клеток в исходном объеме 70 мл среды (см. таблицу материалов) с добавлением 5% АБ сыворотки человека и рекомбинантного человеческого IL2 (25 нг/мл).
  5. Добавляют флакон с активационным реагентом (коллоидная полимерная наноматрица, конъюгированная с антителами к CD3 и CD28; см. таблицу материалов) для активации Т-клеток и инкубируют культуру без перемешивания в течение 24 ч при 37 ºC в атмосфере 5%CO2 . При необходимости законсервируйте все оставшиеся клетки CD4+/CD8+ в качестве резерва.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае производственного сбоя в качестве исходного материала могут быть использованы оставшиеся отобранные CD4+/CD8+ клетки. Если неисправность является чисто технической, например, загрязнением или ошибкой оператора, и осталось достаточное количество ячеек, то можно рассмотреть возможность использования оставшихся ячеек для выполнения дополнительного производственного цикла. Если качество исходного материала вызывает беспокойство, то может потребоваться новая процедура афереза; Однако, в конечном счете, это клиническое решение. В любом случае, производственный сбой является значительным событием, которое должно быть расследовано, и спонсор и, возможно, регулирующие органы должны быть проинформированы.
  6. Через 24 ч после активации трансдуцируют Т-клетки лентивирусным вектором при соответствующей кратности инфекции (MOI).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом производства клинических препаратов крайне важно определить титр лентивирусного вектора и установить соответствующий MOI. Титр вектора должен быть определен путем проведения мелкомасштабного эксперимента, в котором первичные Т-клетки человека трансдуцируются при различных концентрациях вектора. При выборе соответствующего MOI необходимо учитывать стоимость вектора, требуемую эффективность трансдукции и допустимое число копий вектора. Этот протокол использует MOI 30-50%, чтобы минимизировать стоимость вектора и поддерживать среднее количество копий вектора ниже 8 копий на трансдуцируемую ячейку.
  7. На 3-й день активируйте упражнение «Культурная промывка» и начните низкоуровневое перемешивание. Увеличьте объем культуры до 200 мл.
  8. На 5-й день добавьте в культуру 50 мл среды, увеличив объем культуры до 250 мл.
  9. На 6-й день культивирования берут образец из культуры и подсчитывают CAR-T-клетки методом проточной цитометрии. Используйте это измерение, чтобы оценить скорость, с которой растет культура, и определить оптимальное время сбора урожая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый отбор проб в процессе дает 3 мл для тестирования и удаляет в общей сложности 7 мл объема культуры.
  10. С 7-го по 13-й день, если культивирование не было прекращено, возьмите до двух дополнительных проб в процессе обработки через день и выполняйте ежедневный обмен средами для кормления растущей культуры. Собирайте продукт, когда общее количество ядросодержащих клеток (TNC) достигнет 5 × 109 и/или когда будет доступно достаточное количество клеток для необходимого количества доз и тестирования на высвобождение.
  11. В день сбора урожая возьмите в процессе работы пробу с активно растущей культуры. Используйте этот образец для тестирования на микоплазму, эндотоксин, репликационно-компетентный лентивирус (RCL), определение числа векторных копий (VCN), подсчет клеток, анализ размера клеток, проточную цитометрию и окрашивание по Граму.
  12. Инициировать программу окончательного сбора, которая запускает удаление питательной среды и промывание клеток буфером для окончательной рецептуры (стерильный изотонический кристаллоидный раствор с добавлением 4% сывороточного альбумина человека; см. таблицу материалов). После того, как сбор урожая завершен, целевой клеточный мешок будет содержать 100 мл клеточного продукта в буфере для окончательной рецептуры. Добавьте диметилсульфоксид (ДМСО) до концентрации 10% (v/v), аликвотируйте продукт в индивидуальные дозы и криоконсервируйте с помощью морозильной камеры с контролируемой скоростью.

2. День -1: Подготовка и предполетный контроль

  1. Убедитесь, что уровень газаCO2 и сжатого воздуха достаточен для создания давления на входе не менее 20 фунтов на квадратный дюйм в каждой линии.
  2. Включите процессор и убедитесь в отсутствии ошибок при запуске. При необходимости установите часы на правильное время. Выключите процессор.
  3. Убедитесь, что известно количество, объем и общее количество CD4+ и общее количество CD8+ исходного материала Т-клеток.
  4. Обеспечьте наличие достаточного количества вирусного вектора, реагентов и расходных материалов для всего производственного цикла.
  5. Поместите флакон с сывороткой AB человека в холодильник, чтобы он оттаял на ночь.

3. День 0: Установка комплекта трубок

  1. Приготовьте 3 л технологического буфера (0,5 % (по массе) сывороточного альбумина человека (HSA) в буфере фосфатно-солевого раствора / этилендиаминтетрауксусной кислоты (PBS/EDTA)).
  2. Приготовьте 2 л питательной среды (2 л среды с добавлением 100 мл сыворотки крови человека до конечной концентрации 5% и двух флаконов рекомбинантного человеческого IL2 по 25 мкг/флакон; см. таблицу материалов для получения дополнительной информации об этих реагентах). Переложите 10 мл питательной среды в пакет с реагентами объемом 20 мл и храните при температуре 4 ºC в течение ночи.
  3. Включите прибор и выберите процесс трансдукции Т-клеток (TCT) в интерфейсе сенсорного экрана. Нажмите кнопку «Выполнить », чтобы начать процесс TCT; Позвольте прибору провести пользователя через процедуру, используя инструкции и подсказки на экране.
  4. На экране Parameter Input (Ввод параметров ) введите инициалы оператора, номер партии комплекта трубок и срок годности при появлении соответствующего запроса.
  5. На экране «Настройка процесса» представлены четыре различных процесса. Выберите Полный процесс (1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие доступные процессы включают в себя начало с CD4+/CD8+ выбранных Т-клеток (см. раздел 5 ниже) и перезапуск ранее прерванного производственного цикла.
  6. При появлении запроса выберите два флакона селекционного реагента в соответствии с методом отбора CD4+/CD8+.
  7. Установите комплект трубок в соответствии с инструкциями на экране. Убедитесь, что все соединения Люэра герметичны и что в комплекте трубок нет дефектов.
  8. Следуйте инструкциям на экране, чтобы запустить автоматические проверки верхней и нижней целостности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверка целостности может завершиться неудачей из-за неисправного комплекта трубок, неправильно установленного комплекта трубок или дефекта перистальтического насоса машины. Мы настоятельно рекомендуем иметь под рукой по крайней мере один дополнительный комплект трубок для производственных циклов. Мы также рекомендуем, чтобы второй технолог проверил правильность установки комплекта трубок.
  9. Следуйте инструкциям на экране по присоединению среды и буферных мешков для обработки.
  10. Начните автоматическую заливку комплекта трубок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс TCT должен продолжаться в течение 3 часов после заливки. Убедитесь, что исходный материал Т-клеток готов.

4. Обогащение Т-клеток

  1. Когда появится экран Перенос клеточного продукта, начните размораживание криоконсервированного Т-клеточного продукта .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Допустимый объем Т-клеток, которые можно добавить в набор трубок, составляет от 50 до 280 мл. Максимальное количество клеток-мишеней (сумма CD4+ и CD8+) составляет 3 × 109, а максимальное количество TNC — 2 × 1010.
  2. Переложите размороженные клетки в трансферный пакет объемом 150 мл. Стерильно приварите пакет для переноса к пакету для нанесения комплекта трубок.
  3. Извлеките образец из пакета для нанесения с помощью пакета для контроля качества и выполните подсчет клеток.
  4. Подсоедините флаконы с реагентами CD4 и CD8.
  5. Запустите процесс отбора (обогащения Т-клетками).
  6. После обогащения извлеките образец отобранных CD4+/CD8+ клеток из пакета для контроля качества пакета для повторного нанесения для подсчета клеток, проточной цитометрии и анализа размера клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результат подсчета ячеек необходим для перехода к следующему шагу.

5. Альтернатива: Начиная с выбранных клеток CD4+/CD8+

  1. Подготовьте среду, как описано в шаге 3.2. Буфер обработки не требуется.
  2. Включите процессор и выберите Культивирование Т-клеток с установкой TS (3) на экране Process Setup . Следуйте инструкциям и подсказкам на экране.
  3. Следуя инструкциям на экране, заправьте набор трубок средой вместо буфера для обработки.
  4. Когда появится экран «Подготовка клеточного продукта культивирования-Подключение», начните размораживание выбранных CD4+/CD8+ Т-клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное количество Т-клеток (сумма CD4+ и CD8+ Т-клеток) для процесса составляет 1,0 × 108.
  5. Переложите клетки в пакет для переноса объемом 150 мл и разбавьте средой до конечного объема 50 мл.
  6. Стерильно приварите клеточную суспензию к мешку для повторного нанесения инструмента.
  7. Извлеките образец отобранных клеток CD4+/CD8+ из пакета для контроля качества пакета для повторного нанесения для анализа количества клеток и размера клеток.

6. Культурная настройка и программирование Матрицы активности

  1. Введите концентрацию клеток и желаемое начальное число (1-2 × 108 Т-клеток).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прибор автоматически перекачивает соответствующий объем из мешка для повторного нанесения в камеру для культивирования и регулирует конечный объем до 70 мл.
  2. Приложите флакон с активационным реагентом в соответствии с инструкциями на экране.
  3. Введите 5% для концентрации CO2 и 39 °C для температуры в камере культивирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Производитель рекомендует вводить 39 °C или значение, специально откалиброванное для прибора.
  4. Настройте матрицу действий. Используйте расширенный протокол кормления в качестве отправной точки и измените отдельные шаги в протоколе в соответствии с пользовательскими спецификациями (рис. 2).
    1. Убедитесь, что время активности трансдукции составляет 24 часа после посева (день 1).
    2. Убедитесь, что время бактериологической промывки составляет 48 ч после трансдукции (день 3).
    3. Установите время активации шейкера (шейкер типа 2) на 30 минут после начала промывки культуры.
    4. Удалите все действия по обмену средних мешков и мешков для мусора .
  5. Нажмите OK на экране, чтобы начать выращивание.
  6. Криоконсервируйте все оставшиеся выбранные клетки CD4+/CD8+ в пакете для нанесения для использования в будущем, если это необходимо.

7. День 1: Трансдукция Т-клеток

  1. Рассчитайте объем лентивирусного вектора для использования на основе желаемого MOI.
  2. Извлеките пакет с реагентами объемом 20 мл, содержащий 10 мл питательной среды, которая хранилась при температуре 4 ºC в течение ночи (шаг 3.2). Разморозьте флакон с вектором и перенесите объем, рассчитанный в 7.1, в пакет с реагентом объемом 20 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем заморозить любой оставшийся вектор для хранения или для исследований и разработок.
  3. Измените матрицу активности, чтобы установить время трансдукции на 2 минуты в будущем. При появлении запроса нажмите кнопку ОК , чтобы начать действие «Трансдукция».
  4. Стерильно приварите векторный пакет к набору трубок, следуя инструкциям на экране.
  5. Измените матрицу действий на основе фактического времени начала действия Трансдукция.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем начинать трансдукцию в течение 20-24 часов после посева, чтобы обеспечить выполнение практических действий в обычное рабочее время.
    1. Убедитесь, что время бактериологического промывки составляет 48 ч после трансдукции (день 3).
    2. Установите время активации шейкера (шейкер типа 2) на 30 минут после промывки культуры (день 3).
    3. Убедитесь, что время Media Exchange приходится на вторую половину дня (13:00) 6-го дня.

8. День 6: Первая проба в процессе производства

  1. Нажмите кнопку «Образец » и следуйте инструкциям на экране, чтобы получить образец контроля качества из активной культуры.
  2. Выполняйте подсчет клеток, анализ проточной цитометрии и размера клеток. Отправьте 1 мл образца для окрашивания по Граму.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет клеток следует повторять примерно через день для мониторинга роста культуры.
  3. Приготовьте еще 2 л питательной среды (см. шаг 3.2).
  4. Добавьте в матрицу заданий задание « Обмен средним мешком », которое должно начаться через 2 минуты в будущем. Настройте действие Media Exchange так, чтобы оно начиналось через 20 минут в будущем. Следуйте инструкциям на экране.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Media Exchange - это замена питательной среды в камере культивирования. Замена среднего мешка - это замена мешка с питательной средой, подвешенного на инструменте.

9. День сбора урожая (с 7 по 13 день): сбор урожая и криоконсервация

  1. Нажмите кнопку «Образец » и следуйте инструкциям на экране, чтобы получить образец контроля качества из активной культуры.
  2. Разделите образец контроля качества на три аликвоты по 1 мл каждый. Используйте 1 мл для анализа проточной цитометрии, подсчета и размера клеток. Используйте 1 мл для тестирования на микоплазму, количество копий вектора, лентивирус, компетентный к репликации, и эндотоксинов. Отправьте окончательный 1 мл для окрашивания по Граму.
  3. Готовят окончательный буфер (стерильный изотонический кристаллоидный раствор с добавлением 4 % HSA в пакете объемом 2 л, см. таблицу материалов). Сохраните 100 мл этого буфера для приготовления раствора криопротектора на более позднем этапе.
  4. Измените матрицу действий, чтобы установить время окончания культуры на 2 минуты в будущем и удалите все остальные оставшиеся действия. Следуйте инструкциям на экране, чтобы прикрепить окончательный буфер для состава к набору трубок и начать сбор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процессор автоматически перенесет ячейки в пакет целевых ячеек. Объем составит 100 мл.
  5. Возьмите образец объемом 0,5 мл из пакета Target cell bag QC и выполните подсчет клеток.
  6. Запечатайте пакет для ячеек Target и извлеките его из комплекта трубок. Разделите CAR-T-продукт на соответствующие дозы и криоконсервируйте их в морозильной камере с контролируемой скоростью. Хранят ячейки в паровой фазе резервуара для хранения жидкого азота при температуре ≤ -150 ºC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная формулировка и аликвотирование доз зависят от протокола. Здесь мы приводим пример, в котором три равные дозы CAR-T-клеток и флаконов QC криоконсервируются. За подробностями обратитесь к разделу 10.
  7. Загрузите технологические данные с прибора, снимите и утилизируйте комплект трубок и выполните отключение.

10. Криоконсервация CAR-T-клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предполагает, что CAR-T-клетки криоконсервируются после изготовления и хранятся до тех пор, пока пациент не будет готов к инфузии. Несмотря на то, что можно вводить свежеизготовленные CAR-T-клетки, это увеличивает логистическую нагрузку, поскольку требует координации производства CAR-T-клеток с инфузией CAR-T-клеток. Это может быть проблематично в случае производственного сбоя. В частности, если клинический протокол требует проведения лимфодеплетирующей химиотерапии перед инфузией CAR-T-клеток, мы настоятельно рекомендуем криоконсервацию, поскольку производственный сбой может подвергнуть пациента риску ненужной химиотерапии. Регулирующие органы могут потребовать от исследователей продемонстрировать, что продукт проходит все испытания на высвобождение перед инфузией, чего может быть трудно достичь без криоконсервации.

  1. Из конечных 100 мл собранного продукта определите и удалите объем, необходимый для соблюдения требуемых доз CAR-T, и флаконы контроля качества (QC) для проведения дополнительных испытаний на высвобождение (например, на жизнеспособность), удержание и стерильность образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно разработать полностью определенную стратегию аликвотирования конечного продукта. Мы предлагаем производить несколько доз препарата, чтобы обеспечить возможность повторных вливаний, при условии наличия достаточного количества материала. Объем продукта 10-20 мл в пакете обеспечивает быстрое размораживание и легкую инфузию путем нажатия шприца. Рекомендуется заполнять каждый продукт до желаемой дозы CAR-T-клеток (например, 5 × 106 CAR-T-клеток на кг или 2,5 × 108 CAR-T-клеток), так как это позволит избежать необходимости расчета дозы в день инфузии. Также рекомендуется криоконсервировать не менее четырех флаконов для контроля качества и учитывать возможность того, что в них могут быть остатки материала; Мы рекомендуем сохранить этот материал, так как он может быть полезен для научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ.
  2. Центрифугируйте ячейки, чтобы уменьшить объем.
  3. Доведите продукт (продукты) до половины желаемого конечного объема, используя часть буфера для окончательной рецептуры, отложенную на шаге 9.3.
  4. Приготовьте 2 криопротектора, создав 20% раствор ДМСО в буфере для окончательной рецептуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав криопротектора и концентрация ДМСО могут быть изменены.
  5. Добавьте 2 криопротектора в клетки в равном объеме для получения конечной концентрации ДМСО 10%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность воздействия криопротектора должна быть сведена к минимуму.
  6. Наполните пакеты с дозами и флаконы с контролем качества. Отправьте 1 мл для стерильности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Регулирующие органы обычно требуют проведения 14-дневного анализа на стерильность конечного продукта. Тем не менее, появляются быстрые тесты на стерильность; В настоящее время наиболее распространен компендиальный 14-дневный метод.
  7. Криоконсервируйте продукты с помощью морозильной камеры с регулируемой скоростью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программа замораживания с регулируемой скоростью должна быть проверена на скорость охлаждения от ~ -1 ºC/мин до ~ -45 ºC с компенсацией точки эвтектики.
  8. Храните продукт в паровой фазе в морозильной камере со сверхнизкой температурой жидкого азота при температуре ≤ -150 °C.

11. Экспертиза выполнения процедуры

ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего процесса TCT из активной культуры отбирается несколько образцов контроля качества. В таблице 2 представлена сетка, которая может помочь читателю упорядочить результаты для справки и рассчитать метрики производительности процедуры. Приведенные ниже термины, состоящие из буквы и цифры (например, «B4»), относятся к ячейкам в сетке этой таблицы. При расчете производительности используются следующие значения: B3 = предварительное обогащение общих ядросодержащих клеток (TNC); B4 = ТНК после обогащения; E2 = сумма CD4+ и CD8+ Т-клеток в процентах от общего количества клеток исходного продукта афереза; E4 = сумма CD4+ и CD8+ Т-клеток в процентах от общего количества клеток после обогащения; G2 = CD19+ клетки в процентах от общего количества клеток исходного продукта; G4 = CD19+ клетки в процентах от общего количества клеток после обогащения CD4+/CD8+; B10 = ТНК активной культуры в день сбора урожая.

figure-protocol-1
Таблица 2: Сетка выполнения процедуры. Мы предоставляем эту сетку, чтобы помочь организовать результаты тестирования в процессе, необходимые для расчета статистики производительности процедуры. Строки представляют собой выборки, проанализированные в различные моменты времени во время процедуры, и помечены номерами от 1 до 11. Ряды 6-9 можно использовать для сбора результатов проб, взятых после 6-го дня культивации, но до дня сбора урожая. Столбцы обозначают измеряемые параметры и обозначаются буквами A-H. Поля, затененные серым цветом, не применяются. Некоторые дополнительные поля могут не применяться в зависимости от того, выполняется ли обогащение CD4+/CD8+ в рамках процедуры, а также от продолжительности культивирования. Мы рекомендуем написать «Н/Д» в этих полях. Сокращения: TNC = общее количество ядросодержащих клеток; QC = контроль качества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

  1. Рассчитайте восстановление CD4+/CD8+ клеток после отбора, разделив общее количество CD4+ плюс CD8+ Т-клеток после обогащения на общее количество CD4+ плюс CD8+ Т-клеток до обогащения, используя уравнение (1).
    Восстановление CD4+/CD8+ Т-клеток = figure-protocol-2 (1)
  2. Рассчитайте истощение CD19+ клеток после обогащения, разделив общее количество CD19+ клеток после обогащения CD4+/CD8+ на общее количество CD19+ клеток до обогащения. Поскольку ожидается, что это число будет очень малым, сообщите логарифм этой дроби, как показано в уравнении (2):
    Логарифмическое истощение клеток CD19 = log10figure-protocol-3 (2)
  3. Рассчитайте общий рост в разрез, разделив общее количество клеток в активной культуре при сборе урожая на количество клеток, засеянных по уравнению (3):
    Общий рост сгиба = figure-protocol-4 (3)
  4. Рассчитайте среднесуточный прирост, взяв корень из общего прироста по отношению ко дню сбора урожая, используя уравнение (4):
    Среднесуточный прирост = день сбора урожая √ (общий прирост) (4)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Результаты первых трех серий производства CAR-T в рамках исследования NCT05480449 представлены ниже в таблице 3. Исходный материал, вектор, культуральные цитокины и концентрации АТ в сыворотке крови поддерживались постоянными для каждого запуска. Продукты собирали на 7 или 8 день. Среднесуточный прирост клеток составил 46% (увеличение общего количества клеток), что указывает на то, что процесс TCT был эффективным в стимулировании роста клеток. Эти результаты свидетельствуют о том, что процессор может про...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

CAR-T-клеточная терапия стала перспективным подходом к лечению В-клеточных и других злокачественных новообразований. Однако традиционные методы производства CAR-T-клеток имеют ряд ограничений, таких как высокая стоимость, трудоемкое производство и открытые этапы, которые увеличивают риск загрязнения. В последнее время появилось несколько полуавтоматических платформ, в том числе Miltenyi CliniMACS Prodigy («процессор»), чтобы устранить эти ограничения. Процесс трансдукции Т-клеток (ТСТ), интегрированный в процессор, описа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

S.K., S.G. и Y.W. получили исследовательскую поддержку от Miltenyi Biotec.

Благодарности

Авторы выражают признательность нескольким лицам и организациям за вклад в эту работу. Лаборатория клеточной и генной терапии и Лаборатория трансляционных и коррелятивных исследований Пенсильванского университета оказали ценную помощь в разработке процессов и подготовке к подаче заявок на IND. Мелисса Варгезе (Melissa Varghese) и Аманда ДиНофиа (Amanda DiNofia) внесли свой вклад в разработку процесса и подготовку к подаче заявок на IND, которые легли в основу этой рукописи. Эта работа была поддержана грантом Acceleration Grant of the Cell and Gene Therapy Collaborative of the Children's Hospital of Philadelphia. Авторы также хотели бы поблагодарить компанию Miltenyi Biotec за техническую и исследовательскую поддержку. На рисунок 1 распространяется авторское право © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG; Все права защищены.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12 x 75 боросиликатных пробирокCharles RiverTL1000
20 мл Набор для реагентовMiltenyi Biotec170-076-631
50 мл Коническая трубкаFisher05-539-10
150 мл Набор для переносаFenwal4R2001
2 000 мл Набор для переносаFenwal4R2041
7AADFisher Scientific
АлкогольПодготовка Tyco/
Bag AccessMedline2300E-0500
CD19 APC-Vio770 REAfinityMiltenyi Biotec130-113-643
CD19 Реагент для обнаружения CAR BiotinMiltenyi Biotec130-129-550
CD19 PEBD555413
CD3 APCBD340440
CD4 VioBright FITC REAfinityMiltenyi Biotec130-113-229
CD45 VioBlue REAfinityMiltenyi Biotec130-110-637
CD8 APC-Vio770 REAfinityMiltenyi Biotec130-110-681
Эталонные бусины для целлографа 10 мкмNexcelomB10-02-020
Эталонные бусины для целлографа 15 мкмNexcelomB15-02-010
бусины для целлографа 5 мкмNexcelomB05-02-050
Предметные стекла для целолютораNexcelomCHT4-SD100-002
CliniMACS CD4 GMP МикрогранулыMiltenyi Biotec276-01Реактив CD4
CliniMACS CD8 GMP МикрогранулыMiltenyi Biotec275-01Реактив CD8
CliniMACS PBS/EDTA БуферMiltenyi Biotec130-021-201Буфер
DMSOOrigenCP-10
Пакет для заморозки 50 млMiltenyi Biotec200-074-400
Флакон для заморозки, 1,8 млNunc12565171N
Флакон для заморозки, 4,5 млNunc12565161N
Сыворотка AB человекаValley BiomedicalSterile фильтрованный, тепло инактивированный
Сывороточный альбумин человека 25%Грифолс68516-5216-1
Сывороточный альбумин человека 5%Грифолс68516-5214-1
MACS GMP Рекомбинантный человеческий IL-2Miltenyi Biotec170-076-148Цитокины
MACS GMP T Cell TransActMiltenyi Biotec200-076-202Активационный реагент
MycoSeq Mycoplasma Набор для обнаруженияLife Technologies4460623
иглы, иглы для подкожных инъекций 14GMedSWD200573
, иглы SlideSafe 18GBDB-D305918
Pipet, 2-200 μ L,Eppendorf022492209
, 50-1000 μ L, в индивидуальной упаковкеEppendorf022492225
Пипетки 10 млFisher13-678-27F
Пипетки 25 млFisher13-675-30
Пипетки 5 млFisher13-678-27E
Плазмалит-АBaxter2B2544XЭлектролитный раствор
Prodigy TS520 Набор трубокMiltenyi Biotec170-076- 600Набор трубок
Sterile FieldMedlineNON21001
стрептавидина PE-Vio770Miltenyi Biotec130-106-793
Шприц 1 млBD309628
Шприц 10 млBD302995
Шприц 30 млBD302832
Шприц 50 млBD309653
TexMACS GMP MediumMiltenyi Biotec170-076-306
Средний адаптер для тройного отбора пробMiltenyi Biotec170-076-609
Вирусный векторCHOP Clinical Vector CorehuCART19
Equipment
Biological Safety ШкафThe Baker Co
Cellometer Auto 2000nexcelom
CliniMACS ProdigyMiltenyi Biotec200-075-301Процессор
Регулируемая скорость морозильной камерыPlaner/Kryosave
Endosafe nexgen-PTS150KCharles River
Mettler BalanceMettler
Охлаждаемая центрифугаThermo Fisher
Охлаждаемая центрифугаFisher Sci
SCD Стерильная трубка Сварочный аппаратTerumo
Sebra Герметик трубокSebra
VarithermBarkeyУстройство для сухой размораживания
XN-330 Гематологический анализаторSysmex
BDB559925Healthcare Эталонные line наконечники Pipet в индивидуальной упаковке Шприц 3 мл BD 309657

Ссылки

  1. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  2. Shah, N. N., et al. Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial. Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).
  3. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  4. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  5. Maude, S. L., et al. Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia. Blood. 128 (22), 217(2016).
  6. Mock, U., et al. Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy. Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).
  7. Fernández, L., et al. GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy. Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361(2019).
  8. Zhu, F., et al. Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center. Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).
  9. Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system. Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).
  10. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  11. Miltenyi Biotec. CliniMACS Prodigy User Manual. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_h0fd9i4al17q32uhfuf4h7lu25?content-disposition=inline (2021).
  12. Ghassemi, S., et al. Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells. Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).
  13. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/113760/download (2020).
  14. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry. , https://www.fda.gov/media/156896/download (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CAR TTCD4 CD8
Производство Т-клеток химерного антигенного рецептора на автоматизированном клеточном процессоре
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.