Методическая статья

Криоконсервация пигментных эпителиальных клеток сетчатки, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, на оптимальном этапе

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65888

⸱

3 ноября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2National Clinical Research Center for Eye Diseases, 3Shanghai Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Clinical Specialty, 5Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases, 6Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine, 7Shanghai Engineering Center for Precise Diagnosis and Treatment of Eye Diseases, 8Stem Cell Core Facility, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании представлен подробный протокол для эффективного криоконсервирования пигментных эпителиальных клеток сетчатки человека, полученных из стволовых клеток сетчатки.

Аннотация

Клетки пигментного эпителия сетчатки (РПЭ), полученные из эмбриональных стволовых клеток человека (чэск), являются превосходными источниками клеток для клеточной заместительной терапии у лиц с дегенеративными заболеваниями сетчатки; Тем не менее, исследования по стабильному и безопасному хранению этих терапевтических клеток немногочисленны. Наиболее часто встречающимися проблемами являются сильно изменчивая жизнеспособность клеток и функциональное восстановление клеток РПЭ после криоконсервации. В настоящем протоколе мы стремились достичь наилучшей скорости восстановления клеток после размораживания путем выбора оптимальной фазы клеток для замораживания на основе исходных экспериментальных условий. Клетки замораживали в экспоненциальной фазе, определяемой с помощью анализа мечения 5-этинил-2'-дезоксиуридина, что улучшало жизнеспособность клеток и скорость восстановления после размораживания. Стабильные и функциональные клетки были получены вскоре после размораживания, независимо от длительного процесса дифференцировки. Описанные здесь методы позволяют просто, эффективно и недорого сохранять и размораживать клетки RPE, полученные из hESC. Хотя этот протокол фокусируется на клетках RPE, эта стратегия замораживания может быть применена ко многим другим типам дифференцированных клеток.

Введение

Пигментный эпителий сетчатки (РПЭ) представляет собой пигментированный монослой клеток, необходимый для поддержания правильной функции сетчатки1. Дисфункция и смерть от РПЭ тесно связаны со многими дегенеративными заболеваниями сетчатки, включая возрастную макулярную дегенерацию, пигментный ретинит и болезнь Штаргардта 2,3. Заместительная терапия РПЭ является одной из наиболее перспективных схем лечения этих заболеваний 4,5,6,7. Стабильное поступление донорских клеток RPE имеет жизненно важное значение для клеточной терапии. Клетки RPE, полученные из человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESC), являются идеальным источником клеток для клеточной терапии, поскольку они имитируют функцию первичных клеток RPE и могут производить теоретически неограниченное количество8. Однако процесс дифференцировки является трудоемким, а срок годности полученных клеток RPE относительно короток из-за последующего эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). Таким образом, криоконсервация клеток RPE, полученных из hESC, является необходимым этапом, необходимым для долгосрочного хранения и распространения по требованию9.

Повреждение клеток, вызванное криоконсервацией, может непреднамеренно поставить под угрозу терапевтическую эффективность10,11. Поэтому недавние исследования по криоконсервации показали, что при разработке клеточной терапии следует определять оптимальные условия криогенногохранения. Успешная криоконсервация гарантирует эффективное восстановление клеток, высокую жизнеспособность и восстановление их функций после цикла замораживания-размораживания. Тем не менее, предыдущие исследования по криоконсервации адгезивных монослоев клеток млекопитающих сообщали о сильно вариабельной (35%-95%) выживаемости после размораживания 13,14,15. Многие факторы существенно влияют на результаты криоконсервации, особенно на стадии замораживания 16,17. Недавние исследования показали, что клетки RPE, замороженные в разные моменты времени, демонстрировали различное восстановление после размораживания17. Насколько нам известно, исследования по определению оптимального временного окна замораживания для клеток RPE, полученных из стволовых клеток, отсутствуют. В различных исследованиях клетки замораживались на разных стадиях: некоторые клетки замораживались вскоре после пассации или до слияния или пигментации 8,15,18, в то время как другие были заморожены в другие временные точки 9,19,20,21. Кроме того, нет четких доказательств того, влияет ли фаза или стадия клеток RPE, используемых для криоконсервации, на функцию RPE после размораживания. В нашем предыдущем исследовании мы впервые продемонстрировали, что экспоненциальная фаза роста клеток (P2D5) является наилучшей стадией для криоконсервации клеток RPE, полученных из hESC, с точки зрения жизнеспособности клеток и восстановления клеточных свойстви функций.

Разработанный здесь метод направлен на криоконсервирование РПЭ, полученного из hESC, на оптимальной стадии для достижения наилучшего сохранения с точки зрения жизнеспособности и функции клеток после размораживания. Используя анализ мечения 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) для определения экспоненциальной фазы синтеза ДНК до криоконсервации, размороженные клетки RPE продемонстрировали жизнеспособность и скорость прикрепления >80%, экспрессию генов, специфичных для RPE, морфологию поляризованных клеток, секрецию фактора, полученного из пигментного эпителия, соответствующую трансэпителиальную резистентность и фагоцитарную способность 8,17,22. Несмотря на то, что этот протокол ориентирован на клетки, полученные из hESC-RPE, и не все терапевтические клетки одинаково криоконсервированы, стратегия замораживания в экспоненциальной фазе может быть применена ко многим другим терапевтическим клеткам.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Диссоциация клеток

  1. Поддерживайте клетки РПЭ, как описано ранее17,22.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все клетки выращиваются при температуре 37 °C в атмосфере с содержаниемCO2 5% в течение всего срока действия протоколов.
  2. Приготовьте необходимое количество PBS и питательной среды на водяной бане при температуре 37°С и поместите реагент для диссоциации клеток при комнатной температуре.
  3. Сбросить питательный раствор и дважды промыть пластины 1 мл предварительно подогретого PBS на лунку.
  4. Добавьте 1 мл реагента для диссоциации клеток в 6-луночные планшеты и дисконтируйте клетки при 37 °C в течение 15 минут. После инкубации понаблюдайте под микроскопом за клетками, которые сжимаются и блестят по краям, чтобы подтвердить прекращение пищеварения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциация на основе трипсина не рекомендуется, так как она дает низкую жизнеспособность клеток.
  5. Осторожно проводите пипеткой вверх и вниз 10 раз с помощью пипетки объемом 1 мл, чтобы диссоциировать клетки, и разбавьте клеточную суспензию предварительно подогретой питательной средой (без Y-27632) в соотношении 1:10. Затем центрифугируйте ячейки при комнатной температуре в течение 3 минут при 250 × г.
  6. Быстро вылейте надосадочную жидкость после центрифугирования, аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу в 2 мл питательной среды, и повторно суспендируйте клетки 10-15 раз с помощью пипетки.
  7. Отфильтруйте клеточную суспензию с помощью клеточного фильтра 40 мкм, чтобы получить одноклеточную суспензию, и рассчитайте количество клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Суспензия с одной клеткой необходима для точного подсчета клеток и равномерной плотности посева клеток после размораживания.

2. Определение оптимальной клеточной стадии для криоконсервации

Примечание: Поскольку состояние клеток варьируется в зависимости от методов дифференцировки и клеточных линий, экспоненциальная фаза клеток RPE, культивируемых в разных лабораториях, должна быть определена перед замораживанием.

  1. Разморозьте один флакон раствора базальной мембраны на льду при температуре 4 °C в течение ночи. Разведите матрицу в 12 мл холодного DMEM/F-12 и хорошо перемешайте. Добавьте по одному покровному стеклу на лунку и покройте каждую лунку 24-луночного планшета 0,25 мл разбавленного раствора. Перед использованием планшет инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C и отсасывают раствор покрытия непосредственно перед нанесением покрытия на клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по объему аликвоты зависят от конкретной партии в зависимости от концентрации белка и находятся в листе спецификации продукта.
  2. Высевают одиночные клетки RPE с шага 1.7 на базальную мембрану, покрытую матрицей, покровными стеклами с плотностью 105/см2 в 1 мл питательной среды. Обновляйте питательную среду каждые 2-3 дня.
  3. В указанные моменты времени (1, 3, 5, 7 и 11 дней после пассажа) инкубируйте клетки RPE с 10 мкМ EdU в среде в течение 24 ч. Фиксируйте, проникайте и окрашивайте клетки с помощью реакционного коктейля, как описано в руководстве, чтобы обнаружить инкорпорированный EdU.
  4. Захватите изображения из пяти случайных полей под флуоресцентным микроскопом и рассчитайте процент EdU-положительных клеток. Постройте соответствующие кривые пропорционально-временного отношения EdU, чтобы построить кривую роста. Затем определите окно замораживания или экспоненциальную фазу для каждой клеточной линии в соответствии с кривой роста.
    Примечание: Восстановленная гексагональная морфология клеток указывает на то, что клетки выходят из экспоненциальной фазы.

3. Криоконсервация

  1. Следуя шагам с 1.1 по 1.7, за исключением того, что время разложения уменьшается до 5 минут, центрифугируйте клеточную суспензию при комнатной температуре в течение 3 минут при 250 × г.
  2. После центрифугирования надосадочную жидкость быстро вылить и аккуратно ресуспендировать клеточную гранулу в криоконсервирующей среде до плотности 2 × 106 клеток/мл и переложить 1 мл клеточной суспензии в криогенные флаконы объемом 1,2 мл.
  3. Немедленно поместите криогенные флаконы в контейнер для заморозки, заморозьте при температуре −80 °C на ночь, чтобы достичь скорости охлаждения −1 °C/мин, а затем переложите флаконы в жидкий азот для длительного хранения.

4. Размораживание

  1. Нагрейте питательную среду на водяной бане при температуре 37 °C и предварительно заполните 10 мл предварительно подогретой питательной среды в пробирку объемом 15 мл.
  2. Быстро размораживайте криогенные флаконы, взятые непосредственно из хранилища жидкого азота, с помощью автоматизированной системы размораживания.
  3. Капните 0,5-1 мл предварительно подогретой питательной среды в криогенный флакон, чтобы убедиться, что замороженные клетки постепенно адаптируются к новой среде. Затем переведите 1,5-2 мл клеточной суспензии на 10 мл питательной среды в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте клетки при 250 × г в течение 3 минут при комнатной температуре.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость путем быстрой заливки после центрифугирования, повторно суспендируйте гранулу в 2 мл предварительно подогретой питательной среды и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра для определения показателей восстановления и выживаемости с использованием стандартного исключения трипанового синего (0,4% трипанового синего красителя).
  5. Культивирование клеток на поверхностях, покрытых базальной мембраной, при плотности 105 жизнеспособных клеток/см2 в культуральной среде с добавлением Y-27632 (конечная концентрация: 10 мкМ). Снимите Y-27632 через 24 часа.
  6. Чтобы определить скорость прикрепления, снова диссоциируйте клетки и подсчитайте количество клеток через 24 ч после размораживания.

5. Валидация оптимальной фазы замораживания

  1. Чтобы проверить оптимальную фазу замораживания, определенную на шаге 2.4, разморозьте клетки РПЭ, замороженные в разные моменты времени и культивирующие в течение 28 дней. Забор клеток для количественной ПЦР и иммуноокрашивающего анализа для оценки экспрессии маркеров РПЭ, как описано ранее17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь клетки РПЭ, полученные из hESC, в P1D35 были пассированы и засеяны с плотностью 105/см2. В течение недели после посева характерная гексагональная морфология и пигментация были утрачены во время фазы задержки (примерно 2 дня). Клетки РПЭ постепенно переняли гексагональную морфологию в экспоненциальной фазе (примерно 5 дней, рис. 1А) и вступили в фазу замедления (примерно 6 дней) с более полигональной морфологией. Если культивирование клеток продолжалось еще неделю,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящем исследовании описан успешный протокол замораживания-размораживания для клеток RPE, полученных из hESC, для исследовательских и клинических нужд. В отличие от иммортализированной клеточной линии РПЭ, ARPE-19, клетки РПЭ с соответствующими характеристиками эпителиального фенотипа и функцией, как и клетки, производные от стволовых клеток, более чувствительны к криоконсервации. Менее 32% клеток осталось через 24 ч после оттаивания, если они не сохранились должным образом17. Сроки криоконсе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Национальным фондом естественных наук Китая (81970816) Мэй Цзян; Национальный фонд естественных наук Китая (82201223) Синьюэ Чжу; и План действий по инновациям в области науки и техники Шанхайской комиссии по науке и технике (2014090067000) Хайюнь Лю.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
40 μ m Клеточный фильтрCorning431750
Click-iT EdU Набор для пролиферации клеток для визуализации, Alexa Fluor 488 КрасительThermo Fisher ScientificC10337
Контейнер для криозаморозкиNalgene5100-0001
CryoStor CS10Biolife Solutions07930криоконсервирующая среда #1
DPBS, без кальция, без магнияThermo Fisher Scientific
Среда для криоконсервацииGenxinSelcellYB050050
Эмбриональные стволовые клетки человека, предоставленные Wicell, СШАклеточной линией
H9 Matrigel, матрицей Corning354277базальной мембраной
ThawSTAR CFT2 Автоматизированная система размораживания клетокBioLife SolutionsAST-601
Trypan Синий раствор 0,4%SigmaT8154
TryPLE SelectThermo Fisher Scientific12563029реактив для диссоциации клеток
среда XVIVO-10 LonzaBEBP04-743QRPE питательная среда
Y-27632SelleckS1049
14190144 #2, сертифицированной hESC,

Ссылки

  1. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846(2020).
  2. Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt disease. American Journal of Ophthamology. 154 (1), 146-154 (2012).
  3. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969(2021).
  4. Rizzolo, L. J., Nasonkin, I. O., Adelman, R. A. Retinal cell transplantation, biomaterials, and in vitro models for developing next-generation therapies of age-related macular degeneration. Stem Cells Translational Medicine. 11 (3), 269-281 (2022).
  5. Bertolotti, E., Neri, A., Camparini, M., Macaluso, C., Marigo, V. Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 130-144 (2014).
  6. Da Cruz,, L,, et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  7. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  8. Buchholz, D. E., et al. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 2 (5), 384-393 (2013).
  9. Li, Q. -Y., et al. Functional assessment of cryopreserved clinical grade hESC-RPE cells as a qualified cell source for stem cell therapy of retinal degenerative diseases. Experimental Eye Research. 202, 108305(2021).
  10. Francois, M., et al. Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-gamma licensing. Cytotherapy. 14 (2), 147-152 (2012).
  11. Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties. Stem Cells. 32 (9), 2430-2442 (2014).
  12. Ekpo, M. D., et al. Incorporating cryopreservation evaluations into the design of cell-based drug delivery systems: an opinion paper. Frontiers in Immunology. 13, 967731(2022).
  13. Bailey, T. L., et al. Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells. Cryobiology. 71 (3), 472-480 (2015).
  14. Okumura, N., et al. Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells. PLoS One. 14 (6), e0218431(2019).
  15. Pennington, B. O., et al. Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo. Scientific Reports. 11 (1), 6286(2021).
  16. Woods, E. J., Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D., Mathew, A. J. Off the shelf cellular therapeutics: Factors to consider during cryopreservation and storage of human cells for clinical use. Cytotherapy. 18 (6), 697-711 (2016).
  17. Zhang, T., et al. Determining the optimal stage for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 454(2022).
  18. Leach, L. L., et al. Induced pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium: a comparative study between cell lines and differentiation Methods. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 317-330 (2016).
  19. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in Xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  20. Brandl, C., et al. In-depth characterisation of retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC). Neuromolecular Medicine. 16 (3), 551-564 (2014).
  21. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 291(2017).
  22. Foltz, L. P., Clegg, D. O. Rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), 10.3791/56274(2017).
  23. Marcantonini, G., et al. Natural cryoprotective and cytoprotective agents in cryopreservation: a focus on melatonin. Molecules. 27 (10), 3254(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

EdU

Похожие статьи