Получение и характеристика органоидов колоректального рака из клеточной линии SW1222 в ультракороткой самоорганизующейся пептидной матрице

В последние годы самоорганизующиеся пептиды (САП) стали перспективными биоматериалами для применения в тканевой инженерии. САП обладают уникальными свойствами, включая спонтанное образование нановолокон, биосовместимость, биоразлагаемость и неиммуногенность, что делает их привлекательными кандидатами^{для разработки} скаффолда. САП ранее использовались вместе с различными типами клеток, и, в частности, сообщалось, что ультракороткие САП способствовали инкапсуляции стволовых клеток, сохраняя их плюрипотентность в течение длительных периодов, охватывающих более 30 пассажей, и с минимальной частотой хромосомных аберраций ^2,3,4. Следовательно, адаптация САП для их использования в органоидных культурах представляла собой рациональный последующий шаг.

Органоиды представляют собой сложные трехмерные структуры, которые возникают из одиночных плюрипотентных клеток. Эти структуры дают начало различным типам клеток, которые затем самоорганизуются, чтобы воспроизвести процессы развития эмбрионального и тканевого роста in vitro⁵. Эта инновационная структура превратилась в мощный инструмент для исследований in vitro, эффективно сохраняющий генетические, фенотипические и поведенческие характеристики, характерные для органов in vivo ⁶. Тем не менее, основным препятствием при переходе от стенда к постели больного при переходе от работы на основе органоидов к постели больного является потребность в воспроизводимости7^. Эти различия в результатах в первую очередь объясняются сложностью полной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека в специализированные клеточные линии, что усугубляется отсутствием аутентичной архитектуры тканей и сложностью, присущей органоидным моделям. Учитывая рост популярности исследований на основе стволовых клеток и органоидов⁸, наблюдается повышенный спрос на биоматериалы с динамическими механическими свойствами и интегрин-подобными сайтами адгезии или скаффолды с контролируемой разлагаемостью ^7,9. Эти атрибуты могут быть эффективно настроены за счет стратегического использования биофункционализированных SAP.

САП представляют собой короткие последовательности аминокислот с присущей им способностью спонтанно организовываться в четко^{определенные структуры.} Эти пептиды часто содержат чередующиеся гидрофобные и гидрофильные остатки, которые стимулируют их самосборку посредством нековалентных взаимодействий, включая водородные связи, электростатические взаимодействия и гидрофобные эффекты ^11,12. Процесс самосборки этих пептидов в первую очередь обусловлен необходимостью минимизации свободной энергии системы. При нахождении в водной среде гидрофобные остатки имеют тенденцию группироваться вместе, чтобы свести к минимуму воздействие воды, в то время как гидрофильные остатки взаимодействуют с окружающими молекулами воды. Это явление приводит к образованию различных наноструктур. При этом ультракороткие самоорганизующиеся пептиды образуют нановолокна с характеристиками, которые зависят от пептидной последовательности и условий окружающей среды 2,12,13,14,15,16. Эти пептиды имеют β-витковую конформацию, при которой отдельные пептидные нити выстраиваются параллельно или антипараллельно друг другу, стабилизируясь водородными связями (рис. 1). Присутствие положительных ионов ускоряет процессы самосборки, которые приводят к образованию нановолокон.

Было установлено, что пептидные нановолокна обладают врожденной способностью захватывать значительные объемы воды. Эта характеристика способствует образованию гидрогеля, который впоследствии проявляется как биосовместимое и биоразлагаемое трехмерное пространство, способствующее пролиферации и росту клеток. Эти самоорганизующиеся пептидные нановолокна искусно имитируют топографические особенности, присущие окружающей среде естественного внеклеточного матрикса (ВКМ)¹. Это сходство наделяет клетки средой, которая имитирует их физиологическую среду обитания, способствуя дальнейшей^{оптимальной клеточной} активности. Кроме того, универсальность, присущая этим пептидам, обеспечивает значительную степень перестраиваемости4. Такая адаптивность позволяет изменять свойства матрицы, такие как жесткость, кинетика гелеобразования и пористость. Эти адаптации достигаются за счет модификаций пептидной последовательности. Следовательно, самоорганизующиеся пептиды (САП) стали ключевыми компонентами в современной биоматериаловедении и широко используются в качестве каркасов для регенерации тканей и клеточной культуры^13,17.

Одним из важнейших преимуществ самоорганизующихся пептидов является их способность легко синтезироваться и модифицироваться на молекулярном уровне. Это преимущество позволяет встраивать определенные функциональные группы или биоактивные мотивы в пептидную последовательность, что позволяет создавать пептиды с индивидуальными свойствами и функциональными возможностями 18,19,20 (рисунок 1B). Например, биофункционализированные САП могут быть сконструированы таким образом, чтобы имитировать ВКМ и способствовать дифференцировке с использованием пептида RGD^19,21. Также сообщалось, что пептид Ben-IKVAV значительно увеличивает экспрессию нейрон-специфических маркеров из-за его лиганд-специфичной подвижности²². Эти пептиды также могут быть сконструированы для отображения биоактивных молекул, таких как интегрин-связывающие пептиды, для^{повышения выживаемости} клеток. Наконец, были разработаны другие биофункционализированные САП для содействия ангиогенезу путем включения мотивов IKVAV и YIGSR в их структуры^.

Биофункционализированные SAP, о которых сообщалось в более ранней публикации, показывают, что самосборка может быть дополнительно модифицирована путем включения наивного пептида, из которого^{был получен} биофункционализированный SAP. Эти смеси SAP также могут содержать широкий спектр составов SAP, которые различаются по своей биохимической активности и физико-химическим свойствам. Например, амфифильный пептид IIFK представляет собой ультракороткий SAP, который может выдерживать биофункционализацию с различными мотивами, примером чего является включение мотива IKVAV (рис. 1B). Оба пептида могут образовывать нановолокна, как по отдельности, так и в совокупности. В результате каждой формулы получаются гидрогели с различными физическими свойствами (Рисунок 2)

Тем не менее, из-за обширного спектра потенциальных перестановок и альтернатив, полученных в результате биофункционализации SAP, существует необходимость в обеспечении быстрого и экономически эффективного варианта тестирования органоидов. Одним из кандидатов на такую интенсивную и экономически эффективную оценку органоидов является клеточная линия SW1222, полученная из колоректальной аденокарциномы человека^26,27. Клетки SW1222 обладают характеристиками, которые позволяют их агрегировать в 3D-структуры, напоминающие органоиды, что делает их идеальной моделью для изучения развития тканей и применения регенеративной медицины. Было установлено, что клетки SW1222 способны генерировать органоиды благодаря присущей им сверхэкспрессии гена LGR5 ²⁷. Создание органоидов из отдельных стволовых клеток LGR5⁺ было убедительно продемонстрировано ранее, как и склонность клеток SW1222 к достижению морфологических характеристик органоида колоректального^рака28.

В данной статье мы представляем подробные протоколы оценки и характеристики влияния различных биофункциональных пептидов на клеточную адгезию и формирование просвета с использованием клеток SW1222 (рис. 3). Предоставляя пошаговые процедуры и методы анализа изображений, мы надеемся предложить ценную информацию о биопроизводстве органоидов и оценке упрощенных матриц SAP для культивирования органоидов.

1. Приготовление буфера и раствора

ПРИМЕЧАНИЕ: Все указанные концентрации являются конечными концентрациями.

1. Добавьте фетальную бычью сыворотку (FBS) и пенициллин-стрептомицин в конечной концентрации 10% и 1% соответственно, чтобы получить полную модифицированную среду Dulbecco's Medium (IMDM) от Iscove. Хранить в темноте при температуре 4 °C до 1 месяца.
2. Смешайте MgCl₂ (3 мМ), сахарозу (300 мМ) и Triton X-100 (0,5%) в фосфатном буфере (PBS) для приготовления буфера для пермеабилизации. Храните этот раствор при температуре 4 °C до 2 месяцев.
3. Объедините бычий сывороточный альбумин (БСА, 1%), глицин (0,3 М) и твин-20 (0,1%) в PBS для получения блокирующего буфера. Храните этот раствор при температуре 4 °C до 2 месяцев.
4. Разбавьте от 10x до 2x PBS сверхчистой водой в стерильных условиях. Хранить такой раствор при комнатной температуре более 6 месяцев.
5. Стерилизуйте 3 мг пептидного порошка под ультрафиолетовым светом в течение 30 минут. Добавьте 500 мкл сверхчистой воды для растворения с помощью вихревого смесителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация должна быть в два раза больше целевой концентрации, т.е. 6 мг/мл, так как концентрация 1x будет составлять 3 мг/мл.

2. Производство органоидов колоректального рака из пептида SW1222

1. Разморозьте аликвоту на ночь при температуре 4 °C и держите ее во льду до тех пор, пока не потребуется подготовить управление матрицей фундамента.
2. Поместите каплю 2x пептидного раствора объемом 10 мкл в центр каждой лунки в 24-луночный планшет. Дайте тарелке поинкубироваться при комнатной температуре в течение 10 минут. В качестве альтернативы можно поместить 8-10 капель на лунку в 6-луночный планшет.
   Примечание: Образцы, предназначенные для использования в конфокальной и электронной микроскопии, более доступны для манипуляций, если их поместить поверх стерильного покровного стекла.
3. Добавьте 10 μL 2x PBS. Аккуратно перемешайте раствор PBS с помощью наконечника. Дайте гелю стабилизироваться не менее 20 минут, следя за тем, чтобы капли оставались практически неповрежденными.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целью добавления PBS и бережного перемешивания является сохранение целостности капли и предотвращение растекания гидрогеля по слою.
4. Отсоедините клетки SW1222 с помощью 0,125% раствора трипсина-ЭДТА (5 мл). Инкубируйте клетки с трипсином при 37 °C в течение 5-10 минут, пока они не отделятся от колбы. Воздержитесь от постукивания по колбе, чтобы избежать слипания клеток.
5. Добавьте 5 мл готовой среды для инактивации трипсина. Отфильтруйте клеточную суспензию с помощью клеточного фильтра 30 мкм. В качестве альтернативы используйте шприц с иглой 25 G, чтобы разрушить агрегаты.
6. Приготовьте клеточную суспензию в концентрации 0,4 ×^{10 6} клеток/мл и введите 2 мкл клеточной суспензии в каждую пептидную каплю с помощью микропипетки объемом 10 мкл.
7. Инкубируйте капли в течение 30 минут при 37 °C, 5%_CO2. Добавьте по 0,5 мл добавки среды в каждую лунку после инкубации.
8. Во время ожидания приготовьте контроль матрицы базальной мембраны, разбавив основной запас (8-12 мг/мл, в зависимости от партии) до конечной концентрации 3 мг/мл с использованием добавленной среды. Добавьте в этот раствор элементы (800 ячеек на 25 μл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Манипуляции с базальной мембраной должны всегда проводиться на льду. Перед прикосновением к гидрогелю кончики необходимо промыть в ледяном PBS. В противном случае внутри кончиков произойдет полимеризация.
9. Поместите 20 мкл капель раствора базальной мембраны в каждую лунку. Дайте каплям загустеть, выдерживая в течение 20 минут при 37 °C. После того как материал будет гелеобразным, добавьте 0,5 мл готовой среды.
10. Меняйте средство каждые 3-4 дня. Наблюдайте за тем, как клетки организуются и проявляют признаки образования просвета уже на 4-й день.
11. Изобразите клетки в светлом поле в день 1, день 4 и день 7 для оценки роста органоидов.

3. Жизнеспособность и распространение

1. Подготовьте три планшета с черными лунками для анализа жизнеспособности и три планшета с черными лунками для анализа пролиферации. Добавьте 25 μл 2x пептидного раствора на лунку и желатинуйте, используя тот же объем 2x PBS. Засейте клетки, как описано выше.
2. Подготовьте три лунки для каждого состава пептидного гидрогеля, который будет использоваться в качестве заготовок в пластине для пролиферации. Не засеивайте на них клетки.
3. Снимите среду с планшета для определения жизнеспособности и промойте 1x PBS в течение 3 x 5 минут.
4. Разбавьте гомодимер кальцеина-АМ и этидия до 8 мкМ из набора для жизнеспособности/цитотоксичности для клеток млекопитающих (см. Таблицу материалов) в той же светозащищенной конической трубке. Для приготовления 2 мл этого раствора на 2 мл PBS в светозащищенной конической пробирке добавьте 4 мкл стокового раствора Кальцеин-АМ и 8 мкл стокового раствора гомодимер-1 этидия.
5. Добавьте раствор гомодимера кальцеин/этидий, приготовленный на шаге 3.4, в 96-луночный планшет. Добавьте 100 μл на лунку. Беречь от света и выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут.
6. Стирайте 3 x 5 минут с 1x PBS. Изображение минимум трех полей (центральное, верхнее, нижнее) при использовании объектива с 4-кратным увеличением или минимум пяти полей (в центре, вверху слева, вверху справа, внизу слева, внизу справа) при использовании объектива с 10-кратным и 20-кратным увеличением под флуоресцентным микроскопом.
7. Удалите среду из планшета пролиферационного колодца, чтобы конечный объем составил 90 мкл.
8. Добавьте 10 μL раствора Alamar Blue (см. Таблицу материалов) до достижения конечной концентрации 10%.
9. Беречь от света и выдерживать в течение 2-4 часов при 37 °C, 5%_CO2
10. Используйте луночный планшетный ридер для измерения флуоресценции (Ex/Em = 530-560/590 нм/нм) или поглощения (570 нм). Усредняем полученные значения для заготовок и вычитаем их из значений из каждой лунки, содержащей ячейки.
11. Рассчитайте значения распространения, усреднив сигнал каждого условия и вычитая среднее значение соответствующих заготовок. Создание графиков путем создания индексированной ящичковой диаграммы зависимости сигнала относительного поглощения/флуоресценции от времени.

4. Анализ адгезии клеток к матриксу

1. Приготовьте 100 мкл пептидных гидрогелей в двух независимых 96-луночных планшетах.
2. Засейте 20 000 клеток в каждую лунку и добавьте 100 мкл среды. Инкубируйте планшеты в течение 90 минут при 37 °C, 5%_CO2.
3. После инкубации возьмите только одну пластину и осторожно повторно суспендируйте среду с помощью микропипетки Р200 в течение 20-30 с. Будьте осторожны, чтобы не нарушить действие гидрогеля, удерживая кончик от геля. В качестве альтернативы, если это позволяют механические свойства гидрогеля (G' > 8000 Па), постукивайте по четырем сторонам луночной пластины с помощью движущегося вихря.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторная суспендия среды (или постукивание вихревым стеклом по луночной пластине) удалит как неприкрепленные ячейки, так и ячейки с незначительной адгезией к поверхности матрицы. Клеточное прикрепление произойдет в течение 90 минут, хотя прочность этого прикрепления будет варьироваться в зависимости от конкретных пептидных гидрогелей и их адгезивных и связующих свойств. Известно, что рост колоректальных органоидов предпочтительнее в матрицах со значениями жесткости менее 2000 Па. Следовательно, поскольку гидрогели, представленные в этом протоколе, мягкие и хрупкие, мы уделяем особое внимание использованию мягкого механического воздействия.
4. Удалите 100 мкл среды с обоих луночных планшетов и добавьте промойте один раз 1x PBS.
5. Приготовьте раствор DAPI в концентрации 1 мкг/мл. Добавьте 100 μL раствора DAPI во все лунки и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре.
6. Визуализируйте репрезентативное количество полей под флуоресцентным микроскопом. Убедитесь, что все изображения получены с использованием одного и того же объектива, чтобы соотношение пикселей и расстояния оставалось постоянным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изобразите девять полей для объектива с 10-кратным увеличением или 15 полей для объектива с 20-кратным увеличением.
7. Загрузите флуоресцентные изображения в программное обеспечение для анализа изображений (например, ImageJ) и проанализируйте частицы на всех изображениях.
   1. В меню «Изображение » выберите «Тип » и нажмите « 8-бит».
   2. В меню «Изображение » выберите «Настройка » и нажмите « Яркость/контрастность». Нажмите на кнопку «Авто » | Подайте заявку.
   3. В меню «Изображение » выберите «Настроить » и нажмите « Порог». Нажмите на кнопку « Авто » и закройте окно.
   4. В меню «Анализ» нажмите «Анализировать частицы». Отметьте галочкой опцию подведения итогов и нажмите OK.
   5. В окне Сводка наведите указатель мыши на меню Файл и нажмите Сохранить , чтобы сохранить суммарные значения.
8. Экспортируйте результаты для всех изображений в стандартное программное обеспечение для статистики.
9. Рассчитайте процент площади, занятой клетками до и после стресса. Создайте индексированную ящичковую диаграмму процентного соотношения площади к каждому условию.

5. Иммуноокрашивание органоидов в пептидном гидрогеле

1. Засейте 800 клеток в капли пептидного гидрогеля по 20 мкл в течение 4 дней, как описано в шагах 2.1-2.10.
2. На 4-й день удалите среду и промойте каждую лунку 2 раза, используя 1x PBS.
3. Добавьте 400 μЛ 4% раствора формальдегида. Инкубируйте лунку в течение 30 минут при комнатной температуре.
4. Удалите раствор формальдегида с помощью P1000 и промойте один раз 1x PBS.
5. Добавьте 1 мл буфера для пермеабилизации и инкубируйте 5 минут при комнатной температуре.
6. Снимите буфер для пермеабилизации с помощью P1000 и промойте один раз 1x PBS.
7. Добавьте 0,5 мл блокирующего буфера и инкубируйте 30 минут при комнатной температуре.
8. Снимите блокирующий буфер с помощью P1000 и промойте 1x PBS.
9. Разведите первичное антитело в блокирующем буфере в соответствии с инструкцией производителя (см. Таблицу материалов). Добавьте 200 μL в две лунки.
10. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C.
11. Удалите раствор для окрашивания с помощью P200 и промойте один раз 1x PBS.
12. Разведите вторичное антитело в блокирующем буфере, согласно инструкции производителя (см. Таблицу материалов). Добавьте конъюгат фаллоидина в соотношении 1:40 во вторичный раствор антитела.
13. Беречь от света и выдерживать при комнатной температуре не более 3 ч. Удалите раствор для окрашивания с помощью P200 и промойте один раз 1x PBS.
14. Приготовьте раствор DAPI в концентрации 1 г/мл в блокирующем буфере. Добавьте по 300 мкл раствора DAPI в каждую лунку.
15. Беречь от света и выдерживать 5 минут при комнатной температуре.
16. Удалите раствор для окрашивания с помощью P200 и промойте один раз 1x PBS.
17. Беречь от света и хранить при температуре 4 °C до 7 дней.

6. Визуализация и анализ изображений органоидов в матрице

1. Визуализируйте окрашенные образцы с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с 10-кратным увеличением. Используйте только каналы фаллоидина и DAPI.
2. Откройте программу Cellopose и нажмите ctrl + L , чтобы загрузить изображение. Поскольку программное обеспечение будет иметь доступ ко всем файлам в месте расположения выбранного изображения, обязательно сохраните все флуоресцентные изображения в точном месте, не имея никаких подпапок.
3. Введите средний диаметр колоний на панели Сегментация и нажмите ENTER.
4. Выберите пользовательскую модель для органоидов двоеточия и нажмите кнопку «Запустить модель ».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы предлагаем использовать две модели с нуля в Cellpose2.0^29,30
5. Нажмите ctrl + s , чтобы сохранить маски в виде файла .npy.
6. Используйте стрелки клавиатуры для перемещения по изображениям папки и запустите модель для двоеточия органоидов на всех изображениях в папке.
7. Сделайте копию папки и повторите шаги 6.2-6.6, используя модель для просвета органоида толстой кишки.
8. Откройте ImageJ и нажмите на Плагин | Макросы | Бежать... , чтобы запустить файл imagej_roi_converter.py, доступный на сайте Cellpose Github, и дождаться появления окна.
9. Выберите первый файл из папки colon organoid и нажмите кнопку Открыть.
10. Выберите файл seg.npy, соответствующий первому файлу, и нажмите кнопку Открыть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ преобразует маски в интересующие области и накладывает их на соответствующие флуоресцентные изображения.
11. Нажмите кнопку Выбрать все в окне Менеджер ROI и нажмите кнопку Измерить.
12. Нажмите «Файл» | Сохранить как... в окне Результаты и сохраните результаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В результате будет создан файл .csv, содержащий все свойства формы каждой колонии в поле.
13. Повторите шаги 6.8-6.12 для того же изображения в папке для органоидного просвета толстой кишки.
14. Загрузите OriginPro и нажмите ctrl + 3 , чтобы открыть мастер импорта. Нажмите на кнопку с тремя точками и выберите оба .csv файла, соответствующие свойствам органоида и формы люменов для одного и того же изображения.
15. Скопируйте и вставьте результаты свойств формы люменов в один столбец рядом с результатами колонии, чтобы убедиться, что каждое измерение люменов связано с соответствующей колонией.
16. В новом столбце разделите площади просвета и колонии, чтобы получить относительную площадь просвета содержащей ее колонии.
17. Выберите столбец, соответствующий круговости каждой колонии и площади просвета. Нажмите на график | Базовый 2D | Скаттер.
18. Щелкните правой кнопкой мыши по окну графика и выберите «Детали графика». Перейдите на вкладку Centroid(PRO) и отметьте галочкой опции с надписями Show Centroid Point for Subset, Connect to Data Points и Show Ellipse.

Во-первых, мы оценили клетки, выращенные в 24-луночном планшете в течение 7 дней с помощью визуализации в светлом поле. Мы идентифицировали небольшие кластеры клеток, собирающихся в органоиды в течение недели, как показано на рисунке 4. Метод контролируемого сканирования может отслеживать подвижность клеток и органоидов между разными днями. В целом, мы рассмотрели эволюцию морфологии клеток в течение всей недели. Органоиды, полученные из SW1222, должны иметь круглую морфологию и светлый вид. Более темный вид указывает на нежелательную более высокую плотность клеток, как это наблюдается в некоторых колониях, культивируемых в пептиде P, на 7-й день (рис. 4).

На рисунке 5 показаны результаты анализов жизнеспособности клеток (рисунок 5A) и пролиферации (рисунок 5B), которые указывают на количество мертвых и живых клеток и метаболическую активность соответственно. Здесь мы использовали анализ жизнеспособности на основе гомодимеров кальцеина и этидия и заметили, что эти клетки показали небольшую популяцию мертвых клеток к 7-му дню при культивировании в Матригеле. Это явление также присутствовало во всех гидрогелях на основе пептидов, но не в 2D-культуре. Результаты пролиферации показали общее увеличение метаболической активности между 1-м и 7-м днем. Кроме того, мы обнаружили небольшое снижение активности между 4-м и 7-м днем при нескольких состояниях. Это наблюдение коррелирует с увеличением популяции мертвых клеток, наблюдаемым при анализе жизнеспособности (рисунок 5A).

Для предварительной оценки взаимодействия между клетками и биофункционализации пептидных гидрогелей мы провели анализ адгезии на основе механического воздействия для индуцирования отслойки клеток. Как видно на рисунке 6, использование различных концентраций биофункционального пептида Р2 существенно влияло на количество клеток, сохраняющихся до и после процесса отслойки. В данном случае мы использовали пептид, который содержит только биофункциональный мотив пептида Р2 в качестве положительного контроля. В качестве отрицательного контроля мы также использовали небиофункциональный пептид Р. Как видно на графике, клетки, засеянные пептидом Р, имели относительно низкую начальную адгезию, а также низкую удерживающую способность. Более того, изменение соотношения биофункционального пептида Р2 коррелировало с количеством клеток, оставшихся после стресса. Таким образом, используя этот анализ, мы можем заключить, что пептид P2 влияет на адгезию клеток, которая может быть обусловлена или не обусловлена биофункциональным мотивом, но коррелирует с количеством биофункционального пептида, присутствующего в смеси.

Затем мы исследовали влияние матриц на сфабрикованные органоиды. Мы оценили круговость колонии и относительный размер просвета по отношению к размеру колонии, выполнив анализ формы образцов, окрашенных цитоскелетом, культивируемых в течение 4 дней. Точки данных имели определенное распределение по осям x и y, и каждое условие имело центроид с определенным значением круглости и относительной площади просвета. На рисунке 7 показано, что клетки, культивируемые в 2D, имели очень высокую вариабельность кольцевой колонии. Напротив, клетки, культивируемые в Матригеле, имели более обширное распределение по относительному размеру просвета.

Интересно, что значения центроидов для всех пептидсодержащих гидрогелей имели очень похожее положение. Однако расстояние между точками данных показало разные профили распределения. Например, пептид Р3 имел меньшее распределение среди трех пептидных гидрогелей, в то время как точки данных от небиофункционального пептида Р, по-видимому, имели большее распределение. Эти данные свидетельствуют о том, что оба гидрогеля с P1 и P3 имеют потенциал для оптимизации для культивирования органоидов.

Наконец, мы оценили экспрессию специфических маркеров с помощью иммуноцитохимии на образце, окрашенном на апикальные маркеры ZO-1 и эзрин. Эти маркеры позволили оценить поляризацию клеток внутри каждого органоида. Мы также оценили пан-кадгериновые маркеры для визуализации межклеточных соединений и специфичный для цитоскелета маркер (фаллоидин) для визуализации просвета. На рисунке 8А показаны органоиды, обнаруженные в небиофункциональном пептиде P, биофункционализированном пептиде P1 и Matrigel на 4-й и 7-й день. Маркеры ZO-1 и эзрина должны быть локализованы в пределах апикальной и базолатеральной мембран органоида; Правильная поляризация клеток позволит нам наблюдать экспрессию обеих молекул к 4-му дню вблизи области просвета, в противном случае невидимой. Действительно, как видно на рисунке 8, маркеры ZO-1 и эзрина были расположены в апикальных мембранах органоидов, культивируемых в Матригеле. Интересно, что маркеры эзрина были едва заметны в небиофункциональном пептиде Р. Из этого мы делаем вывод, что неэффективная поляризация клеток привела к низкой экспрессии этих молекул в пептиде P.

Более того, дисперсия ядер в пептидных гидрогелях имела тенденцию быть неравномерной, в то время как органоиды, встроенные в Матригель, образовывали один асимметричный слой ядер. Это описание соответствует идеальной морфологии колоректального органоида; однако, хотя ориентация ядер не была полностью асимметричной в пептидных гидрогелях, более плотные колонии с многослойными ядрами были обнаружены в основном в небиофункциональном пептиде Р. Напротив, межклеточные соединения должны быть локализованы перпендикулярно апикальной и базолатеральной мембранам (рис. 8B). Этот маркер позволил нам наблюдать за краями всех клеток, расположенных внутри колонии. При выращивании в Матригеле клетки имели почти идеальное радиальное распределение пан-кадгерина (межклеточные соединения) к 7-му дню. Напротив, неполяризованные колонии, такие как в пептиде P, демонстрируют неупорядоченное расположение клеток и экспрессию межклеточных соединений вблизи базальной и апикальной мембраны.

Рисунок 1: Ультракороткие самоорганизующиеся пептиды, образующие нановолокна. (A) Изображение процесса самосборки алифатических ультракоротких пептидов. (B) Химическая структура ультракороткого SAP IIFK, биофункционализированного лигандом IKVAV. Эта цифра была изменена по Loo et al.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Структура и свойства пептидов. (A) Проиллюстрированы химические структуры исходного пептида IIFK и биофункционального пептида P2. (B) Результаты испытаний в перевернутом флаконе показывают критическую концентрацию гелеобразования и разницу во времени гелеобразования. P2 образует полупрозрачный гель с более высоким CGC, чем исходный пептид IIFK. Примечательно, что смесь IIFK:P2 (1:1) демонстрирует еще более высокую CGC и более длительное время гелеобразования, чем любой из пептидов по отдельности. (C) Сканирующие электронные микрофотографии дают визуальное представление о структурных характеристиках IIFK, P2 и смеси IIFK:P2 (1:1). (D) Высокотемпературные изображения атомно-силовой микроскопии изображают гелеобразные пептиды в концентрации 8 мМ, что дает подробное представление об особенностях их поверхности. (E) Спектроскопия кругового дихроизма выявляет конформационные изменения смеси IIFK:P2 в различных концентрациях, проливая свет на их вторичные структурные изменения. (F) Реологические анализы измеряют жесткость гелеобразных пептидов при различных концентрациях, что дает ценную информацию об их механических свойствах. Этот рисунок воспроизведен из Perez-Pedroza et al.25. Масштабные линейки = 1 μм (C), 200 нм (D). Сокращение: CGC = критическая концентрация гелеобразования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Диаграмма, изображающая получение пептидов и посев клеток для производства органоидов и их характеристики по жизнеспособности, адгезии, органоидообразующей способности и иммуноокрашиванию в пептидных гидрогелях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Изображения светлопольной микроскопии, полученные из клеток SW1222, культивируемых в пептидных гидрогелях, помеченных как P и P1, по сравнению с контролем Matrigel. Интересно, что органоиды, культивируемые в пептидных гидрогелях, к седьмым суткам проявляют преимущественно сферическую морфологию. Напротив, те, которые расположены внутри Матригеля, по-видимому, демонстрируют пониженную плотность клеток, о чем можно судить по их яркому телу, по сравнению с затемненным телом культуры органоидов в SAP (черные стрелки). Тем не менее, они демонстрируют очевидную концентрацию между соседними колониями. Кроме того, становится очевидным, что миграционная способность клеток в среде Матригеля сравнительно снижена. Масштабные линейки = 650 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Анализ жизнеспособности и пролиферации клеток SW1222 в биофункционализированных SAP в различных концентрациях. (A) Оценка жизнеспособности клеток, культивируемых в биофункциональных пептидах P1 и P2, по сравнению с Matrigel и 2D. (B) Оценка пролиферации клеточной культуры в небиофункциональном пептиде P1 и биофункциональном пептиде P2, по сравнению с Matrigel и 2D-контролем. Здесь мы наблюдаем поведение, аналогичное тому, как клетки растут в Матригеле для анализа живых/мертвых. Небольшое увеличение мертвых клеток (желтых стреловидных наконечников) обнаруживается при нескольких состояниях, в основном при Матригеле. Что касается пролиферации, то тенденции варьируются в зависимости от типа и концентрации пептида, но в целом наблюдается положительная тенденция. Масштабные линейки = 250 μм. Эта цифра была адаптирована из Perez-Pedroza et al.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Влияние пептида на количество отделенных клеток. (A) Флуоресцентные изображения клеток, окрашенных DAPI до и после механического воздействия. Здесь мы используем пептид P, модифицированный пептид P2 и мотив IKVAV. (B) Изменение адгезии клеток определяли путем измерения покрытой площади на ImageJ. Сравнительный анализ показал, что биофункционализированный пептид Р2 обладает повышенной удерживающей способностью по сравнению с небиофункциональным пептидом Р. Масштабные полосы = 100 мкм. Этот рисунок был адаптирован из Perez-Pedroza, et al.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7: Оценка органоидной образующей способности путем вычисления центроида относительной площади просвета в зависимости от круглости. Центроид и дисперсия данных варьировали в зависимости от лечения. Как и ожидалось, наихудшие результаты показали 2D-измерения, которые расширились в обширном диапазоне значений круговости и имели самую низкую относительную площадь просвета. Матригель обладал не только самой высокой круглостью, но и самым большим просветом. Пептидные условия незначительно варьировали в обоих значениях, но состояние P3 имело наиболее незначительные вариации данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 8: Конфокальные микроскопические изображения органоидов на 4-й и 7-й день для различных маркеров. (A) ZO-1 (зеленый), эзрин (красный) и DAPI (синий) маркеры используются для определения апикального распределения клеток внутри органоидов. Как видно в контроле Матригеля, эти молекулы обычно локализованы в апикальных и базолатеральных мембранах. Небиофункциональный пептид Р проявляет экспрессию этих молекул только к 7-му дню. (В) Маркеры межклеточного соединения, окрашенные панкадгериновыми (зелеными) антителами, должны быть перпендикулярны базолатеральным и апикальным мембранам органоидов. Ядра клеток (синие) и цитоскелет (красные) используются в качестве противовесов. Небиофункциональный пептид P индуцировал экспрессию межклеточного соединения в базолатеральной мембране, в отличие от двух других методов лечения (P3 и Matrigel). Масштабные линейки = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.