Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Получение и характеристика органоидов колоректального рака из клеточной линии SW1222 в ультракороткой самоорганизующейся пептидной матрице

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66060

⸱

3 мая 2024 г.

 ,  , 
1Laboratory for Nanomedicine, Biological & Environmental Science & Engineering, King Abdullah University of Science and Technology, 2Computational Bioscience Research Center, King Abdullah University of Science and Technology, 3Red Sea Research Center, King Abdullah University of Science and Technology

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол направлен на оценку биофункциональных самоорганизующихся пептидов на предмет клеточной адгезии, морфологии органоидов и экспрессии генов путем иммуноокрашивания. Мы будем использовать клеточную линию колоректального рака, чтобы обеспечить экономически эффективный способ получения органоидов для интенсивного тестирования.

Аннотация

Ультракороткие самоорганизующиеся пептиды (САП) могут спонтанно образовывать нановолокна, напоминающие внеклеточный матрикс. Эти волокна позволяют образовывать гидрогели, которые являются биосовместимыми, биоразлагаемыми и неиммуногенными. Ранее мы доказали, что САП, будучи биофункционализированными с помощью белковых мотивов, могут имитировать характеристики внеклеточного матрикса, которые поддерживают формирование колоректальных органоидов. Эти биофункциональные пептидные гидрогели сохраняют механические свойства исходного родительского пептида, его настраиваемость и печатаемость, при этом они включают сигналы, которые позволяют клеточно-матриксным взаимодействиям увеличивать клеточную адгезию. В данной статье представлены протоколы, необходимые для оценки и характеристики влияния различных биофункциональных пептидных гидрогелей на адгезию клеток и формирование просвета с использованием клеточной линии аденокарциномы рака, способной экономически эффективно образовывать органоиды колоректального рака. Эти протоколы помогут оценить влияние биофункционального пептидного гидрогеля на клеточную адгезию и образование люминалей с помощью иммуноокрашивания и анализа флуоресцентного изображения. Клеточная линия, используемая в этом исследовании, ранее использовалась для генерации органоидов в матрицах животного происхождения.

Введение

В последние годы самоорганизующиеся пептиды (САП) стали перспективными биоматериалами для применения в тканевой инженерии. САП обладают уникальными свойствами, включая спонтанное образование нановолокон, биосовместимость, биоразлагаемость и неиммуногенность, что делает их привлекательными кандидатамидля разработки скаффолда. САП ранее использовались вместе с различными типами клеток, и, в частности, сообщалось, что ультракороткие САП способствовали инкапсуляции стволовых клеток, сохраняя их плюрипотентность в течение длительных периодов, охватывающих более 30 пассажей, и с минимальной частотой хромосомных аберраций 2,3,4. Следовательно, адаптация САП для их использования в органоидных культурах представляла собой рациональный последующий шаг.

Органоиды представляют собой сложные трехмерные структуры, которые возникают из одиночных плюрипотентных клеток. Эти структуры дают начало различным типам клеток, которые затем самоорганизуются, чтобы воспроизвести процессы развития эмбрионального и тканевого роста in vitro5. Эта инновационная структура превратилась в мощный инструмент для исследований in vitro, эффективно сохраняющий генетические, фенотипические и поведенческие характеристики, характерные для органов in vivo 6. Тем не менее, основным препятствием при переходе от стенда к постели больного при переходе от работы на основе органоидов к постели больного является потребность в воспроизводимости7. Эти различия в результатах в первую очередь объясняются сложностью полной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека в специализированные клеточные линии, что усугубляется отсутствием аутентичной архитектуры тканей и сложностью, присущей органоидным моделям. Учитывая рост популярности исследований на основе стволовых клеток и органоидов8, наблюдается повышенный спрос на биоматериалы с динамическими механическими свойствами и интегрин-подобными сайтами адгезии или скаффолды с контролируемой разлагаемостью 7,9. Эти атрибуты могут быть эффективно настроены за счет стратегического использования биофункционализированных SAP.

САП представляют собой короткие последовательности аминокислот с присущей им способностью спонтанно организовываться в четкоопределенные структуры. Эти пептиды часто содержат чередующиеся гидрофобные и гидрофильные остатки, которые стимулируют их самосборку посредством нековалентных взаимодействий, включая водородные связи, электростатические взаимодействия и гидрофобные эффекты 11,12. Процесс самосборки этих пептидов в первую очередь обусловлен необходимостью минимизации свободной энергии системы. При нахождении в водной среде гидрофобные остатки имеют тенденцию группироваться вместе, чтобы свести к минимуму воздействие воды, в то время как гидрофильные остатки взаимодействуют с окружающими молекулами воды. Это явление приводит к образованию различных наноструктур. При этом ультракороткие самоорганизующиеся пептиды образуют нановолокна с характеристиками, которые зависят от пептидной последовательности и условий окружающей среды 2,12,13,14,15,16. Эти пептиды имеют β-витковую конформацию, при которой отдельные пептидные нити выстраиваются параллельно или антипараллельно друг другу, стабилизируясь водородными связями (рис. 1). Присутствие положительных ионов ускоряет процессы самосборки, которые приводят к образованию нановолокон.

Было установлено, что пептидные нановолокна обладают врожденной способностью захватывать значительные объемы воды. Эта характеристика способствует образованию гидрогеля, который впоследствии проявляется как биосовместимое и биоразлагаемое трехмерное пространство, способствующее пролиферации и росту клеток. Эти самоорганизующиеся пептидные нановолокна искусно имитируют топографические особенности, присущие окружающей среде естественного внеклеточного матрикса (ВКМ)1. Это сходство наделяет клетки средой, которая имитирует их физиологическую среду обитания, способствуя дальнейшейоптимальной клеточной активности. Кроме того, универсальность, присущая этим пептидам, обеспечивает значительную степень перестраиваемости4. Такая адаптивность позволяет изменять свойства матрицы, такие как жесткость, кинетика гелеобразования и пористость. Эти адаптации достигаются за счет модификаций пептидной последовательности. Следовательно, самоорганизующиеся пептиды (САП) стали ключевыми компонентами в современной биоматериаловедении и широко используются в качестве каркасов для регенерации тканей и клеточной культуры13,17.

Одним из важнейших преимуществ самоорганизующихся пептидов является их способность легко синтезироваться и модифицироваться на молекулярном уровне. Это преимущество позволяет встраивать определенные функциональные группы или биоактивные мотивы в пептидную последовательность, что позволяет создавать пептиды с индивидуальными свойствами и функциональными возможностями 18,19,20 (рисунок 1B). Например, биофункционализированные САП могут быть сконструированы таким образом, чтобы имитировать ВКМ и способствовать дифференцировке с использованием пептида RGD19,21. Также сообщалось, что пептид Ben-IKVAV значительно увеличивает экспрессию нейрон-специфических маркеров из-за его лиганд-специфичной подвижности22. Эти пептиды также могут быть сконструированы для отображения биоактивных молекул, таких как интегрин-связывающие пептиды, дляповышения выживаемости клеток. Наконец, были разработаны другие биофункционализированные САП для содействия ангиогенезу путем включения мотивов IKVAV и YIGSR в их структуры.

Биофункционализированные SAP, о которых сообщалось в более ранней публикации, показывают, что самосборка может быть дополнительно модифицирована путем включения наивного пептида, из которогобыл получен биофункционализированный SAP. Эти смеси SAP также могут содержать широкий спектр составов SAP, которые различаются по своей биохимической активности и физико-химическим свойствам. Например, амфифильный пептид IIFK представляет собой ультракороткий SAP, который может выдерживать биофункционализацию с различными мотивами, примером чего является включение мотива IKVAV (рис. 1B). Оба пептида могут образовывать нановолокна, как по отдельности, так и в совокупности. В результате каждой формулы получаются гидрогели с различными физическими свойствами (Рисунок 2)

Тем не менее, из-за обширного спектра потенциальных перестановок и альтернатив, полученных в результате биофункционализации SAP, существует необходимость в обеспечении быстрого и экономически эффективного варианта тестирования органоидов. Одним из кандидатов на такую интенсивную и экономически эффективную оценку органоидов является клеточная линия SW1222, полученная из колоректальной аденокарциномы человека26,27. Клетки SW1222 обладают характеристиками, которые позволяют их агрегировать в 3D-структуры, напоминающие органоиды, что делает их идеальной моделью для изучения развития тканей и применения регенеративной медицины. Было установлено, что клетки SW1222 способны генерировать органоиды благодаря присущей им сверхэкспрессии гена LGR5 27. Создание органоидов из отдельных стволовых клеток LGR5+ было убедительно продемонстрировано ранее, как и склонность клеток SW1222 к достижению морфологических характеристик органоида колоректальногорака28.

В данной статье мы представляем подробные протоколы оценки и характеристики влияния различных биофункциональных пептидов на клеточную адгезию и формирование просвета с использованием клеток SW1222 (рис. 3). Предоставляя пошаговые процедуры и методы анализа изображений, мы надеемся предложить ценную информацию о биопроизводстве органоидов и оценке упрощенных матриц SAP для культивирования органоидов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Приготовление буфера и раствора

ПРИМЕЧАНИЕ: Все указанные концентрации являются конечными концентрациями.

  1. Добавьте фетальную бычью сыворотку (FBS) и пенициллин-стрептомицин в конечной концентрации 10% и 1% соответственно, чтобы получить полную модифицированную среду Dulbecco's Medium (IMDM) от Iscove. Хранить в темноте при температуре 4 °C до 1 месяца.
  2. Смешайте MgCl2 (3 мМ), сахарозу (300 мМ) и Triton X-100 (0,5%) в фосфатном буфере (PBS) для приготовления буфера для пермеабилизации. Храните этот раствор при температуре 4 °C до 2 месяцев.
  3. Объедините бычий сывороточный альбумин (БСА, 1%), глицин (0,3 М) и твин-20 (0,1%) в PBS для получения блокирующего буфера. Храните этот раствор при температуре 4 °C до 2 месяцев.
  4. Разбавьте от 10x до 2x PBS сверхчистой водой в стерильных условиях. Хранить такой раствор при комнатной температуре более 6 месяцев.
  5. Стерилизуйте 3 мг пептидного порошка под ультрафиолетовым светом в течение 30 минут. Добавьте 500 мкл сверхчистой воды для растворения с помощью вихревого смесителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация должна быть в два раза больше целевой концентрации, т.е. 6 мг/мл, так как концентрация 1x будет составлять 3 мг/мл.

2. Производство органоидов колоректального рака из пептида SW1222

  1. Разморозьте аликвоту на ночь при температуре 4 °C и держите ее во льду до тех пор, пока не потребуется подготовить управление матрицей фундамента.
  2. Поместите каплю 2x пептидного раствора объемом 10 мкл в центр каждой лунки в 24-луночный планшет. Дайте тарелке поинкубироваться при комнатной температуре в течение 10 минут. В качестве альтернативы можно поместить 8-10 капель на лунку в 6-луночный планшет.
    Примечание: Образцы, предназначенные для использования в конфокальной и электронной микроскопии, более доступны для манипуляций, если их поместить поверх стерильного покровного стекла.
  3. Добавьте 10 μL 2x PBS. Аккуратно перемешайте раствор PBS с помощью наконечника. Дайте гелю стабилизироваться не менее 20 минут, следя за тем, чтобы капли оставались практически неповрежденными.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью добавления PBS и бережного перемешивания является сохранение целостности капли и предотвращение растекания гидрогеля по слою.
  4. Отсоедините клетки SW1222 с помощью 0,125% раствора трипсина-ЭДТА (5 мл). Инкубируйте клетки с трипсином при 37 °C в течение 5-10 минут, пока они не отделятся от колбы. Воздержитесь от постукивания по колбе, чтобы избежать слипания клеток.
  5. Добавьте 5 мл готовой среды для инактивации трипсина. Отфильтруйте клеточную суспензию с помощью клеточного фильтра 30 мкм. В качестве альтернативы используйте шприц с иглой 25 G, чтобы разрушить агрегаты.
  6. Приготовьте клеточную суспензию в концентрации 0,4 ×10 6 клеток/мл и введите 2 мкл клеточной суспензии в каждую пептидную каплю с помощью микропипетки объемом 10 мкл.
  7. Инкубируйте капли в течение 30 минут при 37 °C, 5%CO2. Добавьте по 0,5 мл добавки среды в каждую лунку после инкубации.
  8. Во время ожидания приготовьте контроль матрицы базальной мембраны, разбавив основной запас (8-12 мг/мл, в зависимости от партии) до конечной концентрации 3 мг/мл с использованием добавленной среды. Добавьте в этот раствор элементы (800 ячеек на 25 μл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Манипуляции с базальной мембраной должны всегда проводиться на льду. Перед прикосновением к гидрогелю кончики необходимо промыть в ледяном PBS. В противном случае внутри кончиков произойдет полимеризация.
  9. Поместите 20 мкл капель раствора базальной мембраны в каждую лунку. Дайте каплям загустеть, выдерживая в течение 20 минут при 37 °C. После того как материал будет гелеобразным, добавьте 0,5 мл готовой среды.
  10. Меняйте средство каждые 3-4 дня. Наблюдайте за тем, как клетки организуются и проявляют признаки образования просвета уже на 4-й день.
  11. Изобразите клетки в светлом поле в день 1, день 4 и день 7 для оценки роста органоидов.

3. Жизнеспособность и распространение

  1. Подготовьте три планшета с черными лунками для анализа жизнеспособности и три планшета с черными лунками для анализа пролиферации. Добавьте 25 μл 2x пептидного раствора на лунку и желатинуйте, используя тот же объем 2x PBS. Засейте клетки, как описано выше.
  2. Подготовьте три лунки для каждого состава пептидного гидрогеля, который будет использоваться в качестве заготовок в пластине для пролиферации. Не засеивайте на них клетки.
  3. Снимите среду с планшета для определения жизнеспособности и промойте 1x PBS в течение 3 x 5 минут.
  4. Разбавьте гомодимер кальцеина-АМ и этидия до 8 мкМ из набора для жизнеспособности/цитотоксичности для клеток млекопитающих (см. Таблицу материалов) в той же светозащищенной конической трубке. Для приготовления 2 мл этого раствора на 2 мл PBS в светозащищенной конической пробирке добавьте 4 мкл стокового раствора Кальцеин-АМ и 8 мкл стокового раствора гомодимер-1 этидия.
  5. Добавьте раствор гомодимера кальцеин/этидий, приготовленный на шаге 3.4, в 96-луночный планшет. Добавьте 100 μл на лунку. Беречь от света и выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут.
  6. Стирайте 3 x 5 минут с 1x PBS. Изображение минимум трех полей (центральное, верхнее, нижнее) при использовании объектива с 4-кратным увеличением или минимум пяти полей (в центре, вверху слева, вверху справа, внизу слева, внизу справа) при использовании объектива с 10-кратным и 20-кратным увеличением под флуоресцентным микроскопом.
  7. Удалите среду из планшета пролиферационного колодца, чтобы конечный объем составил 90 мкл.
  8. Добавьте 10 μL раствора Alamar Blue (см. Таблицу материалов) до достижения конечной концентрации 10%.
  9. Беречь от света и выдерживать в течение 2-4 часов при 37 °C, 5%CO2
  10. Используйте луночный планшетный ридер для измерения флуоресценции (Ex/Em = 530-560/590 нм/нм) или поглощения (570 нм). Усредняем полученные значения для заготовок и вычитаем их из значений из каждой лунки, содержащей ячейки.
  11. Рассчитайте значения распространения, усреднив сигнал каждого условия и вычитая среднее значение соответствующих заготовок. Создание графиков путем создания индексированной ящичковой диаграммы зависимости сигнала относительного поглощения/флуоресценции от времени.

4. Анализ адгезии клеток к матриксу

  1. Приготовьте 100 мкл пептидных гидрогелей в двух независимых 96-луночных планшетах.
  2. Засейте 20 000 клеток в каждую лунку и добавьте 100 мкл среды. Инкубируйте планшеты в течение 90 минут при 37 °C, 5%CO2.
  3. После инкубации возьмите только одну пластину и осторожно повторно суспендируйте среду с помощью микропипетки Р200 в течение 20-30 с. Будьте осторожны, чтобы не нарушить действие гидрогеля, удерживая кончик от геля. В качестве альтернативы, если это позволяют механические свойства гидрогеля (G' > 8000 Па), постукивайте по четырем сторонам луночной пластины с помощью движущегося вихря.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторная суспендия среды (или постукивание вихревым стеклом по луночной пластине) удалит как неприкрепленные ячейки, так и ячейки с незначительной адгезией к поверхности матрицы. Клеточное прикрепление произойдет в течение 90 минут, хотя прочность этого прикрепления будет варьироваться в зависимости от конкретных пептидных гидрогелей и их адгезивных и связующих свойств. Известно, что рост колоректальных органоидов предпочтительнее в матрицах со значениями жесткости менее 2000 Па. Следовательно, поскольку гидрогели, представленные в этом протоколе, мягкие и хрупкие, мы уделяем особое внимание использованию мягкого механического воздействия.
  4. Удалите 100 мкл среды с обоих луночных планшетов и добавьте промойте один раз 1x PBS.
  5. Приготовьте раствор DAPI в концентрации 1 мкг/мл. Добавьте 100 μL раствора DAPI во все лунки и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре.
  6. Визуализируйте репрезентативное количество полей под флуоресцентным микроскопом. Убедитесь, что все изображения получены с использованием одного и того же объектива, чтобы соотношение пикселей и расстояния оставалось постоянным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изобразите девять полей для объектива с 10-кратным увеличением или 15 полей для объектива с 20-кратным увеличением.
  7. Загрузите флуоресцентные изображения в программное обеспечение для анализа изображений (например, ImageJ) и проанализируйте частицы на всех изображениях.
    1. В меню «Изображение » выберите «Тип » и нажмите « 8-бит».
    2. В меню «Изображение » выберите «Настройка » и нажмите « Яркость/контрастность». Нажмите на кнопку «Авто » | Подайте заявку.
    3. В меню «Изображение » выберите «Настроить » и нажмите « Порог». Нажмите на кнопку « Авто » и закройте окно.
    4. В меню «Анализ» нажмите «Анализировать частицы». Отметьте галочкой опцию подведения итогов и нажмите OK.
    5. В окне Сводка наведите указатель мыши на меню Файл и нажмите Сохранить , чтобы сохранить суммарные значения.
  8. Экспортируйте результаты для всех изображений в стандартное программное обеспечение для статистики.
  9. Рассчитайте процент площади, занятой клетками до и после стресса. Создайте индексированную ящичковую диаграмму процентного соотношения площади к каждому условию.

5. Иммуноокрашивание органоидов в пептидном гидрогеле

  1. Засейте 800 клеток в капли пептидного гидрогеля по 20 мкл в течение 4 дней, как описано в шагах 2.1-2.10.
  2. На 4-й день удалите среду и промойте каждую лунку 2 раза, используя 1x PBS.
  3. Добавьте 400 μЛ 4% раствора формальдегида. Инкубируйте лунку в течение 30 минут при комнатной температуре.
  4. Удалите раствор формальдегида с помощью P1000 и промойте один раз 1x PBS.
  5. Добавьте 1 мл буфера для пермеабилизации и инкубируйте 5 минут при комнатной температуре.
  6. Снимите буфер для пермеабилизации с помощью P1000 и промойте один раз 1x PBS.
  7. Добавьте 0,5 мл блокирующего буфера и инкубируйте 30 минут при комнатной температуре.
  8. Снимите блокирующий буфер с помощью P1000 и промойте 1x PBS.
  9. Разведите первичное антитело в блокирующем буфере в соответствии с инструкцией производителя (см. Таблицу материалов). Добавьте 200 μL в две лунки.
  10. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C.
  11. Удалите раствор для окрашивания с помощью P200 и промойте один раз 1x PBS.
  12. Разведите вторичное антитело в блокирующем буфере, согласно инструкции производителя (см. Таблицу материалов). Добавьте конъюгат фаллоидина в соотношении 1:40 во вторичный раствор антитела.
  13. Беречь от света и выдерживать при комнатной температуре не более 3 ч. Удалите раствор для окрашивания с помощью P200 и промойте один раз 1x PBS.
  14. Приготовьте раствор DAPI в концентрации 1 г/мл в блокирующем буфере. Добавьте по 300 мкл раствора DAPI в каждую лунку.
  15. Беречь от света и выдерживать 5 минут при комнатной температуре.
  16. Удалите раствор для окрашивания с помощью P200 и промойте один раз 1x PBS.
  17. Беречь от света и хранить при температуре 4 °C до 7 дней.

6. Визуализация и анализ изображений органоидов в матрице

  1. Визуализируйте окрашенные образцы с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с 10-кратным увеличением. Используйте только каналы фаллоидина и DAPI.
  2. Откройте программу Cellopose и нажмите ctrl + L , чтобы загрузить изображение. Поскольку программное обеспечение будет иметь доступ ко всем файлам в месте расположения выбранного изображения, обязательно сохраните все флуоресцентные изображения в точном месте, не имея никаких подпапок.
  3. Введите средний диаметр колоний на панели Сегментация и нажмите ENTER.
  4. Выберите пользовательскую модель для органоидов двоеточия и нажмите кнопку «Запустить модель ».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы предлагаем использовать две модели с нуля в Cellpose2.029,30
  5. Нажмите ctrl + s , чтобы сохранить маски в виде файла .npy.
  6. Используйте стрелки клавиатуры для перемещения по изображениям папки и запустите модель для двоеточия органоидов на всех изображениях в папке.
  7. Сделайте копию папки и повторите шаги 6.2-6.6, используя модель для просвета органоида толстой кишки.
  8. Откройте ImageJ и нажмите на Плагин | Макросы | Бежать... , чтобы запустить файл imagej_roi_converter.py, доступный на сайте Cellpose Github, и дождаться появления окна.
  9. Выберите первый файл из папки colon organoid и нажмите кнопку Открыть.
  10. Выберите файл seg.npy, соответствующий первому файлу, и нажмите кнопку Открыть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ преобразует маски в интересующие области и накладывает их на соответствующие флуоресцентные изображения.
  11. Нажмите кнопку Выбрать все в окне Менеджер ROI и нажмите кнопку Измерить.
  12. Нажмите «Файл» | Сохранить как... в окне Результаты и сохраните результаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В результате будет создан файл .csv, содержащий все свойства формы каждой колонии в поле.
  13. Повторите шаги 6.8-6.12 для того же изображения в папке для органоидного просвета толстой кишки.
  14. Загрузите OriginPro и нажмите ctrl + 3 , чтобы открыть мастер импорта. Нажмите на кнопку с тремя точками и выберите оба .csv файла, соответствующие свойствам органоида и формы люменов для одного и того же изображения.
  15. Скопируйте и вставьте результаты свойств формы люменов в один столбец рядом с результатами колонии, чтобы убедиться, что каждое измерение люменов связано с соответствующей колонией.
  16. В новом столбце разделите площади просвета и колонии, чтобы получить относительную площадь просвета содержащей ее колонии.
  17. Выберите столбец, соответствующий круговости каждой колонии и площади просвета. Нажмите на график | Базовый 2D | Скаттер.
  18. Щелкните правой кнопкой мыши по окну графика и выберите «Детали графика». Перейдите на вкладку Centroid(PRO) и отметьте галочкой опции с надписями Show Centroid Point for Subset, Connect to Data Points и Show Ellipse.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Во-первых, мы оценили клетки, выращенные в 24-луночном планшете в течение 7 дней с помощью визуализации в светлом поле. Мы идентифицировали небольшие кластеры клеток, собирающихся в органоиды в течение недели, как показано на рисунке 4. Метод контролируемого сканирования может отслеживать подвижность клеток и органоидов между разными днями. В целом, мы рассмотрели эволюцию морфологии клеток в течение всей недели. Органоиды, полученные из SW1222, должны иметь круглую морфологию и светлый вид....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Огромный потенциал САП в биомедицинских исследованиях подчеркивается их податливостью и адаптивностью за счет биофункционализации. При таком обширном спектре перестановок возникает проблема эффективного тестирования и определения наиболее перспективных конфигураций для конкретных применений, особенно в исследованиях органоидов. Быстрое и экономичное решение имеет первостепенное значение. Клеточная линия SW1222, полученная из колоректальной аденокарциномы человека, является ключевым кандидатом для такой интенсивной оценки...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Эта работа была выполнена при финансовой поддержке Научно-технологического университета имени короля Абдаллы. Авторы выражают признательность гранту Посевного фонда KAUST и Инновационному фонду KAUST, присужденным Отделом инноваций и экономического развития KAUST. Авторы выражают признательность основным лабораториям бионауки и визуализации KAUST за поддержку в проведении биологических характеристик и микроскопических анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x PBSGibco14190144
6-луночный планшет, обработанный культуройтканей Corning07-200-83
10x PBS, без кальция, без магнияGibco70011044
16% формальдегида (w/v), без метанолаThermo Scientific28906
24-луночный планшет, обработанный культурой тканейCorning09-761-146
96-луночная черная пластина, культура тканейобработана Corning07-200-565
alamarBlue Cell Viability ReagentInvitrogenDAL1025
Anti-Ezrin антитела, кролик моноклональныйAbcamab40839Вторично используемый: анти-кролик Dylight 633
Anti-pan Cadherin антитело, кролик поликлональныйAbcamab16505Вторично используемый: анти-кролик Alexa 488
Anti-ZO1 антитело к плотному соединению, козий поликлональныйAbcamab190085Вторично используемый: антикозий Alexa 488
BSASigma-AldrichA9418
Cellpose 2.0NANAПолучен из
https://github.com/MouseLand/cellpose конфокального лазерного сканирующего микроскопа с AiryscanZEISSLSM 880
DAPIInvitrogenD1306
Вторичное антитело Donkey anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA-11055
GlycineCytivaGE17-1323-01
Вторичное антитело против кролика IgG (H+L) у козы, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Вторичное антитело против кролика IgG (H+L), DyLight 633Invitrogen35562
Термоинактивированная фетальная бычья сыворотка (HI FBS)Gibco16140071
ImageJ 1.54fNIHNA
IMDMGibco12440079
ЖИВАЯ/МЕРТВАЯ жизнеспособность/цитотоксичность, для клеток млекопитающихInvitrogenL3224
Магния хлорид, гексагидрат (MgCl2 6 H2O)Sigma-AldrichM2393
Matrigel for Organoid Culture, Corning free phenol-red356255Упоминается в рукописи как Matrigel или матрица базальной мембраны.
Микроскоп, светлопольный
микроскоп, EVOSThermo ScientificEVOS M7000
OriginPro 2023 (64-бит) 10.0.0.154OriginLab CorpNA
Пенициллин-стрептомицин (10,000 Ед/мл)Gibco15140122
пептид P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)ЛабораторныйNAМожет быть изготовлен на заказ с помощью пептида такие производители, как Bachem.
Пептид P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)Лабораторный NAможет быть изготовлен на заказ производителями пептидов, такими как Bachem.
Пептид P2 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Lys, Val, Ala, Val, NH2)ЛабораторныйNAможет быть изготовлен на заказ производителями пептидов, такими как Bachem.
Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
Круглая крышка, диаметр 10 ммVWR631-0170
Сканирующий электронный микроскопThermo Fisher - FEITENEO VS
Sterile 30 μ m ситечкоSysmex04-004-2326
сахарозаSigma-AldrichS1888
SW1222 клеточная линияECACC12022910
Triton x-100Thermo Scientific85111
Trypsin-EDTA 0,25%Gibco25200056
Tween 20Sigma-AldrichP1379
UltraPure водаИнвитроген10977015

Ссылки

  1. Susapto, H. H., et al. Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs. Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).
  2. Loo, Y., et al. A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells. ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).
  3. Loo, Y., et al. Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration. Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).
  4. Loo, Y., et al. Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures. Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).
  5. Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).
  6. Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).
  7. Kim, S., et al. Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids. Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).
  8. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).
  9. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  10. Hauser, C. A., et al. Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).
  11. Lakshmanan, A., Zhang, S., Hauser, C. A. E. Short self-assembling peptides as building blocks for modern nanodevices. Trends in Biotechnology. 30 (3), 155-165 (2012).
  12. Rauf, S., et al. Self-assembling tetrameric peptides allow in situ 3D bioprinting under physiological conditions. Journal of Materials Chemistry B. 9 (4), 1069-1081 (2021).
  13. Bilalis, P., et al. Dipeptide-based photoreactive instant glue for environmental and biomedical applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (40), 46710-46720 (2023).
  14. Abdelrahman, S., et al. The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds. ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).
  15. Moretti, M., et al. Selectively positioned catechol moiety supports ultrashort self-assembling peptide hydrogel adhesion for coral restoration. Langmuir. 39 (49), 17903-17920 (2023).
  16. Alhattab, D. M., et al. Fabrication of a three-dimensional bone marrow niche-like acute myeloid Leukemia disease model by an automated and controlled process using a robotic multicellular bioprinting system. Biomaterials Research. 27 (1), 111(2023).
  17. Abdelrahman, S., et al. The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds. ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).
  18. Habibi, N., Kamaly, N., Memić, A., Shafiee, H. Self-assembled peptide-based nanostructures: smart nanomaterials toward targeted drug delivery. Nano Today. 11 (1), 41-60 (2016).
  19. Yan, Y., et al. Enhanced osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a functionalized silk fibroin hydrogel for bone defect repair. Advanced Healthcare Materials. 8 (3), 1801043(2018).
  20. Kisiday, J., et al. Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (15), 9996-10001 (2002).
  21. Hogrebe, N. J., et al. Independent control of matrix adhesiveness and stiffness within a 3D self-assembling peptide hydrogel. Acta Biomaterialia. 70, 110-119 (2018).
  22. Wu, F. J., Lin, H. C. Synthesis, self-assembly, and cell responses of aromatic IKVAV peptide amphiphiles. Molecules. 27 (13), 4115(2022).
  23. Cringoli, M. C., et al. Bioadhesive supramolecular hydrogel from unprotected, short d,l-peptides with Phe-Phe and Leu-Asp-Val motifs. Chemical Communications. 56 (20), 3015-3018 (2020).
  24. Pulat, G. O., Gökmen, O., Çevik, Z. B. Y., Karaman, O. Role of functionalized self-assembled peptide hydrogels in in vitro vasculogenesis. Soft Matter. 17 (27), 6616-6626 (2021).
  25. Pérez-Pedroza, R., et al. Fabrication of lumen-forming colorectal cancer organoids using a newly designed laminin-derived bioink. International Journal of Bioprinting. 9 (1), 633(2022).
  26. Ashley, N., Yeung, T. M., Bodmer, W. F. Stem cell differentiation and lumen formation in colorectal cancer cell lines and primary tumors. Cancer Research. 73 (18), 5798-5809 (2013).
  27. Yeung, T. M., Gandhi, S. C., Wilding, J. L., Muschel, R., Bodmer, W. F. Cancer stem cells from colorectal cancer-derived cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3722-3727 (2010).
  28. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  29. Pachitariu, M., Stringer, C. Cellpose 2.0: how to train your own model. Nature Methods. 19 (12), 1634-1641 (2022).
  30. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
  31. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  32. Humphries, M. J. Cell-substrate adhesion assays. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).
  33. Munevar, S., Wang, Y. -l, Dembo, M. Distinct roles of frontal and rear cell-substrate adhesions in fibroblast migration. Molecular Biology of the Cell. 12 (12), 3947-3954 (2001).
  34. Djomehri, S., Burman, B., González, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2018).
  35. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  36. Matthews, J. M., et al. OrganoID: A versatile deep learning platform for tracking and analysis of single-organoid dynamics. PLOS Computational Biology. 18 (11), 1010584(2022).
  37. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR × LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  38. Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319(2018).
  39. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578-100578 (2021).
  40. Yang, Z., Xu, H., Zhao, X. Designer self-assembling peptide hydrogels to engineer 3D cell microenvironments for cell constructs formation and precise oncology remodeling in ovarian cancer. Advanced Science. 7 (9), 1903718(2020).
  41. Yadav, N., et al. Ultrashort peptide-based hydrogel for the healing of critical bone defects in rabbits. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (48), 54111-54126 (2022).
  42. Alshehri, S., Susapto, H. H., Hauser, C. A. E. Scaffolds from self-assembling tetrapeptides support 3D spreading, osteogenic differentiation, and angiogenesis of mesenchymal stem cells. Biomacromolecules. 22 (5), 2094-2106 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Самособирающиеся пептидыпептидный гидрогелькультура органоидовбиофункционализированные гидрогелииммуноокрашиваниефлуоресцентная микроскопия3D-биопечатьанализ в ImageJ
Получение и характеристика органоидов колоректального рака из клеточной линии SW1222 в ультракороткой самоорганизующейся пептидной матрице
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.