Методическая статья

Иммуномагнитная изоляция CD34+ стволовых клеток сосудистой стенки от мышей

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66193

⸱

22 декабря 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education and Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province, Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании был разработан стабильный и эффективный метод выделения, культивирования и функционального определения CD34+ стволовых клеток сосудистой стенки (CD34+ VW-SCs). Этот простой в использовании и эффективный по времени метод изоляции может быть использован другими исследователями для изучения потенциальных механизмов, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Аннотация

Резидентные CD34+ резидентные стволовые и прогениторные клетки сосудистой стенки (VW-SCs) получают все большее признание за их решающую роль в регулировании повреждения и восстановления сосудов. Создание стабильного и эффективного метода культивирования функциональных мышиных CD34+ VW-SC имеет важное значение для дальнейшего изучения механизмов, участвующих в пролиферации, миграции и дифференцировке этих клеток при различных физиологических и патологических условиях. Описанный метод сочетает в себе скрининг магнитных шариков и проточную цитометрию для очистки первичных культивируемых резидентных CD34+ VW-SC. Затем очищенные клетки функционально идентифицируются с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания и визуализации Ca2+ . Вкратце, сосудистые клетки из адвентиции мышиной аорты и брыжеечной артерии получают путем прикрепления тканевых блоков с последующим субкультивированием до достижения количества клеток не менее 1 × 107. Впоследствии CD34+ VW-SC очищают с помощью магнитной сортировки шариков и проточной цитометрии. Идентификация CD34+ VW-SC включает клеточное иммунофлуоресцентное окрашивание, в то время как функциональная мультипотентность определяется путем воздействия на клетки специфической питательной среды для ориентированной дифференцировки. Кроме того, функциональный внутренний выброс Ca2+ и внешний вход Ca2+ оцениваются с помощью коммерчески доступной рабочей станции визуализации в нагруженных Fura-2/AM клетках, подвергшихся воздействию АТФ, кофеина или тапсигаргина (TG). Этот метод предлагает стабильную и эффективную технику выделения, культивирования и идентификации CD34+ стволовых клеток в сосудистой стенке, обеспечивая возможность проведения in vitro исследований регуляторных механизмов VW-SC и скрининга таргетных препаратов.

Введение

Сосудистая стенка играет ключевую роль в развитии сосудов, гомеостатической регуляции и прогрессировании сосудистых заболеваний. В последние годы многочисленные исследования выявили наличие различных линий стволовых клеток в артериях. В 2004 году группа профессора Цинбо Сюя впервые сообщила о существовании сосудистых стволовых/прогениторных клеток на периферии сосудистой стенки взрослого человека, экспрессирующих CD34, Sca-1, c-kit и Flk-11. Эти сосудистые стволовые клетки демонстрируют разнонаправленный потенциал дифференцировки и пролиферации. В нормальных условиях они остаются относительно спокойными; Однако при активации определенными факторами они могут дифференцироваться в гладкомышечные клетки, эндотелиальные клетки и фибробласты. Кроме того, они могут регулировать периваскулярный матрикс и формирование микрососудов посредством паракринных эффектов, способствуя восстановлению или ремоделированию поврежденных сосудов 2,3,4,5,6. Недавно было обнаружено, что резидентные CD34+ стволовые клетки в сосудистой стенке играют роль в регенерации эндотелиальных клеток после повреждения проводника бедренной артерии2. Следовательно, выделение и количественное определение CD34+ VW-SC и изучение основных биологических характеристик стволовых клеток CD34+ имеют решающее значение для дальнейшего изучения сигнальных путей, участвующих в регуляции CD34+ VW-SC.

В настоящее время доступны различные методы разделения клеток, в том числе методы, основанные на характеристиках клеточной культуры или физических свойствах клеток, такие как центрифугирование с градиентом плотности, в результате которого сортируемые клетки содержат много клеток, не являющихся мишенями, и относительно низкую чистоту 7,8,9,10,11,12 . Еще одним часто используемым методом является флуоресцентная/магнитная сортировка клеток. Флуоресцентно-активируемая сортировка клеток (FACS) является сложной системой с высокими техническими требованиями, относительно дорогой, трудоемкой и потенциально влияет на активность сортируемых клеток13,14. Тем не менее, магнитно-активируемая сортировка клеток (MACS) более эффективна и удобна, с высокой скоростью восстановления и активностью клеток и меньшим воздействием на последующие приложения8. Поэтому в этом протоколе мы применили MACS для очистки CD34+ VW-SC и далее идентифицировали клетки с помощью проточной цитометрии. Создание методов выделения на основе MACS для изучения стволовых клеток сосудистой стенки было бы неоценимым. Во-первых, это позволяет проводить экспериментальные генетические и клеточные биологические исследования. Во-вторых, эффективное выделение и культивирование резидентных стволовых клеток сосудистой стенки позволяет проводить систематическую оценку и скрининг сигнальных факторов, регулирующих функции стволовых клеток. В-третьих, идентификация важнейших фенотипов в стволовых клетках обеспечивает важный «контроль качества» при оценке клеточного статуса. Таким образом, определение методов очистки может быть полезным для аналогичных применений к аналогичным стволовым клеткам, полученным из сосудов.

В этом отчете представлена подробная демонстрация стабильного и надежного метода культивирования CD34+ VW-SC, включая идентификацию клеток и функциональную оценку, выполненную с помощью проточной цитометрии, иммунофлуоресцентного окрашивания и измерения передачи сигналов Ca2+ . Данное исследование является основой для дальнейших углубленных исследований функции CD34+ VW-SC и их регуляторных механизмов при физиологических и патологических состояниях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование было одобрено, и с животными обращались в соответствии с Руководством по обращению с лабораторными животными и их использованию в Китае. Исследование строго соответствовало этическим требованиям экспериментов на животных, с одобрения Комитета по этике животных (номер одобрения: SWMU2020664). Для настоящего исследования были использованы восьминедельные здоровые мыши C57BL/6 любого пола с массой от 18 до 20 г. Животные были размещены в Центре лабораторных животных Юго-Западного медицинского университета (SWMU).

1. Культура блокады тканей адвентиции из аорты и брыжеечных артерий

  1. Резидентная изоляция CD34+ VW-SCs
    1. Обезболить двух мышей ингаляцией 3% изофлурана (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Подтвердить адекватную анестезию можно путем щипкования пальцев ног. Расположите мышь на спине с помощью медицинской ленты и распылите 70% этанол дезинфицирующим средством для дезинфекции шерсти мыши. Вскройте грудную и брюшную полости с помощью стерильных офтальмологических ножниц и щипцов, чтобы обнажить сердце и кишечник. После рассечения изолированных артерий аорты и брыжейки закрепите аорту и брыжеечное русло в чашке Петри, содержащей силиконовый эластомер и заполненной физиологическим раствором соли. С помощью другого набора стерилизованных ножниц и щипцов быстро удалите жир вокруг аорты и брыжеечных артерий.
    2. Перенесите рассеченные ткани в чашку Петри диаметром 6 см, содержащую 1% раствор пенициллин-стрептомицин-амфотерицина В (см. Таблицу материалов). После двукратного промывания перенесите артерии в капюшон для культуры тканей под стереомикроскопом.
    3. Разрежьте артерии в продольном направлении и с помощью тонких щипцов отклейте наружный слой аорты и первую ветвь брыжеечных артерий. Переложите внешние слои в чашку Петри диаметром 3,5 см, содержащую 0,1-0,2 мл питательной среды (см. Таблицу материалов). Внешние слои нарезать на мелкие кусочки (примерно 1 мм3).
    4. Переложите кусочки салфетки в колбу T25 с желатиновым покрытием, обеспечивая равномерное распределение по дну колбы. Соблюдайте умеренное расстояние между кусочками ткани, чтобы облегчить ползание и рост клеток. Поместите колбу вертикально в инкубатор (37 °C, 5%CO2) на 3 часа, чтобы тканевые блоки прилипли к дну колбы.
    5. Через 3 ч добавьте 5 мл питательной среды DMEM с высоким содержанием глюкозы, чтобы погрузить блоки тканей. Расположите колбу T25 горизонтально. Отслеживайте миграцию клеток вокруг тканевых блоков с помощью микроскопа с интервалом в 3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда должна содержать 20% фетальной бычьей сыворотки, 0,2% фактора ингибирования лейкемии (ЛИФ), 0,2 мМ β-меркаптоэтанола и 1% пенициллин/стрептомицин (см. Таблицу материалов). Фетальная бычья сыворотка поддерживает пролиферацию клеток, в то время как LIF и β-меркаптоэтанол препятствуют дифференцировке клеток 7,8.
    6. Когда клетки в колбе Т25 достигают примерно 80% конфлюенции, пассируют и культивируют их в одну или две колбы Т75. Субкультивирование клеток над пятью ходами для обеспечения правильного роста и здоровья.
  2. Магнитная сепарация резидентных CD34+ стволовых клеток
    1. Когда клетки в одной или двух колбах T75 достигнут 80% конфлюенции, диссоциируйте клетки с помощью трипсина и ресуспендируйте их в 1 мл сортировочного буфера (2 мМ ЭДТА и 0,5% FBS). Определите номер ячейки (колба10 7/T75) и центрифугируйте клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 минут (при комнатной температуре).
    2. Полностью отбраковать надосадочную жидкость и повторно суспендировать клеточную гранулу в 98 мкл сортировочного буфера на10-7 клеток. Добавьте 2 мкл антитела к CD34 (см. Таблицу материалов). Хорошо перемешайте и выдерживайте в течение 30 минут при температуре 4°C в темноте, периодически встряхивая.
    3. Промойте ячейки, добавив 2 мл сортировочного буфера, и центрифугируйте при 300 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.
    4. Осторожно и полностью удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте клетки в 80 мкл сортировочного буфера.
    5. Добавьте в буфер 20 μL Anti-FITC MicroBeads (на 107 всего ячеек, см. Таблицу материалов). Хорошо перемешать с помощью повторяющегося пипетирования и выдерживать в течение 15 минут при температуре 4 °C в темноте с периодическим встряхиванием.
    6. Дважды промойте ячейки, добавив 2 мл буфера, и центрифугируйте при 300 х г в течение 5 минут для репелляции ячеек. Полностью откажитесь от надосадочной жидкости и снова суспендируйте клетки в 1 мл буфера.
    7. Поместите одну колонку MS в магнитное поле соответствующего сепаратора, убедившись, что под колонной MS размещена сборная трубка (например, центрифужная трубка объемом 15 мл) для сбора отделенных компонентов. (см. Таблицу материалов). Промойте колонку буфером объемом 500 мкл и подождите, пока она полностью пройдет.
    8. Загрузите суспензию ячеек в колонку и соберите проточный ток, содержащий немеченые клетки, в пробирку объемом 15 мл.
    9. Снимите колонку с сепаратора и поместите ее на новую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Введите 500 мкл буфера в колонку, затем быстро промойте ячейки с магнитной меткой, протолкнув поршень в колонку.
    10. Для повышения чистоты CD34+ клеток элюированная фракция может быть обогащена с использованием второй MS-колонки. Повторите процесс разделения, как упоминалось выше. Оцените чистоту отсортированных клеток с помощью проточной цитометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, получают 10%-20% CD34+ клеток, около 70%-80% отрицательных клеток и примерно 10% потерь из-за окрашивания и процедур центрифуги.
    11. Для дальнейшего подтверждения чистоты CD34+ стволовых клеток сосудистой стенки необходимо идентифицировать отсортированные клетки методом проточной цитометрии. Настоящее исследование показало чистоту более 90%.

2. Идентификация клеток методом иммунофлюоресценции

  1. Семенные ячейки на покровных стеклах (диаметр 8 мм) предварительно покрыты 0,04% желатином.
  2. Когда слияние клеток достигнет примерно 60%-70%, дважды промойте PBS и зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом на 10 минут.
  3. Промойте клетки PBS в течение 3 минут (3 раза) и пропитайте клетки 0,2% Triton X-100 (в PBS) в течение 5 минут при комнатной температуре.
  4. Промойте клетки PBS в течение 3 мин (3 раза) и блокируйте неспецифическое связывание антител с 5% сывороткой осла (в PBS) на 1 ч.
  5. Снимите блокирующий буфер, удерживая каждый покровный лист на его краю щипцами и сливая его на лист безворсовой салфетки.
  6. Инкубируйте клетки в 100 раз разбавленных первичных антителах (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, см. Таблицу материалов) в 1% BSA (в PBS) в течение ночи при 4 °C.
  7. Сцедите раствор и промойте ячейки PBS в течение 3 мин (3 раза). Инкубируйте клетки с меченым Alexa Fluor 488 вторичным антителом (1:200 в 1% BSA) (см. Таблицу материалов) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
  8. Выполните противодействие DAPI путем разведения стокового раствора DAPI до 0,5 мкг/мл в PBS и инкубации клеток в течение 5 мин.
  9. Промойте PBS и запечатайте покровные стекла реагентом, препятствующим выцветанию. Захватывайте изображения под лазерным сканирующим конфокальным микроскопом.

3. Индуцированная дифференцировка и характеризация CD34+ VW-SC

  1. Засейте стволовые клетки CD34+ с соответствующей плотностью (40%-50% конфлюенции) на покровных листах и 6-луночных планшетах соответственно.
  2. Индуцировать эндотелий, ориентированную на клетки дифференцировки из клеток CD34+ путем культивирования клеток в среде для культивирования эндотелиальных клеток EBM-2 (см. Таблицу материалов) в течение 1 недели.
  3. Индуцировать клеточную дифференцировку фибробластов из CD34+ клеток путем культивирования клеток в среде для культивирования фибробластов FM-2 (см. Таблицу материалов) в течение 3 дней.
  4. Подвергайте недифференцированные и дифференцированные клетки иммунофлуоресцентному окрашиванию (как упоминалось на шаге 2) при лазерном возбуждении 488 нм и 40-кратном объективе. Определите экспрессию маркеров эндотелиальных клеток (CD31, VWF) и маркеров фибробластных клеток (PDGFRα, Vimentin) (см. Таблицу материалов).
  5. Диссоциируйте клетки с помощью трипсина и получите клеточную гранулу центрифугированием (300 х г, 5 мин, комнатная температура). Ресуспендируйте ячейки с помощью 100 μл сортировочного буфера. Предварительно инкубируют клеточную суспензию с очищенным антимышиным CD16/CD32 mAb (1 мкг) (см. Таблицу материалов) при 4 °C в течение 5 мин.
  6. Добавьте 2 мкл PE Rat anti-Mouse CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) Monoclonal Anti-Mouse APC (2 мкл, 1:50) и CD140a (PDGFRa) Monoclonal Anti-Mouse FITC (2 мкл, 1:50) непосредственно в предварительно инкубированные клетки в присутствии мышиного Fc Block и далее инкубируйте при 4 °C в течение 15 мин.
  7. Промойте клетки дважды, добавив 2 мл буфера, и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут (комнатной температуры) для повторного гранулирования клеток. Полностью выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 300 мкл буфера. Поместите проточные трубки с окрашенными клетками в холодильник, готовый к проточной цитометрии.

4. Обнаружение внутриклеточной передачи сигналов Ca2+ в сосудистых CD34+ стволовых клетках

  1. Семенные клетки на покровных листах за 10 ч до экспериментов при плотности до 70% слияния.
  2. Достаньте покровные стекла и прикрепите их ко дну специальной камеры с любым вазелином.
  3. Промойте покровные стекла один раз PBS, замените на Фура-2/АМ (5 мкМ) в растворе Тироде (NaCl 137 мМ, KCl 5,4 мМ, MgCl2 1,2 мМ, глюкоза 10 мМ, HEPES 10 мМ, CaCl2 2,4 мМ) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте клетки в течение 30 мин в темноте.
  4. Удалите краситель, обработав его раствором Tyrode в течение 10 минут, чтобы обеспечить деэтерификацию фура-2/AM.
  5. Установите камеру на предметный столик инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащенного широкоугольной системой визуализации, содержащей монохроматор и ПЗС-камеру (см. Таблицу материалов).
  6. Откройте главное окно, перейдите в диалоговое окно «Настройки захвата » и страницу камеры и нажмите кнопку «В реальном времени » для отображения изображения в реальном времени .
  7. Выберите тип флуоресцентного изображения, установите время повторения петли 340 нм/380 нм, размер изображения и время экспозиции камеры на длинах волн 380 нм и 340 нм для достижения оптимальной яркости изображения.
  8. Сделайте отдельные снимки и нарисуйте несколько линий от руки, чтобы обвести ячейки разными цветами и заранее определить область интересов (ROI), обозначив фон как ROI 0.
  9. Повторно отредактируйте уже внедренный протокол в представлении рабочей области и создайте новую рабочую область.
  10. Выполните протокол, и "Флуоресценция 340 нм div Флуоресценция 380 нм (живая кинетика)" отобразит онлайн-кинетический график.
  11. В числовом представлении будет видна электронная таблица, представляющая столбцы значений в оттенках серого и соответствующую информацию о времени. Экспортируйте данные таблицы с помощью буфера обмена.
  12. Рассчитайте F340 нм/F380 нм с указанием внутриклеточных измененийCa2+ после вычитания фоновой флуоресценции (ROI 0).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Выделение и очистка CD34+ VW-SC
Высокая чистота CD34+ VW-SC достигается в результате адвентиции аорты и брыжеечной артерии мыши путем прикрепления тканей и магнитной сортировки микрогранул. Процент CD34+ клеток в стенке сосуда обычно составляет 10%-30%. Проточная цитометрия подтверждает, что чистота CD34+ клеток, полученных методом магнитной сортировки шариков, составляет более 90% (рисунок 1А). Клеточное иммунофлуоресцентное ок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это исследование обеспечивает быстрый и удобный метод получения функциональных CD34+ VW-SC из аорты и брыжеечных артерий мышей. CD34+ VW-SC, полученные этим методом, обладают пролиферативной активностью и свойствами разнонаправленной дифференцировки. Трифосфатинозитол-1,4,5-трифосфатные рецепторы (IP3Rs), рианодиновые рецепторы (RyR) и накопительные кальциевые каналы опосредуют высвобождение и поступление Ca2+ в CD34+ VW-SC. Создание этой методики заложит основу для ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа финансировалась за счет грантов Национального фонда естественных наук Китая (No 82070502, 31972909, 32171099), Сычуаньской научно-технической программы провинции Сычуань (23NSFSC0576, 2022YFS0607). Авторы хотели бы поблагодарить Цинбо Сюя из Чжэцзянского университета за помощь в создании клеточной культуры, а также выражают признательность за научную и техническую помощь платформы проточной цитометрии в Юго-Западном медицинском университете.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2% раствор желатинаSigmaG1393
Anti-CD31 антителаR& DAF3628
Anti-CD34 антителоAbcamab81289
Anti-c-kit антителоCST77522
Anti-FITC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-048-701 
Anti-FITC MicroBeads MACSMiltenyi Biotec130-048-701
Anti-Flk- 1 антителоAbcamab24313
Anti-Ki67 антителоCST34330
Anti-PDGFRα антителоAbcamab131591
Anti-Sca-1 антителоInvitrogen710952
CD140a (PDGFRA) моноклональное Антитела (APA5), FITCeBioscience   Моноклональное антитело Invitrogen11-1401-82
CD31 (PECAM-1) (390), APCeBioscience  Invitrogen17-0311-82
CD34 антитело, против мыши, FITC, REAfinity Clone REA383Miltenyi Biotec130-117-775
капюшон для клеточных культурJIANGSU SUJING GROUP CO., LTD Центрифуга SW-CJ-2FD
  ЦЕНС   L530
CO2  Инкубаторы                       Thermofisher Scientific4111
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Zeiss Zeiss 980   
Среда с высоким содержанием глюкозы DMEMATCC30-2002
EBM-2 питательная средаLonzaCC-3162
FACSМелоди   BD Biosciences
FACSМелоди&торговля; Система  BD
Фетальная бычья сывороткаMilliporeES-009-C
FM-2 питательная средаScienCell2331
Fura-2/AM InvitrogenM1292
козье анти-кроличьи антитела IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции, Alexa Fluor Plus 488  Thermofisher Scientific     A32731
Фактор ингибирования лейкемииMilliporeLIF2010
микроскоп OlympusIX71
MiniMACS    Пусковой наборMiltenyi Biotec130-090-312
Пенициллин-стрептомицин-амфотерицин B растворBeyotimeC0224
очищенный крысиный антимышиный CD16/CD32 (мышиный блок BD fc)BD Pharmingen553141
стереомикроскопа OlympusSZX10 
Программа TILLvisION 4.0   T.I.L.L.Photonics GmbHполихромная V 
Моноклональное антитело VWF (F8/86)Thermofisher Scientific  MA5-14029
β-МеркаптоэтанолThermofisher Scientific21985023

Ссылки

  1. Hu, Y., et al. Abundant progenitor cells in the adventitia contribute to atherosclerosis of vein grafts in ApoE-deficient mice. J Clin Invest. 113 (9), 1258-1265 (2004).
  2. Jiang, L., et al. Nonbone marrow CD34+ cells are crucial for endothelial repair of the injured artery. Circ Res. 129 (8), e146-e165 (2021).
  3. Tamma, R., Ruggieri, S., Annese, T., Ribatti, D. Vascular wall as a source of stem cells able to differentiate into endothelial cells. Adv Exp Med Biol. 1237, 29-36 (2020).
  4. Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key soxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
  5. Zhang, L., Issa Bhaloo, S., Chen, T., Zhou, B., Xu, Q. Roles of stem cells in vascular remodeling. Chin J Cell Biol. 43 (7), 1352-1361 (2021).
  6. Zhang, L., et al. Role of resident stem cells in vessel formation and arteriosclerosis. Circ Res. 122 (11), 1608-1624 (2018).
  7. Wu, Y., et al. Effects of estrogen on growth and smooth muscle differentiation of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells. Atherosclerosis. 240 (2), 453-461 (2015).
  8. Tang, J. M., et al. Isolation and culture of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells. Cardiol Plus. 4 (4), 116-120 (2019).
  9. Sukumaran, P., et al. Calcium signaling regulates autophagy and apoptosis. Cells. 10 (8), 2125(2021).
  10. van der Sanden, B., Dhobb, M., Berger, F., Wion, D. Optimizing stem cell culture. J Cell Biochem. 111 (4), 801-807 (2010).
  11. Rotmans, J. I., et al. In vivo, cell seeding with anti-CD34 antibodies successfully accelerates endothelialization but stimulates intimal hyperplasia in porcine arteriovenous expanded polytetrafluoroethylene grafts. Circulation. 112 (1), 12-18 (2005).
  12. Qu, R., et al. The role of serum amyloid A1 in the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells basing on single-cell RNA sequencing analysis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 187(2022).
  13. Flynn, J., Gorry, P. Flow Cytometry Analysis to Identify Human CD8+ T Cells. Methods Mol Biol. 2048, 1-13 (2019).
  14. Bacon, K., Lavoie, A., Rao, B. M., Daniele, M., Menegatti, S. Past, present, and future of affinity-based cell separation technologies. Acta Biomater. 112, 29-51 (2020).
  15. Ma, H. G., Liu, H. Q., Liu, S. D., Tang, Y. Y. Primary culture and identification of rat glomerular microvascular endothelial cells. Acta Physiol Sin. 73 (6), 926-930 (2021).
  16. Liu, W. H., Wang, P., Yang, J. Isolation, culture and identification of rats hair follicle neural crest stem cells. Chin J Neuroanat. 35 (2), 207-211 (2019).
  17. Kumar, P., Garg, N. Flow cytometry approaches to obtain medulloblastoma stem cells from bulk cultures. Methods Mol Biol. 2423, 87-94 (2022).
  18. Haroon, M. M., Vemula, P. K., Palakodeti, D. Flow cytometry analysis of planarian stem cells using DNA and mitochondrial dyes. Bio Protoc. 12 (2), e4299(2022).
  19. Catchpole, T., Nguyen, T. D., Gilfoyle, A., Csaky, K. G. A profile of circulating vascular progenitor cells in human neovascular age-related macular degeneration. PLOS One. 15 (2), e0229504(2020).
  20. Wang, G., Yu, G., Wang, D., Guo, S., Shan, F. Comparison of the purity and vitality of natural killer cells with different isolation kits. Exp Ther Med. 13 (5), 1875-1883 (2017).
  21. Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. Consortium SI. Isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PLOS One. 14 (3), e0213832(2019).
  22. Jiang, L. H., Mousawi, F., Yang, X., Roger, S. ATP-induced Ca2+-signalling mechanisms in the regulation of mesenchymal stem cell migration. Cell Mol Life Sci. 74 (20), 3697-3710 (2017).
  23. Ong, H. L., Subedi, K. P., Son, G. Y., Liu, X., Ambudkar, I. S. Tuning store-operated calcium entry to modulate Ca2+-dependent physiological processes. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1037-1045 (2019).
  24. Garcia-Carlos, C. A., et al. Angiotensin II, ATP and high extracellular potassium induced intracellular calcium responses in primary rat brain endothelial cell cultures. Cell Biochem Funct. 39 (5), 688-698 (2021).
  25. Reggiani, C. Caffeine as a tool to investigate sarcoplasmic reticulum and intracellular calcium dynamics in human skeletal muscles. J Muscle Res Cell Motil. 42 (2), 281-289 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD34

Похожие статьи