В настоящем протоколе описывается оптимизированная 3D-система индукции нейронной сетчатки, которая снижает адгезию и слияние органоидов сетчатки с высокой повторяемостью и эффективностью.
Методическая статья
* These authors contributed equally
В настоящем протоколе описывается оптимизированная 3D-система индукции нейронной сетчатки, которая снижает адгезию и слияние органоидов сетчатки с высокой повторяемостью и эффективностью.
Ретинопатия является одной из основных причин слепоты во всем мире. Исследование ее патогенеза имеет важное значение для ранней диагностики и своевременного лечения ретинопатии. К сожалению, этические барьеры препятствуют сбору доказательств от людей. Недавние многочисленные исследования показали, что плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) могут быть дифференцированы в органоиды сетчатки (РО) с использованием различных протоколов индукции, которые имеют огромный потенциал в ретинопатии для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и терапии на основе стволовых клеток. В этом исследовании описывается оптимизированный протокол индукции для генерации нейронной сетчатки (NR), который значительно снижает вероятность везикуляции и слияния, увеличивая вероятность успеха продукции до 60-го дня. Основываясь на способности ПСК к самореорганизации после диссоциации, в сочетании с определенными комплементарными факторами, этот новый метод может специфически стимулировать дифференцировку NR. Кроме того, этот подход является несложным, экономически эффективным, демонстрирует значительную повторяемость и эффективность, представляет обнадеживающие перспективы для персонализированных моделей заболеваний сетчатки и обеспечивает обильный резервуар клеток для таких применений, как клеточная терапия, скрининг лекарств и тестирование генной терапии.
Глаз служит основным источником информации среди органов чувств человека, а сетчатка является основной зрительной сенсорной тканью в глазах млекопитающих1. Ретинопатия является одной из основных глобальных причин заболеваний глаз, приводящих к слепоте2. Около 2,85 миллиона человек во всем мире страдают от различных степеней нарушения зрения, вызванных ретинопатией3. Следовательно, изучение его патогенеза имеет решающее значение для ранней диагностики и своевременного лечения. Большинство исследований ретинопатии человека были в основном сосредоточены на животных моделях
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Данное исследование было проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено Комитетом по институциональной этике Китайской больницы общего профиля НОАК. Линейка ESC WA09 (H9) была получена от научно-исследовательского института WiCell.
1. Приготовление питательных сред и реагентов
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Графический обзор модифицированного протокола показан на рисунке 1. H9-ESC использовались для генерации RO, когда клетки были выращены до плотности 70%-80%. Одноячеистые суспензии H9-ESC в 96 конических лунках с V-образным дном агрегировались в 1-й день и к 6-м суткам образовывали хорошо очерченные круглые ЭБ. По мере увеличения времени культивирования объем БЭ постепенно увеличивался. На 30-е сутки отчетливо сформировались и утолщены нейроэпителиальные структуры при длительной дифференциров.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Человеческие ОР могут пространственно и во времени повторять развитие сетчатки плода, а ранние ОР демонстрируют высокую степень сходства с сетчаткой плода на эквивалентных стадиях развития15. С точки зрения морфологии тканей и молекулярной экспрессии, человеческий обратный осмос, точно отражает фактический статус роста ткани сетчатки, предоставляя огромные и беспрецедентные возможности в области моделирования заболеваний, скрининга лекарств и регенеративной медицины. В настоящее время разработано .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,01 м TPBS | Servicebio | G0002 | Промывка ломтиков |
| 4% Параформальдегид | Servicebio | G1101-500ML | Фикс органоидов сетчатки |
| 5 мл Пастеровская пипетка | NEST Biotechnology | 318516 | Пипетка ретинальных органоидов |
| 96 V-образных конических лунок | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Адгезионный микроскоп Слайды | CITOTEST | 188105 | Фиксированные срезы |
| AggreWell средний | STEMCELL Technologies | 5893 | Средний |
| безводный этанол | SINOPHARM | 10009218 | Обезвоживание |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Первичное антитело |
| Anti-Fade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Первичное антитело |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Первичное антитело |
| Anti-NEURONAL Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Первичное антитело |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Первичное антитело |
| Раствор для диссоциации клеток (CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Диссоциация клеток |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β ингибитор |
| холестерина Липидный концентрат | Gibco | 12531018 | 250&раз; |
| Раствор для извлечения цитратного антигена | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | Технологии стволовых клеток | 1001061 | Среда для замораживания клеток |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Ядерное противопятно |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Вторичное антитело |
| Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Вторичное антитело |
| Этилендиамин Тетрауксусная кислота (ЭДТА) | Biosharp | BL518A | 0,5 M, pH 8,0, диссоциация клеток |
| Внеклеточный матрикс (ECM) | Пластины для | покрытия | 354277 |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Сыворотка |
| крупного рогатого скота среднего размера плода | Gibco | A5669701 | |
| Количественный анализатор клеток тканей | TissueGnostics TissueFAXS | Plus | Срезы |
| сканирования IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-ингибитор |
| Нокаут Замена сыворотки | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-ингибитор |
| 24-луночные пластины с низкой адгезией Corning | 3473 | ||
| Низкоадгезионные 6-луночные пластины | Corning | 3471 | |
| Поддерживающая среда (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Добавка |
| Medium N2 | Gibco | 17502048 | |
| Нормальная сыворотка осляка | Solarbio | SL050 | Блокирующий буфер |
| Paraplast | Leica | 39601006 | встраивание в ткани |
| PBS pH 7.4 основной (1x) | Gibco | C10010500BT | без Ca+,Mg+ |
| реконбинантный морфогенетический белок человеческой кости-4(rhBMP4) | R& D | 314-BP | Ключевой белковый фактор |
| Ретиноевая кислота | Sigma | R2625 | Порошок, хранить вдали от света |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-ингибитор |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Ингибитор тирозинкиназы |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Таурин | Sigma | T0625-10G | |
| Тиоглицерин | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Пермеабилизация |
| WA09 линия эмбриональных стволовых клеток | WiCell Research Institute | Клеточная линия | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | депарафинизация |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-ингибитор |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение