Методическая статья

Генерация нейронной сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66246

⸱

22 декабря 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese PLA, 2Senior Department of Ophthalmology, The Third Medical Center of Chinese PLA General Hospital, 3Stem Cell and Regenerative Medicine Lab, Beijing Institute of Radiation Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем протоколе описывается оптимизированная 3D-система индукции нейронной сетчатки, которая снижает адгезию и слияние органоидов сетчатки с высокой повторяемостью и эффективностью.

Аннотация

Ретинопатия является одной из основных причин слепоты во всем мире. Исследование ее патогенеза имеет важное значение для ранней диагностики и своевременного лечения ретинопатии. К сожалению, этические барьеры препятствуют сбору доказательств от людей. Недавние многочисленные исследования показали, что плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) могут быть дифференцированы в органоиды сетчатки (РО) с использованием различных протоколов индукции, которые имеют огромный потенциал в ретинопатии для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и терапии на основе стволовых клеток. В этом исследовании описывается оптимизированный протокол индукции для генерации нейронной сетчатки (NR), который значительно снижает вероятность везикуляции и слияния, увеличивая вероятность успеха продукции до 60-го дня. Основываясь на способности ПСК к самореорганизации после диссоциации, в сочетании с определенными комплементарными факторами, этот новый метод может специфически стимулировать дифференцировку NR. Кроме того, этот подход является несложным, экономически эффективным, демонстрирует значительную повторяемость и эффективность, представляет обнадеживающие перспективы для персонализированных моделей заболеваний сетчатки и обеспечивает обильный резервуар клеток для таких применений, как клеточная терапия, скрининг лекарств и тестирование генной терапии.

Введение

Глаз служит основным источником информации среди органов чувств человека, а сетчатка является основной зрительной сенсорной тканью в глазах млекопитающих1. Ретинопатия является одной из основных глобальных причин заболеваний глаз, приводящих к слепоте2. Около 2,85 миллиона человек во всем мире страдают от различных степеней нарушения зрения, вызванных ретинопатией3. Следовательно, изучение его патогенеза имеет решающее значение для ранней диагностики и своевременного лечения. Большинство исследований ретинопатии человека были в основном сосредоточены на животных моделях 4,5,6. Однако сетчатка человека представляет собой сложную, многослойную ткань, состоящую из различных типов клеток. Традиционные двумерные (2D) системы клеточных культур и животных моделей, как правило, не в состоянии точно воспроизвести нормальное пространственно-временное развитие и метаболизм лекарств в сетчатке естественного человека 7,8.

В последнее время технологии 3D-культивирования позволяют создавать тканеподобные органы из плюрипотентных стволовых клеток (ПСК)9,10. Органоиды сетчатки (РО), полученные из человеческих ПСК в системе 3D-суспензионных культур, не только содержат семь типов клеток сетчатки, но и демонстрируют отчетливую стратифицированную структуру, аналогичную сетчатке человека in vivo 11,12,13. ОО, полученные из ПСХ человека, завоевали популярность и широкую доступность и в настоящее время являются лучшими моделями in vitro для изучения развития и заболевания сетчатки человека14,15. За последние несколько десятилетий многочисленные исследователи продемонстрировали, что человеческие ПСК, включая эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), могут дифференцироваться в ОО с помощью различных протоколов индукции. Эти достижения обладают огромным потенциалом в ретинопатии для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и терапии на основе стволовых клеток 16,17,18.

Однако генерация нервной сетчатки (НР) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) является сложным, громоздким и трудоемким процессом. Кроме того, вариации тканевых органоидов от партии к партии могут привести к снижению воспроизводимости результатов19,20. Многочисленные внутренние и внешние факторы могут влиять на выход органоидов сетчатки (РО), такие как количество или виды исходных клеток и использование транскрипционных факторов и низкомолекулярных соединений 21,22,23. С тех пор, как в лаборатории Сасаи был создан первый человеческий ОО11, на протяжении многих лет было предложено множество модификаций для повышения простоты и эффективности процесса индукции 13,21,24,25. К сожалению, на сегодняшний день не установлено золотого стандарта для получения ПВ во всех лабораториях. Действительно, существует определенная степень расхождения в ОК в результате различных методов индукции, а также широкий разброс экспрессии маркеров сетчатки и надежности их структуры22,26. Эти проблемы могут серьезно осложнить сбор образцов и интерпретацию результатов исследования. Таким образом, необходим более консолидированный и надежный протокол дифференциации для достижения максимальной эффективности при минимальной гетерогенности генерации обратного осмоса.

В этом исследовании описывается оптимизированный протокол индукции, основанный на комбинации Kuwahara et al.12 и Döpper et al.27 с подробными инструкциями. Новый метод значительно снижает вероятность органоидной везикуляции и слияния, повышая успешность генерации НР. Эта разработка имеет большие перспективы для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и клеточной терапии при заболеваниях сетчатки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данное исследование было проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено Комитетом по институциональной этике Китайской больницы общего профиля НОАК. Линейка ESC WA09 (H9) была получена от научно-исследовательского института WiCell.

1. Приготовление питательных сред и реагентов

  1. Питательная среда для ЭСК человека и раствор для пассажа
    1. Поддерживающая среда (ММ): Приготовьте 500 мл полного ММ (базальная среда + 5-кратное дополнение; см. Таблицу материалов) асептически. Разморозьте добавку 5 раз при комнатной температуре (RT) или на ночь при температуре 2-8 °C. Подогрейте до RT. Хорошо перемешайте перед использованием, пока добавка не перестанет мутнеть.
    2. 1% внеклеточный матрикс (ВКМ): Используйте предварительно охлажденный наконечник пипетки и стерильные пробирки для дозирования 200 мкл ВКМ (см. Таблицу материалов) на пробирку на льду. Храните пробирки в морозильной камере при температуре -20 °C. Растопите ECM на льду и разбавьте предварительно охлажденным DMEM/F12 в соотношении 1:100.
    3. 0,5 мМ рН = 8,0 ЭДТА: Чтобы приготовить 500 мл 0,5 мМ ЭДТА, добавьте 500 мкл 0,5 М ЭДТА и 0,9 г NaCl к 500 мл 1x фосфатно-солевого буфера (DPBS) Dulbecco (см. Таблицу материалов). Тщательно перемешайте и храните при температуре 2-8 °C.
  2. Дифференцировочная среда сетчатки
    1. Химически определенная среда без фактора роста (gfCDM): Приготовьте gfCDM, смешав 45% модифицированного среднего GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX) от Iscove, 45% F12-GlutaMAX (F12-Glutamax) от Ham, 10% заменителя нокаутной сыворотки (KSR), 1% концентрата холестериновых липидов и 450 мкМ тиоглицерина (см. Таблицу материалов).
  3. Низкомолекулярные соединения
    1. Y-27632 2HCl: добавьте 50 мг порошка Y-27632 к 3,122 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Дозируйте и храните Y-27632 (см. Таблицу материалов) в концентрации 50 мМ при -80 °C в течение 2 лет, вдали от света. Разбавьте буфет в 2 500 раз (20 мкМ) для использования, что эквивалентно 0,4 мкл Y-27632 на мл gfCDM.
    2. IWR1-endo: Добавьте 2,4424 мл ДМСО для растворения 10 мг IWR1-эндо (см. Таблицу материалов) для получения исходного раствора 10 мМ. Дозируйте аликвоты и храните их при температуре -80 °C до 2 лет. Добавьте 0,3 мкл 10 мМ IWR1-эндо на мл gfCDM для концентрации 3 мкМ для индукции.
    3. SB431542: Для приготовления 50 мМ SB431542 добавьте 10 мг SB431542 (см. таблицу материалов) к 0,5203 мл ДМСО и тщательно перемешайте. Хранить при температуре -80 °C в растворителе не более 2 лет. Для приготовления SB431542 при рабочей концентрации 10 мкМ добавляют 2 мкл исходного раствора 50 мМ к 10 мл гфМДМ.
    4. LDN-193189 2HCl: Растворите 5 мг LDN-193189 2HCl (см. таблицу материалов) в 10,4297 мл DMSO, чтобы получить 1 мМ исходного раствора. Хранить при температуре -20 °C или -80 °C (в соответствии с рекомендациями производителя). Добавьте 0,1 мкл материала на каждые 10 мл gfCDM, в результате чего получится 100 нМ LDN-193189 для индукции.
    5. Рекомбинантный костный морфогенетический белок человека 4 (BMP4): восстанавливается при концентрации 50-200 мкг/мл в 4 мМ HCl (см. таблицу материалов). Хранить при температуре от 2 °C до 8 °C в течение 1 месяца или -20 °C в течение 1 года после восстановления. Выполните индукцию NR с помощью BMP4 1,5 нМ.
  4. Питательная среда с длительным сроком действия NR
    1. Ретиноевая кислота (РА): Отмерьте 6 мг порошка РА (см. Таблицу материалов) и добавьте к 3,9941 мл ДМСО. Хранить в аликвотах по 5 мМ при −80 °C и использовать в течение 3 месяцев. Для достижения рабочей концентрации 0,5 мкМ добавьте 10 мкл мастер-смеси к 100 мл среды для дифференцировки нервной сетчатки (NRDM). Добавляйте непосредственно перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите вдали от света во время приготовления и хранения.
    2. Таурин: Добавьте порошок таурина (см. Таблицу материалов) массой от 200 мг до 7,9904 мл ДМСО для получения исходного раствора 200 мМ. Дозировать и хранить при температуре 2-8 °C. Рабочая концентрация таурина 0,1 мМ достигается путем добавления 50 мкл исходного раствора на 100 мл NRDM.
    3. NRDM: Составьте NRDM с DMEM/F12-GlutaMAX medium, 1% добавкой N2, 10% фетальной бычьей сывороткой, 0,5 мМ RA и 0,1 мМ таурина (см. Таблицу материалов). Хранить при температуре 2-8 °C до 2 недель или 6 месяцев при -20 °C, чтобы обеспечить активность компонентов.
  5. Блокирующий буфер: Разбавьте 1:9 DPBS до получения 10% рабочего раствора для использования (см. Таблицу материалов). Хранить при температуре -20 °C до 5 лет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все остальные процедуры в шкафу биобезопасности класса II для обеспечения стерильности, за исключением взвешивания. Если в процессе приготовления необходимо добавлять взвешенные реагенты, используйте фильтры 0,22 мкм для фильтрации.

2. Культивирование H9-ESC

  1. Размораживание H9-ESC
    1. Добавьте 1 мл 1% ECM в каждую лунку 6-луночного планшета. Инкубируют в течение 1 ч в инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5%CO2 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте добавления ECM вдоль стенок скважины, так как он может прилипнуть к поверхности.
    2. Возьмите криовиальный запас H9-ESC из резервуара с жидким азотом и быстро встряхните его в воде с температурой 37 °C в течение 30 секунд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте полного оттаивания флакона.
    3. Извлеките флакон и тщательно простерилизуйте его с помощью 75% дезинфицирующего спиртового спрея. Добавьте размороженный H9-ESC из криовиала в пробирку объемом 15 мл, содержащую 9 мл ММ с 10 мкМ Y-27632.
    4. Центрифугируйте пробирку при 190 × г в течение 5 мин при RT. Осторожно удалите большую часть надосадочной жидкости пипеткой объемом 1 мл, оставив примерно 50 мкл надосадочной жидкости, чтобы избежать потери клеток.
    5. Добавьте 1 мл MM, содержащего 10 мкМ Y27632, в клеточный осадок и осторожно ресуспендируйте клеточный осадок с помощью пипетки объемом 1 мл, пипетируя вверх и вниз 5-10 раз.
    6. Снимите покрытие ECM через 1 ч инкубации. Добавьте в каждую лунку по 2 мл предварительно подогретого ММ, содержащего 10 мкМ Y-27632.
    7. Дозируйте 0,5 мл клеточной суспензии на лунку. Аккуратно встряхните пластину в стороны, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
    8. Инкубируйте планшет при 37 °C при 5%CO2 не менее 24 ч, не прикасаясь к нему.
    9. Меняйте носитель ежедневно. Когда плотность клонов достигает 70% и выше, требуется пассаж.
  2. Передача H9-ESC
    1. Подготовьте пластину с ECM-покрытием, как описано выше (шаг 2.1.1), и добавьте 2 мл MM на лунку.
    2. Извлеките отработанную среду из 6-луночных планшетов. Промойте каждую лунку дважды 1 мл DPBS.
    3. Промойте каждую лунку дважды, медленно добавляя 1 мл ЭДТА, и инкубируйте с 1 мл ЭДТА в течение 4-7 мин при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инкубации исследуйте 6-луночный планшет в течение 3 мин под микроскопом. Немедленно переходите к следующему шагу, если большинство клеток близки к отделению от чашки. Избегайте длительной инкубации, чтобы уменьшить негативное воздействие на клетки.
    4. Откажитесь от ЭДТА и добавьте 1 мл ММ, чтобы прервать пищеварение.
    5. Осторожно постучите по пластине лунки, пока большинство ячеек не отсоединится.
    6. Осторожно переложите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 5 мл. Осторожно суспендируйте колонии H9-ESC вверх и вниз 3-5 раз, чтобы перемешать их с пастеровской питеткой. Перенесите 20-100 мкл клеточной суспензии в новую 6-луночную чашку для культивирования, покрытую ECM, и встряхните ее вперед и назад.
    7. Когда плотность клеток будет признана достаточной под микроскопом, инкубируйте планшет при 37 °C при 5%CO2 не менее 24 ч, не прикасаясь к нему.
    8. Меняйте носитель ежедневно. При плотности клонов 70% и выше требуется пассаж.

3. Генерация НР человека

Примечание: Как только колонии достигнут примерно 70% слияния, они могут быть направлены на дифференцировку в органоиды сетчатки (RO) с помощью процедурных шагов, описанных на рисунке 1.

  1. День 0 - Формирование эмбриоидного тельца (БЭ)
    1. После промывки клеток 2 мл DPBS добавляют в лунку 0,5 мл CDS (см. таблицу материалов), содержащего 20 мкМ Y27632. Инкубируют в течение 3 мин при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%СО2 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте под микроскопом. Максимально сократите время инкубации, чтобы избежать вредного воздействия на клетки.
    2. Прервите разложение, добавив 3 мл ММ, содержащего 20 мкМ Y27632. Центрифугу при 190 × г в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
    3. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл gfCDM, содержащей 20 мкМ Y27632, и подсчитайте количество клеток. Добавьте соответствующий объем для 1,2 × 106 ячеек (1,2 × 104 ячеек на лунку) к 10 мл gfCDM, предварительно включенной в 20 мкМ Y-27632, 3 мкМ IWR1-эндо, 10 мкМ SB431542 и 100 нМ LDN-193189 (см. таблицу материалов).
    4. Добавьте 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку из 96 конических лунок с V-образным дном. Поместите планшет в увлажненный инкубатор с 5%СО2 до 6-го дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемещайте посуду в течение как минимум 24 часов, чтобы улучшить соблюдение ЭБ.
  2. День 6 - Индукция сетчатки
    1. На 6-й день добавьте 10 мл gfCDM, содержащего 55 нг/мл BMP4, чтобы обеспечить полную смену питательной среды на ЭБ. Верните тарелку в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приложите пипетку к стенкам конического колодца с V-образным дном 96, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Избегайте попадания органоидов при смене среды.
    2. Проводите полусреднюю смену на 9-й, 12-й и 15-й день. Замените половину среды свежим gfCDM, чтобы постепенно разбавить BMP4.
  3. День 18 - Долгосрочная культура NR
    1. На 18-й день осторожно переложите сформированные БЭ в центрифужные пробирки объемом 15 мл с помощью пастеровских пипеток объемом 5 мл и снова осторожно промойте NRDM. Перенесите ЭБ на 6-луночные или 24-луночные планшеты с низкой адсорбцией (см. таблицу материалов). Верните тарелку в инкубатор.
    2. Заменяйте среду свежим NRDM каждые 3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выключайте свет во время смены среды, потому что RA чувствителен к свету. Удаляют плохо дифференцированные органоиды, а прилипшие органоиды отделяют под микроскопом.

4. Анализ НР человека

  1. Монтаж RO
    1. Выберите различные поколения H9-ESC для индуцирования трех партий RO.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки успешности индукции для каждого из трех оцениваемых методов (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27 и модифицированный метод в настоящем исследовании) рассчитываются три таблички с числом формирующих NR. Индукция считается успешной, если световая микроскопия выявляет образование нейроэпителиальноподобных структур на 30-е сутки.
  2. Иммунофлуоресцентное окрашивание ОРК
    1. Переложите 3-5 ОО в пробирки по 1,5 мл. Удалите пипеткой излишки среды и промойте RO один раз 1 мл DPBS на RT. Дайте RO утонуть и осторожно извлеките DPBS. Добавьте 1 мл 4% параформальдегида (см. Таблицу материалов) на пробирку объемом 1,5 мл и зафиксируйте при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: RO на 6-й и 18-й день, фиксируйте 2 ч. Закрепите за 12 ч на 30-й день и на 14 ч на 60-й день.
    2. После фиксации обезвоживайте с помощью градиентного спирта. Оставьте RO на 15 минут каждый при 50%, 60% и 70% спирте, а затем на 10 минут каждый при 80%, 90%, 95%, 100% и 100% спирте. Затем добавьте смесь 100% спирта и ксилола в соотношении 1:1 в течение 10 минут, а затем ксилол дважды по 10 минут каждый.
    3. Поместите RO в металлические формы, заполненные расплавленным парапластом (см. Таблицу материалов), на 40 мин, а затем закалите формы на льду, чтобы зафиксировать RO. Поместите коробки для закладных в формы и заморозьте их при -20 °C на ночь. Впоследствии аккуратно отсоедините закладные коробки. Наконец, храните их на RT.
    4. Создавайте непрерывные срезы (толщиной 5 мкм) с помощью парафинового слайсера. Зафиксируйте срезы на предметных стеклах адгезионного микроскопа, высушите и храните в RT.
    5. Проводят депарафинизацию и регидратацию перед репарацией антигена12,27.
    6. Добавьте 10 мл 20-кратного раствора для извлечения цитратного антигена pH 6,0 (см. Таблицу материалов) к 190 мл ddH2O (двойная дистилляция H2O). Разогреть в микроволновке на сильном режиме 4 мин до закипания. После добавления парафиновых срезов нагрейте участки на низком уровне в течение 20 мин до завершения репарации антигена.
    7. Дайте парафиновым срезам остыть естественным образом в проветриваемом помещении, а затем поместите их во влажную камеру.
    8. С помощью ручки (см. Таблицу материалов) наметьте разделы. Инкубируют с 0,2% Triton X-100 при RT в течение 30 мин для разрушения мембран, после чего промывают предметные стекла три раза TPBS по 5 мин каждый.
    9. Блок с 10% ослиной сывороткой, разбавленной в DPBS при RT, в течение 1 ч во влажной камере из расчета 10 мкл на площадь окрашивания.
    10. Добавьте первичные антитела, разведенные в 10% ослиной сыворотке. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C во влажной камере. Трижды промывают образцы TPBS в течение 10 мин каждый, чтобы удалить несвязанные антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные антитела: анти-PAX6 (1:250), анти-SOX2 (1:200), анти-KI67 (1:200), анти-CHX10 (1:200), анти-β тубулин III (1:250) и анти-NESTIN (1:200) (см. таблицу материалов).
    11. Инкубируют со вторичными антителами, разведенными в DPBS, в течение 1 ч при РТ во увлажненной камере. Повторите этап стирки с TPBS три раза по 10 минут каждый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить в темноте, чтобы предотвратить гашение флуоресцентных вторичных антител. Вторичными антителами являются Alexa Fluor 488, конъюгированный с антимышиным IgG и Alexa Fluor 568, конъюгированный с антикроличьим IgG в разведении 1:400 (см. таблицу материалов).
    12. Инкубируют с DPBS, содержащим DAPI (1:500; см. таблицу материалов), в течение 10 мин при RT в темноте. Промыть три раза TPBS по 10 минут каждый.
    13. Капните соответствующее количество антифлуоресцентного герметика (см. Таблицу материалов) на предметное стекло и накройте накладками.
    14. Визуализируйте с помощью проточного количественного анализатора клеток тканей (см. Таблицу материалов) или аналогичного.
    15. После микроскопического анализа храните предметные стекла при температуре -20 °C в темноте.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Графический обзор модифицированного протокола показан на рисунке 1. H9-ESC использовались для генерации RO, когда клетки были выращены до плотности 70%-80%. Одноячеистые суспензии H9-ESC в 96 конических лунках с V-образным дном агрегировались в 1-й день и к 6-м суткам образовывали хорошо очерченные круглые ЭБ. По мере увеличения времени культивирования объем БЭ постепенно увеличивался. На 30-е сутки отчетливо сформировались и утолщены нейроэпителиальные структуры при длительной дифференциров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Человеческие ОР могут пространственно и во времени повторять развитие сетчатки плода, а ранние ОР демонстрируют высокую степень сходства с сетчаткой плода на эквивалентных стадиях развития15. С точки зрения морфологии тканей и молекулярной экспрессии, человеческий обратный осмос, точно отражает фактический статус роста ткани сетчатки, предоставляя огромные и беспрецедентные возможности в области моделирования заболеваний, скрининга лекарств и регенеративной медицины. В настоящее время разработано ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,01 м TPBSServicebioG0002Промывка ломтиков
4% ПараформальдегидServicebioG1101-500MLФикс органоидов сетчатки
5 мл Пастеровская пипеткаNEST Biotechnology318516Пипетка ретинальных органоидов
96 V-образных конических лунокSumitomo BakelitMS-9096VZ
Адгезионный микроскоп СлайдыCITOTEST188105Фиксированные срезы
AggreWell среднийSTEMCELL Technologies5893Средний
безводный этанолSINOPHARM10009218Обезвоживание 
Anti-CHX10Santa Cruzsc-365519Первичное антитело
Anti-Fade SolutionZSGB-BIOZLI-9556
Anti-KI67Abcamab16667Первичное антитело
Anti-NESTINSigmaN5413Первичное антитело
Anti-NEURONAL Class III β-Tubulin(TUJ1)BeyotimeAT809Первичное антитело
Anti-PAX6Abcamab195045Первичное антитело
Раствор для диссоциации клеток (CDS)STEMCELL Technologies7922Диссоциация клеток
CHIR99021SelleckchemS2924GSK-3α/β ингибитор
холестерина Липидный концентратGibco12531018250&раз;
Раствор для извлечения цитратного антигенаServicebioG1202-250ML20×, pH 6.0
CS10Технологии стволовых клеток1001061Среда для замораживания клеток
DAPIRoche10236276001Ядерное противопятно
Диметилсульфоксид (ДМСО)SigmaD2650
DMEM/F12Gibco11330032Medium
DMEM/F12-GlutaMAXGibco10565018Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32766Вторичное антитело
Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568InvitrogenA10042Вторичное антитело
Этилендиамин Тетрауксусная кислота (ЭДТА)BiosharpBL518A0,5 M, pH 8,0, диссоциация клеток
Внеклеточный матрикс (ECM)Пластины дляпокрытия354277
F12-GlutamaxGibco31765035Сыворотка
крупного рогатого скота среднего размера плодаGibcoA5669701
Количественный анализатор клеток тканейTissueGnostics TissueFAXSPlusСрезы
сканирования IMDM-GlutaMAXGibco31980030Medium
IWR1-endoSelleckchemS7086Wnt-ингибитор
Нокаут Замена сывороткиGibco10828028
LDN-193189 2HClSelleckchemS7507BMP-ингибитор
24-луночные пластины с низкой адгезией Corning3473
Низкоадгезионные 6-луночные пластиныCorning3471
Поддерживающая среда (MM)STEMCELL Technologies85850Добавка
Medium N2Gibco17502048
Нормальная сыворотка ослякаSolarbioSL050Блокирующий буфер
ParaplastLeica39601006встраивание в ткани
PBS pH 7.4 основной (1x)GibcoC10010500BTбез Ca+,Mg+
реконбинантный морфогенетический белок человеческой кости-4(rhBMP4)R& D314-BPКлючевой белковый фактор
Ретиноевая кислотаSigmaR2625Порошок, хранить вдали от света
SB431542SelleckchemS1067ALK5-ингибитор
SU5402SelleckchemS7667Ингибитор тирозинкиназы
Super PAP PenZSGB-BIOZLI-9305
ТауринSigmaT0625-10G
ТиоглицеринSigmaM1753
Triton X-100SigmaX100Пермеабилизация
WA09 линия эмбриональных стволовых клетокWiCell Research InstituteКлеточная линия
XyleneSINOPHARM10023418депарафинизация
Y-27632 2HCLSelleckchemS1049ROCK-ингибитор
Corning для

Ссылки

  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  2. Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
  3. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  4. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
  5. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
  6. Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
  7. Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022(2021).
  8. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  9. Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
  10. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
  11. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286(2015).
  13. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047(2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  16. Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
  17. Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205(2019).
  18. Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
  19. Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39(2022).
  20. Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212(2021).
  21. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  22. Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478(2022).
  23. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439(2021).
  24. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  25. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  26. Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
  27. Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120(2020).
  28. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BMP4

Похожие статьи