Методическая статья

Дифференцировка и характеристика остеокластов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

DOI:

10.3791/66527

⸱

22 марта 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Department of Medicine, University of Washington, 2Department of Orthopedics and Trauma Surgery, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе представлена дифференцировка остеокластов человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и описаны методы характеризации остеокластов и предшественников остеокластов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описаны размножение и пассаж ИПСК человека и их дифференцировка в остеокласты. Сначала ИПСК диссоциируют в одноклеточную суспензию для дальнейшего использования в эмбриоидной индукции тела. После мезодермальной индукции эмбриоидные тельца подвергаются гемопоэтической дифференцировке, образуя плавающую популяцию гемопоэтических клеток. В дальнейшем заготовленные гемопоэтические клетки подвергаются стадии созревания колониестимулирующего фактора макрофагов и, наконец, дифференцировке остеокластов. После дифференцировки остеокластов окрашивание на TRAP в сочетании с ядерным окрашиванием метилового зеленого. Остеокласты наблюдаются в виде многоядерных поликарионов TRAP+. Их идентификация может быть дополнительно подтверждена окрашиванием катепсином К. Анализы костной и минеральной резорбции позволяют охарактеризовать функциональные характеристики, подтверждающие идентичность истинных остеокластов. Этот протокол демонстрирует надежный и универсальный метод дифференциации остеокластов человека от ИПСК и позволяет легко применять его в приложениях, требующих больших количеств функциональных остеокластов человека. Можно было бы предусмотреть применение в таких областях, как исследования костей, рака, тканевая инженерия и эндопротезирование.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Остеокласты (ОК) - это гемопоэтические 1,2, универсальные типы клеток, которые обычно используются исследователями в таких областях, как исследования заболеваний костей 3,4, исследования рака 5,6, тканевая инженерия 7,8 и исследования эндопротезов 9,10. Тем не менее, дифференцировка ОК может быть сложной задачей, поскольку для создания функциональных ОК11 необходимо слияние мононуклеарных предшественников в многоядерные КОКи. Для дифференцировки ОК необходимы несколько биологических факторов, таких как активатор рецептора NF-κB лиганда (RANKL) и колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF). Сообщалось, что М-КСФ оказывает положительное влияние на пролиферацию клеток, выживаемость клеток и экспрессию RANK 12,13,14. С другой стороны, RANKL связывается с RANK, который активирует нисходящие сигнальные каскады, индуцирующие остеокластогенез. Активация опосредована рецептор-ассоциированным фактором TNF 6 (TRAF6), что приводит к деградации ядерного фактора усилителя гена полипептида каппа лайт в ингибиторе В-клеток, альфа (IκB-α), связывающем белке, связывающем димеры NF-kB16,17. Таким образом, при деградации IκB-α высвобождаются димеры NF-kB, которые затем транслоцируются в ядро и индуцируют экспрессию транскрипционных факторов c-Fos и ядерного фактора активированных Т-клеток 1 (NFATc1). Это, в свою очередь, запускает транскрипцию множества белков, связанных с дифференцировкой ОК15,18. Повышенная регуляция белков, таких как DC-Stamp и Atp6v0d2, опосредует межклеточное слияние предшественников OC, что приводит к образованию синцития 19,20,21.

Что касается первичных клеток человека, CD34+ и CD14+ PBMC в настоящее время являются наиболее широко используемыми типами клеток для дифференцировки в OC22. Однако этот подход ограничен гетерогенностью в популяции CD34+ клеток, взятых у доноров23 , и их ограниченной расширяемостью. ИПСК человека представляют собой альтернативный источник КОК. Поскольку они могут распространятьсянеограниченное количество раз, они обеспечивают возможность расширения и масштабирования производства OC. Это позволяет дифференцировать большое количество ОК, что облегчает исследования ОК.

Опубликовано несколько протоколов дифференцировки ИПСК в ОК 25,26,27. Весь процесс дифференцировки можно разделить на часть распространения ИПСК, часть мезодермальной и гемопоэтической дифференцировки и дифференцировку ОК. Распространение ИПСК до процесса дифференцировки позволяет увеличить производство ОК до дифференцировки. Существует несколько подходов к мезодермальной и гемопоэтической дифференцировке. Традиционно для дифференцировки гемопоэтических клеток используется формирование эмбриоидных телец (БЭ), но однослойные подходы представляют собой еще одну стратегию гемопоэтической дифференцировки, которая не требует индукции БЭ. Тем не менее, однослойные системы, по-видимому, нуждаются в дальнейшей оптимизации, поскольку мы и другие специалисты обнаружили, что подходы, основанные на ЭБ, более надежны для дифференциации ОС.

В данной статье мы опишем дифференциацию ОК от ИПСК человека с помощью протокола, основанного на ЭБ. Этот протокол был адаптирован из Rössler et al.26 и модифицирован для повышения надежности и обеспечения криоконсервации в процессе дифференцировки. Во-первых, мы собирали гемопоэтические клетки только один раз после 10 дней дифференцировки. Затем гемопоэтические клетки были криоконсервированы, чтобы обеспечить большую гибкость в процессе дифференцировки. Кроме того, мы увеличили плотность посева гемопоэтических клеток с 1 x 105 до 2 x 105 клеток/см2 для дифференцировки ОК. Использовалась более современная среда без сыворотки ИПСК человека (hiPSC-SFM, см. таблицу материалов), а покрытие лунок было выполнено 200-300 мкг/мл экстракта базальной мембраны (см. таблицу материалов) вместо 0,1% желатина. Пенициллин/стрептомицин не добавляли в СМИ.

Протокол Rössler et al.26 был первоначально адаптирован из протокола iPSC в протокол дифференцировки макрофагов28, который использует образование EB для гемопоэтической дифференцировки. Несмотря на то, что формирование БЭ в течение длительного времени использовалось исследователями для дифференцировки гемопоэтических веществ29,30, в литературе было описано несколько методов индукции БЭ, таких как спонтанная агрегация, центрифугирование в планшете с круглым дном, культура висячих капель, культура в биореакторе, культура в конической трубке, медленно вращающийся боковой сосуд и культура геля из микроплесеней31. В этом протоколе используется центрифугирование диссоциированных ИПСК в планшете с круглым дном, чтобы приблизить отдельные клетки ИПСК друг к другу и обеспечить образование сферы (ЭБ), как описано ниже.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты, используемые в этом протоколе, можно найти в таблице материалов. Если не указано иное, перед использованием все среды были предварительно уравновешены до 37 °C. Все этапы центрифугирования выполняются при температуре 37 °C и в режиме самого медленного ускорения/замедления. Если не указано иное, надосадочную жидкость всегда удаляют с помощью одноразовых стеклянных пипеток Пастера.

1. Размораживание и размножение ИПСК человека

  1. За сутки до размораживания ИПСК покрыть лунку 6-луночного планшета 1 мл экстракта базальной мембраны в концентрации 200-300 мкг/мл. Поместите лунку при температуре 4 °C на ночь.
  2. На следующий день разморозьте и переложите клетки в пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки P1000. По каплям добавьте 5-7 мл DMEM/F-12 с 15 мМ HEPES.
  3. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 мин. Осторожно извлеките клетки из центрифуги и следите за тем, чтобы не потревожить гранулы клеток.
  4. Осторожно удаляют надосадочную жидкость стеклянной пипеткой Пастера и ресуспендируют клетки в 1 мл свободной от сыворотки ИПСК (hiPSC-SFM, содержащей 10 мкМ ингибитора Rho киназы (ROCK) Y-27632) с помощью P1000 с широким отверстием наконечника.
  5. Аспирируйте экстракт базальной мембраны из лунки, покрытой накануне (шаг 1.1), и перенесите 1 мл hiPSC-SFM с 10 мкМ Y-27632 в лунку. Добавьте ресуспендированные ИПСК в лунку до достижения конечного объема 2 мл на лунку.
  6. Покрутите планшет, чтобы равномерно распределить агрегаты ИПСК перед помещением в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2.
  7. Выполняйте полную смену среды через день, используя hiPSC-SFM (без добавления ингибитора ROCK Y-27632). ИПСК обычно достигают 70-80% слияния через 3-4 дня распространения.

2. Передача ИПСК

  1. За сутки до пассажа ИПСК следует покрыть лунки 6-луночного планшета базальным мембранным экстрактом в концентрации 200-300 мкг/мл. Поместите лунку при температуре 4 °C на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ячейки достигли примерно 70-80% слияния. Следите за тем, чтобы ИПСК не становились чрезмерно конфлюидными (более 80% конфлюции), так как это будет способствовать спонтанной дифференцировке.
  2. Прохождение ИПСК начинается с удаления дифференцированных участков или участков с большим количеством мертвых ИПСК под стереомикроскопом с помощью наконечников пипеток объемом 10 мкл или 20 мкл или клеточного скребка. Дифференцированные области будут казаться более плотными или белыми по цвету.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соскобленные ячеистые агрегаты все еще могут частично прикрепляться к забою скважины.
  3. Промойте дно скважины несколько раз с помощью пипетки P1000 с широким отверстием, чтобы удалить любые заполнители, которые все еще могут быть частично прикреплены к дну скважины.
  4. Выбросьте отработанную среду, в которой культивировались ИПСК, содержащую отделившиеся агрегаты ИПСК. Повторите этап промывки еще два раза фосфатным солевым буфером (PBS).
  5. Затем добавьте 1 мл 5 ЕД/мл Dispase на лунку. Края колоний ИПСК отрываются от планшета, что можно наблюдать под стереомикроскопом после 3-5-минутной инкубации при комнатной температуре.
  6. Осторожно удалите Dispase, чтобы избежать смещения слегка отслоившихся агрегатов, и добавьте 1 мл DMEM/F-12 с 15 мМ HEPES. Используйте одноразовый подъемник ячеек, чтобы нарезать агрегаты на небольшие размеры. Постоянство размеров агрегаций ИПСК может быть улучшено с помощью инструмента для пассирования стволовых клеток.
  7. Смойте нарезанные иПСК вместе со средой в лунке и перенесите среду с агрегатами в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью серологической пипетки объемом 5 мл или P1000 с широким наконечником.
  8. Промойте лунку DMEM/F-12 и перелейте среду в пробирку объемом 15 мл с агрегатами iPSC.
  9. Центрифугируют нарезанные агрегаты iPSC при 200 x g в течение 3 мин. Удалите надосадочную жидкость с помощью стеклянной пипетки Пастера и добавьте 2 мл hiPSC-SFM для смещения и ресуспендирования ИПСК с помощью серологической пипетки объемом 5 мл или P1000 с широким отверстием.
  10. Аспирируйте оставшийся экстракт базальной мембраны из предварительно покрытых планшетов лунок и добавьте 1 мл hiPSC-SFM в каждую лунку 6-луночного планшета.
  11. Перенос ИПСК в новые лунки 6-луночной пластины таким образом, чтобы окончательный объем составлял 2 мл hiPSC-SFM на лунку с помощью P1000 с широкими наконечниками. В зависимости от линии iPSC необходимо оптимизировать коэффициенты дробления. Здесь использовалось соотношение 1:6.
  12. Проверьте лунку на наличие плавающих агрегатов и размер заполнителя под стереомикроскопом. В идеале размер заполнителя должен быть в пределах 50-200 мкм.
  13. После переноса агрегатов вкрутите луночную пластину, чтобы равномерно распределить клетки по планшету, и инкубируйте при 37 °C при 5% CO2 до слияния 70-80%.

3. Замораживание ИПСК

  1. Чтобы заморозить клетки ИПСК обратно, проведите клетки, как описано выше (см. шаг протокола «2. Передача ИПСК»). После того, как клетки были нарезаны на колонии и смыты со дна лунки (шаг 2.10), отжим нарезанные заполнители при 200 x g в течение 3 мин. Аспирировать надосадочную жидкость.
  2. Добавьте 1 мл безсывороточной криоконсервационной среды на лунку 6-луночного планшета в пробирку объемом 15 мл и повторно суспендируйте нарезанные агрегаты с помощью P1000 с широким наконечником.
  3. Перенос клеток в предварительно маркированные криопробирки. Закройте пробирки и переложите их в предварительно охлажденный контейнер для криоконсервации при температуре 4 °C. Хранят клетки при -80 °C в течение 24-48 ч.
  4. Переведите криовиалы в жидкий азот для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое описание процесса дифференциации OC показано на рисунке 1.

4. Индукция эмбриоидных тел

  1. Культивируйте и размножайте достаточное количество ИПСК, как описано выше, для индукции БЭ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Производство ОК может быть увеличено за счет увеличения количества эмбриоидных телец, которые, в свою очередь, производят более высокий выход гемопоэтических клеток. Одна лунка, содержащая 70-80% флюидных ИПСК, дает примерно 8,4 x10,5 ячеек на лунку 6-луночной пластинчатой скважины. Для формирования одного эмбриоидного тела необходимо 12 500 одноклеточных ИПСК.
  2. Отработанную среду отсасывают из культур ИПСК и промывают колонии ИПСК с помощью D-PBS.
  3. Добавьте 0,5 мл предварительно подогретого до комнатной температуры одноклеточного диссоциационного реагента в каждую лунку 6-луночного планшета и перемешайте культуральный сосуд, чтобы покрыть всю поверхность лунки. Инкубируют культуральный сосуд при температуре 37 °C в течение 5-8 мин.
  4. Извлеките сосуд из инкубатора, аспирируйте реагент для диссоциации одиночных клеток и добавьте в лунки 1 мл дифференцировочной среды 1-й стадии, состоящей из hiPSC-сывороточной свободной среды с 50 нг/мл костного морфогенетического белка человека 4 (hBMP4), 50 нг/мл фактора роста эндотелия эндотелия сосудов человека-165 (hVEGF), 20 нг/мл фактора стволовых клеток человека (hSCF), и 10 мкМ Y-27632.
  5. Аккуратно отделите клетки, промыв лунку средой Stage 1. Поместите диссоциированные ИПСК в коническую пробирку объемом 15 мл.
  6. Добавьте 1 мл дифференцировочной среды 1-й стадии в лунки и смойте оставшиеся клетки или используйте скребок для колоний, которые плохо смываются.
  7. После переноса всех клеток в пробирку центрифугу при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре до образования клеточной гранулы. Аспирируйте и ресуспендируйте клетки в общей сложности в 2 мл предварительно уравновешенной среды дифференцировки Stage 1 с помощью серологической пипетки объемом 5 мл или P1000 с широким наконечником.
  8. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматического устройства для подсчета клеток. Добавьте среду в пробирку объемом 15 мл, содержащую одноячеистую суспензию, к планшету 12 500 клеток на лунку в 96-луночном планшете со сверхнизким насадкой со сверхнизким креплением в 100 мкл дифференцировочной среды Stage 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Под микроскопом клетки будут выглядеть как одноклеточная суспензия с клетками, разбросанными по всей лунке.
  9. Центрифугируют 96-луночные планшеты в течение 3 мин при 100 x g. После центрифугирования клетки должны начать напоминать сфероиды при рассмотрении под микроскопом. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 24 часа.
  10. Замените половину среды в День 1 и День 2 на среду дифференциации 1-й стадии. Для повышения эффективности используйте многоканальную пипетку, чтобы утилизировать 50 мкл отработанной среды дифференциации Стадии 1 в чашку Петри.
  11. После удаления среды с 96-луночного планшета проверьте наличие ЭБ под стереомикроскопом, которые могли быть случайно удалены. Перенесите случайно удаленные ЭБ на 96-луночный планшет с помощью пипетки P1000 с широкими наконечниками.
  12. Добавьте 50 мкл свежей дифференцировочной среды Stage 1 в каждую лунку 96-луночного планшета со сверхнизкой насадкой с круглым дном и сверхнизкой насадкой с помощью многоканальной пипетки.

5. Гемопоэтическая дифференцировка

  1. За сутки до начала гемопоэтической дифференцировки следует покрыть лунку 6-луночной пластины 1 мл экстракта базальной мембраны в концентрации 200-300 мкг/мл. Поместите лунку при температуре 4 °C на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая скважина получит 8 ЭБ на более позднем этапе этого протокола. В зависимости от количества подготовленных ЭБ соответственно покрывают скважины.
  2. Аспирировать избыточный экстракт базальной мембраны и предварительно заполнить лунки 6-луночного планшета 3 мл дифференцировочной среды 2-й стадии, состоящей из гемопоэтической базальной среды, к которой добавляют 2 мМ ультраглютамина, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола, 25 нг/мл интерлейкина человека 3 (hIL-3) и 100 нг/мл колониестимулирующего фактора макрофагов человека (hM-CSF).
  3. Используя P1000 с широкими наконечниками, перенесите по 8 EB в каждую лунку 6-луночной пластины. После переноса убедитесь на глаз или под стереомикроскопом, что в каждой лунке находится по 8 ЭБ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Через 1 день плавающие ЭБ будут прилипать к дну скважины. В последующие 5-7 дней должна стать видимой плавающая клеточная популяция, состоящая из гемопоэтических клеток. Период гемопоэтической дифференцировки может быть разнообразным, начиная с 7 дней. Дифференцировка в течение 10 дней показала гемопоэтическую популяцию, состоящую из крупных субпопуляций CD45+, CD14+ и CD11b+ .
  4. После 5 дней обработки дифференцирующей средой 2-й стадии произведите замену среды, удалив отработанную среду и дозировав ее в коническую пробирку объемом 50 мл. Пипетка работает медленно, чтобы удалить как можно меньше плавающих клеток и сохранить напряжение сдвига как можно ниже. Пипетирование под стереомикроскопом может помочь избежать случайного удаления клеток.
  5. Немедленно добавьте в лунки 1 мл свежей дифференцировочной среды Stage 2. Для того, чтобы восстановить любые плавающие гемопоэтические клетки, которые уже могут присутствовать на этом этапе процесса дифференцировки, не выбрасывайте дозированную среду. Вместо этого раскрутите пробирку с отработанной средой в концентрации 300 x g в течение 5 мин и аспирируйте надосадочную жидкость.
  6. Добавьте в пробирку свежую среду дифференцировки 2-й стадии и ресуспендируйте ее, чтобы отделить клетки, которые могли быть перенесены вместе с отработанной средой.
  7. Добавьте 2 мл свежей дифференцировочной среды 2-й стадии с восстановленными клетками в каждую лунку, которая ранее была заполнена 1 мл дифференцировочной среды 2-й стадии.
  8. На 10-й день гемопоэтической дифференцировки проверьте наличие большого количества плавающих гемопоэтических клеток. Собирают урожай, собирая их в пробирку объемом 50 мл. Их можно либо заморозить обратно в 10% ДМСО, 50% ФБС и 40% среды, либо использовать сразу для дифференцировки клеток в ОК.

6. Созревание М-КСФ и дифференцировка ОК

  1. Затравочные клетки в концентрации 200 000 клеток/см2 на культуре тканей обрабатывают луночными планшетами и обрабатывают альфа-МЭМ, дополненными 10% FBS и 50 нг/мл hM-CSF.
  2. Для проведения функционального анализа или визуализации отсоедините созревшие клетки M-CSF через 3 дня после посева путем промывки предварительно подогретым PBS до 37 °C с помощью P1000 с широким наконечником. Для полного отделения ячеек могут потребоваться повторные этапы промывки.
  3. Переложите отделенные клетки в пробирку объемом 15 мл с помощью P1000 с широким наконечником и центрифугой при 300 x g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
  4. Ресуспендируйте и растворите клеточную гранулу со средой дифференцировки ОК, состоящей из альфа-МЭМ с добавлением 10% FBS, 50 нг/мл hM-CSF и 80 нг/мл hRANKL. Подсчитывают количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического устройства для подсчета клеток и пересевают зрелые клетки М-КСФ с плотностью 200,00-250 000 клеток/см2 в соответствующую посуду для функционального анализа или визуализации (т.е. анализ резорбции костной ткани, предметные стекла для визуализации и т. д.).
  5. Дифференцируют со средой дифференцировки ОК в течение 7-9 дней. Каждые 2-3 дня проводите полную смену питательной среды со свежей средой дифференциации ОК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многоядерные ОК обычно появляются через 5-7 дней.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мониторинг морфологии клеток на протяжении всего процесса дифференцировки
Все результаты, описанные ниже, были получены с использованием линии MCND-TENS2 iPSC для дифференцировки ОК. Эта линия ИПСК ранее использовалась в нескольких исследованиях32,33. Тем не менее, другие линии ИПСК также были успешно использованы с этим протоколом дифференцировки.

Регулярный визуальный осмотр выявляет различные и различные морфологические характеристики ИПСК на протяжении всего процесса дифференцировки в ОК (рис. 2). Колонии ИПСК (рис. 2А) диссоциировали в одноклеточную суспензию, которая перед центрифугированием проявляется в виде отдельных клеток по всей поверхности круглой нижней лунки (рис. 2Б). После центрифугирования (шаг 4.9 в протоколе) клетки будут собираться в центре круглой нижней сверхнизкой пластины и впоследствии образовывать сферы (эмбриоидные тельца, ЭБ, рис. 2С). БЭ увеличиваются в размерах в два-три раза на протяжении всего процесса мезодермальной дифференцировки (рис. 2D) и становятся легко видимыми глазу в конце 4-дневного периода дифференцировки (рис. 2E). Можно увидеть, как БЭ прилипают и срастаются со дном луночной пластины после переноса в лунки 6-луночной пластины для гемопоэтической дифференцировки (шаг 5.3 в протоколе, рис. 2F). Через 7-8 дней в питательной среде становятся видны большие количества плавающих гемопоэтических клеток (рис. 2G). После забора и переделки гемопоэтических клеток следует фаза созревания М-КСФ, и начинается дифференцировка ОК (шаг 6.4 в протоколе). В течение 5-6 дней впервые становятся видимыми многоядерные клетки с большим прозрачным клеточным телом (рис. 2H). На этой стадии все еще видно большое количество мононуклеарных клеток. Еще через 2-3 дня дифференцировки ОК будут еще больше сливаться с соседними клетками, образуя большие поликарионы с еще большим количеством ядер (рис. 2I).

Оценка гемопоэтической популяции, полученной из БЭ
Гемопоэтическая дифференцировка может проводиться в течение различного периода времени. В литературе описаны сроки от 7 дней до 9 недель. В этом протоколе гемопоэтическая дифференцировка проводится в течение 10 дней. Мы обнаружили, что 10 дней гемопоэтической дифференцировки давали низкое количество ранних CD34+ (0,53%, рис. 3A) и большее количество промежуточных CD43+ (48,5%, рис. 3B) гемопоэтических предшественников. Что еще более важно, после 10-дневного периода лечения было получено достаточное количество CD45+ (96,2%, рис. 3C), CD14+ (33%, рис. 3D) и CD11b+ (35,9%, рис. 3E) для успешной дифференциации их в ОК. Тем не менее, период лечения цитокинами для гемопоэтической дифференцировки (шаг 5.4 в протоколе) может нуждаться в корректировке и оптимизации на основе линии iPSC для генерации адекватного количества CD45+, CD14+ и CD11b+ клеток.

В среднем, 6 миллионов гемопоэтических клеток были собраны после 10 дней дифференцировки из каждой лунки с 8 ЭБ.

Оценка морфологии и активности ОК
После дифференцировки ОК можно оценить морфологически и функционально. Прекурсоры ОК повторно высевают на предметные стекла камеры или предметные стекла после этапа созревания М-КСФ для улучшения качества изображения при окрашивании для TRAP или Cathepsin K. Ферментативное окрашивание TRAP после дифференциации ОК показывает крупные, многоядерные, TRAP-положительные КОКи (рис. 4A). Кроме того, между многоядерными ОК можно увидеть слегка TRAP-положительные мононуклеарные клетки. Отрицательные элементы управления без добавления RANKL не отображают плавленый многоядерный ОК. Тем не менее, можно изобразить небольшое количество слегка TRAP-положительных мононуклеарных клеток (рис. 4B).

На изображениях конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) видны ОК, окрашенные на катепсин К (бирюзовый) и F-актин (красный) в сочетании с ядерным окрашиванием DAPI (синий) (рис. 4C, 4D). Крупные многоядерные КОКи видны при обработке RANKL в соответствии с протоколом, который отображает обширную F-актиновую цитоскелетную структуру и окрашивается положительно на катепсин К (рис. 4C). Отрицательный контроль без добавления RANKL, с другой стороны, не показывает слившихся многоядерных клеток.

ОК могут быть дополнительно оценены функционально путем измерения резорбтивной активности. Для определения резорбтивной активности можно использовать анализ костной или минеральной резорбции. Здесь прекурсоры ОК были высеяны в скважины, покрытые фосфатом кальция, и терминально дифференцированы. Большие участки, где минеральное покрытие рассасывалось, видны голубовато-серым цветом (рис. 4Е). Могут быть выявлены резорбционные ямы разных размеров. Оставшееся кальций-фосфатное покрытие не рассасывается, оно видно коричневым цветом. Наличие резорбционных ямок подтверждает идентичность дифференцированных многоядерных клеток как ОК. Кроме того, резорбционные ямки могут быть дополнительно количественно определены для оценки и сравнения резорбтивной активности. Общая площадь резорбированного минерала по общей площади поверхности скважины может быть количественно оценена в процентах. Кроме того, размер и количество резорбционных ямок могут быть дополнительно определены количественно. В контрольной группе, не прошедшей лечение, не наблюдалось резорбционных ямок (рис. 4F).

figure-results-1
Рисунок 1: Схематическое изображение процесса дифференцировки остеокластов из ИПСК человека. Иллюстрация, нарисованная Ханной Блюмке (Hannah Blümke) с помощью Affinity Designer 2.1.1. На иллюстрации использованы ранее использованные рисунки33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Микроскопические изображения на протяжении всего процесса дифференцировки ИПСК человека к остеокластам. (А) Недифференцированные колонии ИПСК на протяжении всего размножения. (B) ИПСК в лунках с круглым дном после диссоциации на одноклеточную суспензию перед центрифугированием. (C) Централизованно собранные одноклеточные ИПСК после центрифугирования. (D) БЭ увеличиваются в размерах в течение 4-дневного периода мезодермальной дифференцировки. (E) Видимые эмбриоидные тельца после мезодермальной дифференцировки. (F) После переноса эмбриоидных тел на 6-луночные планшеты, покрытые экстрактом базальной мембраны, можно увидеть, как эмбриоидные тельца прилипают и сливаются со дном лунки. (G) Через 5-7 дней гемопоэтической дифференцировки в среде может наблюдаться большое количество плавающих гемопоэтических клеток. (H) После созревания М-КСФ первые остеокласты с 3-4 ядрами появляются через 5-7 дней дифференцировки с RANKL. (I) В конце дифференцировки остеокластов можно наблюдать крупные многоядерные клетки. Масштабные линейки: A, D, F, G = 200 мкм, B, C, H, I = 50 мкм, E = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Анализ поверхностных маркеров эмбриоидных кроветворных клеток с использованием проточной цитометрии. Экспрессия маркеров позволяет проводить анализ гемопоэтических клеток и идентификацию субпопуляций после стробирования синглетов и живых клеток. (A) Онтогенетически ранняя популяция гемопоэтических клеток-предшественников CD34+ очень мала или отсутствует в сочетании с этим протоколом. (B) CD43+ клетки составляют примерно 50% всей популяции. (C) CD45+ гемопоэтические клетки-предшественники поздней стадии составляют наибольшую часть гемопоэтической популяции – 96,2%. (Г, Д) Более прямые предшественники CD14+ и CD11b+ OC составляют 33% и 36% соответственно. Красным цветом выделен неокрашенный отрицательный контроль, синим – контроль изотипа, желтым – клетки, окрашенные соответствующими маркерными антителами. При составлении графиков используются ранее опубликованные данные33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Морфологическая и функциональная оценка iPSC-дифференцированных остеокластов человека. (A) Окрашивание TRAP после дифференцировки остеокластов показывает крупные, многоядерные, TRAP-положительные остеокласты. Можно увидеть слегка TRAP-положительные мононуклеарные клетки, перемежающиеся между многоядерными остеокластами. (B) В отрицательных контрольных группах без добавления RANKL, окрашенных для TRAP, не обнаруживаются сросшиеся многоядерные остеокласты. Тем не менее, можно изобразить небольшое количество слегка TRAP-положительных, мононуклеарных клеток. (C) На изображениях конфокальной лазерной сканирующей микроскопии дифференцированных гемопоэтических клеток остеокластов на предметном стекле, окрашенном на F-актин (красный) и катепсин К (бирюзовый) в сочетании с ядерным окрашиванием DAPI (синий), видны крупные многоядерные катепсин-К-положительные остеокласты. (D) Отрицательный контроль без добавления RANKL показывает сходство с (B) мононуклеарными клетками при более низкой плотности клеток. (E) Функциональная оценка может быть проведена путем оценки резорбционной активности остеокластов. Для этого проводится дифференцировка остеокластов на костной или минеральной резорбции. На изображениях, полученных с помощью инвертированного широкопольного микроскопа в режиме фазового контраста, видны большие участки резорбции минерального слоя фосфата кальция. Резорбтивная активность может быть дополнительно количественно оценена путем измерения площади резорбции по общей площади. (F) Отрицательный контроль без добавления RANKL не показывает областей резорбции. Масштабные линейки: A, B = 100 мкм, C, D = 50 мкм, E, F = 1 мм. Изображения были отредактированы на основе ранее опубликованных данных33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предлагает надежный и устойчивый метод дифференциации ИПСК в ОК. Тем не менее, есть несколько подводных камней, с которыми можно столкнуться в процессе дифференциации. Линии ИПСК человека, полученные из клеток различного тканевого происхождения, были успешно дифференцированы с использованием этого протокола33. При замораживании ИПСК (см. шаг протокола «3. Замораживание ИПСК»), одна лунка в точке прохода была заморожена обратно в одну криовиальную. При размораживании (см. шаг протокола «1. Размораживание и размножение ИПСК человека»), один криовиал размораживали в одну лунку 6-луночного планшета. Разные линии ИПСК будут вести себя немного по-разному, и скорость пролиферации будет отличаться. Соответственно необходимо будет отрегулировать скорость сплита.

При пассировании ИПСК или диссоциации ИПСК в одноклеточную суспензию для индукции БЭ важно удалить любые спонтанно дифференцированные колонии или агрегаты мертвых клеток для повышения эффективности и результативности мезодермальной и гемопоэтической дифференцировки. Это можно сделать под стереомикроскопом с помощью клеточного скребка, наконечников пипеток от пипетки Р10 или Р20 или скребкового инструмента, изготовленного из пипеткиПастера 35.

Как упоминалось выше, этот протокол включает диссоциацию колоний ИПСК в одноклеточную суспензию для индукции ЭБ, в то время как в других протоколах ИПСК оставляют в виде агрегатов для центрифугирования для индукции ЭП36. Сообщается, что размер, количество клеток, форма и морфология БЭ влияют на дифференцировку 37,38,39. Таким образом, мы предполагаем, что диссоциация на одноклеточную суспензию позволяет добиться лучшей однородности EB-to-EB по размеру и форме после центрифугирования и, следовательно, более стабильных результатов продукции гемопоэтических клеток31.

Описаны и другие методы индукции БЭ. Сообщалось, что такие методы, использующие одноклеточную суспензию в сочетании с ингибитором ROCK для улучшения выживаемости клеток, имеют преимущество в контроле размера БЭ и исхода дифференцировки31.

Метод индукции ЭП с круглодонной 96-луночной пластиной, описанный в этом протоколе, подходит для крупномасштабного производства ЭП и позволяет увеличить производство ЭП. Недавно были описаны более новые методы гемопоэтической дифференцировки без стадии индукции эмбриоидного тела, способные облегчить процесс дифференцировки32. Тем не менее, эти протоколы до сих пор не разработаны для дифференциации ОК33.

В вышеупомянутом протоколе мы описываем изменение среды на 5-е сутки гемопоэтической дифференцировки. Небольшое количество плавающих клеток может появиться уже на 4-5 день дифференцировки. Чтобы избежать выброса плавающих клеток, среду следует собрать в пробирку и центрифугировать перед выбросом. Затем гранулы с ячейками, находящиеся на дне трубки, должны быть вытеснены свежей средой и перенесены обратно в лунки 6-луночной пластины. Тем не менее, значение ранней популяции плавающих клеток в дифференцировке ОК еще предстоит определить.

Продукцию гемопоэтических клеток можно оценить с помощью проточной цитометрии. Для дифференцировки остеокластов желателен высокий выход CD45+, CD14+ и CD11b+ клеток33. Сообщается, что криоконсервация собранных плавающих гемопоэтических клеток является сложной задачей с общей ограниченной скоростью восстановления и низкой жизнеспособностью клеток 40,41. Криоконсервируя гемопоэтические клетки в криоконсервационной среде, состоящей на 50% из безсывороточной среды для размножения гемопоэтических клеток (см. таблицу материалов), 40% FBS и 10% DMSO, мы смогли восстановить клетки с жизнеспособностью клеток примерно 90,3% ± 2,62 SD (n = 7) после размораживания.

Остеокластогенез требует слияния нескольких моноядерных предшественников ОК с образованием многоядерных остеокластов, способных к минеральной и костной резорбции. В то время как мышиные клеточные линии-предшественники ОК просто нуждаются в добавлении RANKL для индуцирования образования ОК42, предшественники человека нуждаются в дополнительном М-КСФ для выживания и пролиферацииклеток 43. Недавно был обнаружен OSCAR в качестве дополнительного рецептора, участвующего в дифференцировке OC, несмотря на то, что до сих пор в качестве лиганда был идентифицирован только коллаген I типа. В то время как исследования OSCAR с КОК, полученными из ИПСК, все еще ограничены, супрафизиологические концентрации in vitro RANKL и M-CSF в мышиной клеточной линии, по-видимому, обходят необходимость активации OSCAR44, активация OSCAR in vivo , по-видимому, является необходимым костимулирующим сигналом для остеокластогенеза45. Дополнительным фактором, который необходимо учитывать, является поверхность скважины. Известно, что химические46 и физические47 поверхностные свойства влияют на дифференцировку остеокластов и могут либо способствовать, либо препятствовать успешной дифференцировке. Определенная гетерогенность в популяции предшественников также представляется критической для успешного слияния КОК, поскольку различные факторы, связанные со слиянием, такие как CD47 и DC-STAMP, действуют на разных стадиях слияния остеокластов48.

В заключение, этот протокол позволяет дифференцировать КОК человека от ИПСК для облегчения и ускорения исследований КОК.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников лаборатории Джачелли за их техническую помощь и поддержку. Мы благодарим Центр микроскопии им. В. М. Кека и менеджера Центра Кека, д-ра Натаниала Петерса, за помощь в получении изображений конфокальной микроскопии и широкоугольной микроскопии. Мы также благодарим UW Flow Core Facility и менеджера Flow Core Facility Аурелио Сильвестрони за техническую поддержку и помощь. Наконец, мы благодарим Ханну Блюмке за помощь в иллюстрациях и графическом дизайне.

Финансирование осуществлялось в рамках гранта Национальных институтов здравоохранения R35 HL139602-01. Мы также признательны NIH S10 грант S10 OD016240 для финансирования инструментов в Центре В. М. Кека, а также грант NIH 1S10OD024979-01A1 для финансирования инструментов в UW Flow Core Facility.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-МеркаптоэтанолSigma AldrichM6250-10ML
Антитело - Антикатепсин K Abcamab19027
Антитело - APC-конъюгированное Anti-Human CD45BD555485
антитело - APC-конъюгированное мышиное IgG1, κ Контроль изотипаBD555751
антителом - BV711-конъюгированным античеловеческим CD14BD563372
антителом - BV711-конъюгатами мышиного IgG2b, κ Контроль изотипаBD563125
антитела - козий антикролик IgG H& L Alexa Fluor® 647Abcamab150079
Антитело - PE-конъюгированное античеловеческое CD14R& D SystemsFAB3832P-025
Антитело - ПЭ-конъюгированный античеловеческий интегрин альфа M/CD11bR& D SystemsFAB16991P-025
Антитело - PE-Cy7-конъюгированное Anti-Human CD34BD560710
Антитело - PE-Cy7-конъюгированное мышиное IgG1 κ Контроль изотипаBD557872
антитела - PE/Cyanine5-конъюгированный античеловеческий CD11bBiolegend301308
антитела - PE/Cyanine5-конъюгированный мышиный IgG1, κ Изотип CtrlBiolegend400118
антитело - PerCP-Cy5.5-конъюгированный мышиный IgG1 κ Контроль изотипаBD550795
антитела - PerCpCy5.5-конъюгированный античеловеческий CD43BD563521
набор для анализа резорбции костиCosmoBioUSACSR-BRA-24KIT
Countess 3 Автоматизированный счетчик клетокThermoFisher16812556
стволовые клетки Cultrex Qualified Сниженный фактор роста Экстракт базальной мембраныR& D Sytems3434-010-02Экстракт базальной мембраны
DAPIR& D Systems5748/10
Dispase (5 Ед/мл)STEMCELL Technologies7913
DMEM/F-12 с 15 мМ HEPESСтволовые клетки36254
DMSOSigma AldrichD2650
DPBSSigma AldrichD8537-500ML
Костный морфогенетический белок человека 4 (hBMP4)STEMCELL Technologies78211
Человеческий IL-3STEMCELL Technologies78146.1
Колониестимулирующий фактор макрофагов человека (hM-CSF)STEMCELL Technologies78150.1
Растворимый рецептор человека Активатор ядерного фактора-κ B Ligand (hsRANKL)STEMCELL Technologies78214.1
Фактор стволовых клеток человека (hSCF)STEMCELL Technologies78155.1
Человеческий TruStain FcX (раствор для блокирования рецепторов Fc)Biolegend422301
фактор роста эндотелия сосудов человека-165 (hVEGF165)STEMCELL Technologies78073
Invitrogen Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
MEM α, нуклеозиды, без фенола красногоThermoFisher41061029
mFreSRSTEMCELL Technologies05855Среда для криоконсервации без сыворотки
mTeSR Plus средаSTEMCELL Technologies100-0276Среда без iPSC сыворотки крови человека (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-лунка, Nunclon Sphera-Treated, U-образное дно МикропланшетThermo Scientific174925Круглое дно сверхнизкое вложение 96-луночный планшет
P1000 Широкие наконечникиThermoFisher2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632STEMCELL Technologies72304
StemSpan SFEMStemCell09650Среда для культивирования гемопоэтических клеток
TrypLE Select Enzyme (1X), без фенола красногоThermo Fisher12563011Реагент для диссоциации одиночных клеток
УльтраглутаминBioscience LonzaBE17-605E/U1
X-VIVO 15 Бессывороточная гемопоэтическая клеточная средаBioscience Lonza04-418QГемопоэтическая базальная среда
&микро;-слайд 8 лунок Высокийуровень Ibidi80806

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
  2. Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
  3. Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144(2021).
  4. Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895(2019).
  5. Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311(2017).
  6. Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
  7. Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465(2013).
  8. Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913(2022).
  9. Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060(2022).
  10. Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
  11. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
  12. Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
  13. Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
  14. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  15. Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
  16. Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z. NF-κB-mediated regulation of osteoclastogenesis. Endocrinology and Metabolism. 30 (1), 35(2015).
  17. Novack, D. V. Role of NF-κB in the skeleton. Cell Research. 21 (1), 169-182 (2010).
  18. Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
  19. Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871(2009).
  20. Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337(2005).
  21. Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402(2016).
  22. Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698(2023).
  23. Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
  24. Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23(2014).
  25. Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
  26. Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
  27. Chen, I. -P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
  28. Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  29. Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
  30. Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
  31. Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595(2015).
  32. Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600(2019).
  33. Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319(2023).
  34. Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087(2022).
  35. Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
  36. Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
  37. Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
  38. Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
  39. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  40. Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038(2020).
  41. Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282(2019).
  42. Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631(2022).
  43. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  44. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201(2002).
  45. Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162(2021).
  46. Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109(2017).
  47. Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
  48. Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73(2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Osteoclast DifferentiationHuman IPSCsEmbryoid Body InductionHematopoietic DifferentiationM CSF MaturationTRAP StainingCathepsin K StainingBone Resorption AssayFlow CytometryMultinucleated Osteoclasts

Похожие статьи