Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Расширенная 78% гепатэктомия на мышиной хирургической модели

4.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66528

⸱

24 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Vascular and Endovascular Surgery and the Center for Vascular Biology Research, Department of Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2The Transplant Institute and the Division of Nephrology, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Мышиная модель частичной гепатэктомии 2/3 (66%) хорошо описана в литературе, но более расширенные гепатэктомии, имитирующие синдром малого размера после трансплантации печени, используются редко. Мы описываем расширенную процедуру 78% гепатэктомии на мышиной модели, которая приводит к примерно 50% послеоперационной летальности у здоровых мышей.

Аннотация

Частичная гепатэктомия 2/3 у мышей используется в исследованиях для изучения регенеративной способности печени и изучения результатов резекции печени в ряде моделей заболевания. При классической частичной гепатэктомии 2/3 у мышей две из пяти долей печени, а именно левая и срединная доли, представляющие примерно 66% массы печени, резецируются в блоке с ожидаемой послеоперационной выживаемостью 100%. Более агрессивные частичные гепатэктомии технически более сложны и, следовательно, редко используются у мышей. Наша группа разработала мышиную модель техники расширенной гепатэктомии, при которой три из пяти долей печени, включая левую, срединную и правую верхние доли, резецируются отдельно для удаления примерно 78% от общей массы печени. Эта длительная резекция у здоровых мышей оставляет остаточную печень, которая не всегда может поддерживать адекватную и своевременную регенерацию. Неспособность к регенерации в конечном итоге приводит к 50% послеоперационной летальности в течение 1 недели из-за фульминантной печеночной недостаточности. Эта процедура расширенной 78% гепатэктомии у мышей представляет собой уникальную хирургическую модель для изучения синдрома малого размера и оценки терапевтических стратегий для улучшения регенерации печени и результатов в условиях трансплантации печени или расширенной резекции печени при раке.

Введение

Модели хирургической резекции печени на мышах и крысах, впервые описанные в 1931 году, являются наиболее распространенными экспериментальными моделями, используемыми для изучения молекулярных основ регенерации печени. Они также могут быть полезны в трансляционных научных исследованиях для проверки и разработки стратегий улучшения результатов после расширенной резекции печени или трансплантации неоптимальных трансплантатов печени 1,2,3,4. Частичная гепатэктомия (ЛГ) у мышей влечет за собой удаление примерно 2/3 (66%) от общей массы печени (ТЛМ), что при выполнении у здоровых животных приводит к исключительным исходам5. Процедура короткая по продолжительности, легко воспроизводимая благодаря небольшим вариациям анатомии печени мыши, а послеоперационная выживаемость обычно приближается к 100%1.

Частичная гепатэктомия 2/3, включающая резекцию левой доли (LL) и срединной доли (ML), позволяет остаточным долям регенерировать относительно беспрепятственно из-за воспаления доли или ограничения притока и оттока печени. Скорее, увеличение портального венозного кровотока и последующий сдвиговый стресс на синусоидальных эндотелиальных клетках печени после PH приводят к устойчивой апрегуляции экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) и последующему высвобождению оксида азота (NO), что способствует подготовке гепатоцитов к пролиферации и регенерации печени3. Исходы, обычно изучаемые после 2/3 PH в моделях заболеваний, таких как неалкогольная жировая болезнь печени или на определенных генетических фонах, включают риск острой печеночной недостаточности, качественные и количественные показатели регенеративной способности печени и другие биологические реакции на стресс или травматическое повреждение 1,3.

Тем не менее, мышиная модель, имитирующая функциональный или анатомический синдром малого размера, поскольку он возникает после длительной резекции печени по поводу рака или трансплантации маргинальных (стеатоз или длительное время ишемии) или частичных (разделенных или из печени живого донора) трансплантатов печени, остается хорошо установленной. Чтобы удовлетворить эту потребность, требуются модели более обширных резекций печени, выходящих за рамки поддержания минимальной (и функциональной) массы печени, для моделирования синдрома малой по размеру печени и повышенной смертности, связанной с этим синдромом.

Анатомия печени мышей демонстрирует минимальные вариации. Печень мыши состоит из пяти долей, каждая из которых составляет следующий процент от общей массы печени: левая доля (LL; 34,4 ± 1,9%), срединная доля (ML; 26,2 ± 1,9%), правая верхняя (также называемая правой верхней) доля (RUL; 16,6 ± 1,4%), правая нижняя (также называемая правой нижней) доля (RLL; 14,7 ± 1,4%) и хвостатая доля (CL, 8,1 ± 1,0%)1, 5. Каждая доля снабжается портальной триадой, включающей ветвь печеночной артерии, ветвь воротной вены и желчный проток5. Исторически сложилось так, что было описано несколько методов выполнения 2/3 PH путем резекции LL и ML. К ним относятся: 1) классическая техника, состоящая из одной лигатуры en bloc у основания каждой из резецированных долей; 2) техника гемостатического клипсования с использованием титановых клипс, накладываемых на основание резецированных долей; 3) сосудоориентированная паренхимосохраняющая техника с использованием прокалывающих швов проксимальнее зажима; и 4) сосудистая микрохирургическая техника, при которой воротная вена и ветви печеночной артерии лигируются перед резекцией доли1. Хотя каждый метод имеет относительные сильные и слабые стороны, ни один из них не дает более высокой летальности 1,8,9.

В этом исследовании мы представляем новый метод для увеличения PH на 78% у мышей. В этой модели три из пяти долей печени, включая LL, ML и RUL, удаляются отдельно с помощью лигатурной техники (рис. 1). Результатом этой процедуры является резекция примерно 78% (77,2 ± 5,2%) от общей массы печени. Наш выбор удаления ЛЛ и МЛ отдельно, а не «en bloc», как в классической методике PH, сводит к минимуму осложнения, связанные с резекцией этих двух долей en bloc, таких как стеноз надпеченочной полой вены и повышенный риск некроза остальных долей при наложении одиночной лигатуры слишком близко к полой вене1. 10,11,12,13,14. Это имеет решающее значение перед тем, как перейти к заключительному этапу этой процедуры по удалению RUL. Эта обширная гепатэктомия у мышей C57BL/6 дикого типа в возрасте 8-12 недель приводит к 50% летальности в течение 1 недели операции из-за неудачной регенерации печени, вызывая молниеносную печеночную недостаточность15,16. Эта мышиная модель повышенной летальности после расширенной 78% гепатэктомии надлежащим образом повторяет патофизиологию синдрома малых размеров и позволяет разрабатывать и тестировать новые стратегии для улучшения результатов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Методы, описанные в этом протоколе процедуры, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском центре диаконисс Бет Исраэль (BIDMC). Все эксперименты были проведены в соответствии с IACUC и руководящими принципами исследовательского центра BIDMC на животных.

1. Предоперационная подготовка мыши

  1. Побрейте брюшную полость мыши от середины грудины до надлобковой области с помощью машинок для стрижки.
  2. Вызвать общую анестезию 1-4% изофлураном в 100% кислороде. После обезболивания положите мышь лежа на операционное поле, подложив под нее грелку. Перед тем, как сделать надрез, сильно зажмите палец ноги, чтобы убедиться в отсутствии педального рефлекса (если он присутствует, животное будет реагировать). При необходимости корректируйте уровень анестезии для достижения состояния общей анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Титруйте изофлуран по мере необходимости для поддержания адекватной общей анестезии.
  3. Вводите 1,2 мг/кг бупренорфина с пролонгированным высвобождением (ЭР) подкожно для послеоперационной анальгезии. Положите мышь в положение лежа на спине с вытянутыми передними конечностями и задними лапами и закрепите конечности лентой; Затем подготовьте стерильное поле для операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что передние конечности расслаблены при фиксации, чтобы не препятствовать дыханию.
  4. Подготовьте брюшную полость с помощью теплых стерильных тампонов с солевым раствором и бетадином, чередуя каждый тампон 3 раза. Накидывайте брюшную полость стерильным способом.

2. Гепатэктомия

  1. Сделайте вертикальный лапаротомический разрез по средней линии кожи от мечевидного отростка до надлобковой области с помощью скальпеля. Далее острыми ножницами надрежьте белую линию так, чтобы войти в брюшную полость и продлить этот разрез на длину разреза кожи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Безопаснее сначала разрезать белую линию в субксифоидной области, где печень находится глубоко до брюшной стенки, чтобы избежать травмирования подлежащей кишки.
  2. Втяните брюшную стенку латерально с помощью соответствующих ретракторов; Затем зажмите мечевидный отросток с помощью кровоостанавливающего средства и втяните грудину сверху, чтобы обнажить печень.
  3. Втяните печень вниз, чтобы обнажить серповидную связку, а затем пересеките связку по длине печени с помощью острых ножниц. Втяните печень вверх по направлению к грудной клетке, чтобы обнажить гепатогастральную связку и связки внутрипеченочной доли, и пересеките эти структуры с помощью острых микроножниц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Втягивание следует проводить очень осторожно с помощью влажных аппликаторов с ватными наконечниками, так как печень, заключенная в капсулу Глиссона, очень хрупкая и легко повреждается и разрывается.
  4. Втяните срединную долю вверх, сохраняя левую долю в исходном анатомическом положении. Оберните шелковый шов 5-0 вокруг верхнемедиальной части LL. Отразите LL вверх по направлению к грудной клетке, чтобы обнажить нижнюю поверхность доли, сведите концы швов у основания мочки и завяжите шов у основания. Убедитесь, что шов не препятствует кровотоку в нижней полой вене (НПВ) или воротной вене, прежде чем накладывать шов на ЛЛ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего завязывать этот шов, когда ЛЛ отражается вверх по направлению к грудной клетке, чтобы портальная триада хорошо обнажалась во время лигирования. Это облегчает резекцию доли близко к основанию без нарушения прилегающих структур.
  5. Резецируйте LL дистальнее шовной завязки с помощью острых ножниц и убедитесь, что небольшая манжета ткани (~ 2 мм) отделяет шов от края резецируемой доли. Подтвердите гемостаз.
  6. Отразите срединную долю вверх по направлению к грудной клетке, наложите шелковый шов 5-0 вокруг основания ML и верните ML в исходное анатомическое положение. Приблизьте концы швов над основанием верхней части ML и убедитесь, что они завязаны у основания мочки. Резецируйте перевязанный ML, оставляя небольшую манжету из остатков ткани вокруг завязки из швов. Подтвердите гемостаз.
  7. Мобилизуйте печень справа налево, чтобы обнажить правую верхнюю и нижнюю доли и тщательно отразите эти доли медиально и снизу. Наложите шов 5-0 на верхнюю медиальную поверхность РУЛ, чтобы убедиться, что шов обхватывает основание РУЛ, а затем отразите РУЛ в направлении грудной клетки. Оберните шов под РУЛ и завяжите концы близко к его основанию, затем резецируйте его, оставив небольшую манжету из остатков ткани вокруг шовной завязки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Завязывание слишком проксимальнее основания РЛЛ может нарушить кровоснабжение РЛЛ, что может привести к ишемии РЛЛ и смерти мыши в течение 24 ч после операции. Напротив, слишком удаленное от основания РУЛ связывание уменьшает количество резецированной массы печени, тем самым увеличивая показатели послеоперационной выживаемости по сравнению с ожидаемыми.
  8. Верните оставшуюся печень в анатомическое положение в состоянии покоя и обеспечьте гемостаз. При необходимости надавите марлей на участки незначительного кровотечения на резецированных краях печени.
  9. Закройте среднюю линию брюшной стенки (фасцию и мышечные слои) с помощью полиглактинового шва 5-0 непрерывным способом. Закройте разрез кожи скобами или швами из мононити 5-0.
  10. Прекратите анестезию и наблюдайте за мышью, пока она не придет в сознание и не сможет нормально передвигаться.

3. Послеоперационный уход

  1. Наблюдайте за мышью после операции, чтобы обеспечить надлежащее восстановление (т.е. мышь бодрствует, бдительна и передвигается в пределах клетки) и контроль боли. Осматривайте мышь каждые 2 часа до 6 часов после процедуры, а затем ежедневно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что после операции мышь будет медленнее передвигаться в клетке. Мышь должна восстанавливаться в изолированной клетке от других мышей и возвращаться в компанию других мышей только тогда, когда она полностью восстановится.
  2. Вводите подогретый обычный физиологический раствор (0,1-1,0 мл, подкожно или внутрибрюшинно), если у мыши развивается гиповолемия из-за нечувствительной жидкости или чрезмерной кровопотери после операции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ожидается, что успешная расширенная 78% гепатэктомия вызовет 50% смертность в течение 1 недели у здоровых взрослых мышей в возрасте 8-12 недель16 недель. При правильном выполнении ожидается минимальная кровопотеря. Остаточное кровотечение, которое сохраняется, можно контролировать с помощью ручного давления. Периоперационная смерть в течение 24 ч после операции часто вызвана техническими ошибками. К техническим сбоям относятся непреднамеренное повреждение крупных кровеносных сосудов, вызывающее тр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для успешного выполнения расширенной 78% гепатэктомии, вызывающей 50% летальность у мышей, крайне важно, чтобы каждая доля печени была точно резецирована. Такой уровень компетентности и точности может быть достигнут только в том случае, если процедура выполняется повторно. Кривая обучения варьируется у разных операторов, но обычно требует 3-6 месяцев практики. Резекция печени, при которой удаляется менее 78% TLM, приведет к более высоким показателям выживаемости, в то время как резекция печени, при которой удаляется боле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет никаких конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами NIH R01 DK063275 и HL086741 CF. PB и TA являются получателями стипендии NRSA от HL007734 учебного гранта NHLBI T32.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2 x 2 МарляCovidien2146Хирургия: диссекция
5-O Нейлоновая монофиламентная шовная тканьOasis50-118-0631Хирургия: Ушивание кожи
5-O Шелковый шовFine Science Tools18020-50Хирургия: лигирование доли печени
5-O Викрил Шовный материалEthiconNC9335902Хирургия: Закрытие брюшной стенки
ЩипцыAddsonBraintree ScientificFC028Хирургия: вскрытие
спиртовых тампонов (2)BD326895дезинфицирующее средство
бупренорфин с пролонгированным высвобождением ZoopharmN/AАнальгезия
Беспроводной триммерBraintree ScientificCLP-9868-14Бритье
изогнутых щипцовBraintree ScientificFC0038Хирургия: рассечение
ГемостатBraintree ScientificFC79-1Хирургия: рассечение
Изофлуран Ингаляционный анестетик Patterson VeterinaryRXISO-250для общей анестезии
(2 слота) (2 слота) BraintreeScientificACD-001Хирургия: для удержания небольших ретракторов
Магнитный фиксатор (4 слота)Braintree ScientificACD-002Хирургия: для удержания малых ретракторов
МикроножницыBraintree ScientificSC-MI 151Хирургия: диссекция
Операционный лотокBraintree ScientificACD-0014Хирургия: для создания хирургической области 
Повидон йод 10% тампон (2)Дезинфицирующий
скальпель Medline MDS093901ZZ (15 лезвий)Aspen Хирургические изделия371615Хирургия: рассечение
Острые ножницы (изогнутые)Braintree ScientificSC-T-406Хирургия: рассечение
острыми ножницами (прямые)Braintree ScientificSC-T-405Хирургия: рассечение
Маленькая Аппликаторы с ватным наконечникомFisher Scientific23-400-118Хирургия: рассечение
тканевых щипцов (прямой x2)Braintree ScientificFC1001Хирургия: диссекционная
греющая салфетка (18" x 26")StrykerTP 700Согревающая
прокладка насосStrykerTP 700Ретрактор
ручки для обогрева проволоки (2) Braintree ScientificACD-005Хирургия: для облегчения воздействия на брюшную полость
Система анестезии для мелких животных Xenotec Isoflurane Система анестезии мелких животныхBraintree ScientificEZ-108SAОбщая анестезия: содержит вазоризатор и консоль изофлурана, индукционную камеру, регулятор/шланг, маску для лица (M)
Магнитный фиксатор

Ссылки

  1. Martins, P. N., Theruvath, T. P., Neuhaus, P. Rodent models of partial hepatectomies. Liver Int. 28 (1), 3-11 (2008).
  2. Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of the liver I. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol. 12, 186-202 (1931).
  3. Koniaris, L. G., McKillop, I. H., Schwartz, S. I., Zimmers, T. A. Liver regeneration. J Am Coll Surg. 197 (4), 634-659 (2003).
  4. Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43 (2), S45-S53 (2006).
  5. Inderbitzin, D., et al. Magnetic resonance imaging provides accurate and precise volume determination of the regenerating mouse liver. J Gastrointest Surg. 8 (7), 806-811 (2004).
  6. Clavien, P. A., et al. What is critical for liver surgery and partial liver transplantation: size or quality. Hepatology. 52 (2), 715-729 (2010).
  7. Dahm, F., Georgiev, P., Clavien, P. A. Small-for-size syndrome after partial liver transplantation: definition, mechanisms of disease and clinical implications. Am J Transplant. 5 (11), 2605-2610 (2005).
  8. Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
  9. Kamali, C., et al. Extended liver resection in mice: state of the art and pitfalls-a systematic review. Eur J Med Res. 26 (1), 6(2021).
  10. Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
  11. Borowiak, M., et al. Met provides essential signals for liver regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (29), 10608-10613 (2004).
  12. Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Lab Anim (NY). 37 (11), 529-532 (2008).
  13. Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J Invest Surg. 16 (2), 99-102 (2003).
  14. Mitchell, C., Willenbring, H. Erratum: A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat Protoc. 9 (6), 1532(2014).
  15. Studer, P., et al. Significant lethality following liver resection in A20 heterozygous knockout mice uncovers a key role for A20 in liver regeneration. Cell Death Differ. 22 (12), 2068-2077 (2015).
  16. Longo, C. R., et al. A20 protects mice from lethal radical hepatectomy by promoting hepatocyte proliferation via a p21waf1-dependent mechanism. Hepatology. 42 (1), 156-164 (2005).
  17. Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
  18. Diehl, A. M., Rai, R. M. Liver regeneration. 3. Regulation of signal transduction during liver regeneration. FASEB J. 10 (2), 215-227 (1996).
  19. Diehl, L., Morse, M. A comparison of selected organ weights and clinical pathology parameters in male and female CD-1 and CByB6F1 hybrid mice 12-14 weeks in age. , Available from: https://www.criver.com/sites/default/files/resources/doc_a/AComparisonofSelectedOrganWeightsandClinicalPathologyParametersinMaleandFemaleCD-1andCByB6F1HybridMice12-14WeeksinAge.pdf (2023).
  20. CD-1® IGS mouse. Charles River Laboratories. , Available from: https://www.criver.com/products-services/find-model/cd-1r-igs-mouse?region=3611 (2023).
  21. C57BL/6J mouse organ weight. The Jackson Laboratory. , Available from: https://www.jax.org/de/-/media/jaxweb/files/jax-mice-and-services/b6j-data-summary.xlsx (2023).
  22. Inderbitzin, D., et al. Regenerative capacity of individual liver lobes in the microsurgical mouse model. Microsurgery. 26 (6), 465-469 (2006).
  23. Zhou, X., et al. L-carnitine promotes liver regeneration after hepatectomy by enhancing lipid metabolism. J Transl Med. 21 (1), 487(2023).
  24. Linecker, M., et al. Omega-3 fatty acids protect fatty and lean mouse livers after major hepatectomy. Ann Surg. 266 (2), 324-332 (2017).
  25. Haber, B. A., et al. High levels of glucose-6-phosphatase gene and protein expression reflect an adaptive response in proliferating liver and diabetes. J Clin Invest. 95 (2), 832-841 (1995).
  26. Rickenbacher, A., et al. Arguments against toxic effects of chemotherapy on liver injury and regeneration in an experimental model of partial hepatectomy. Liver Int. 31 (3), 313-321 (2011).
  27. Aravinthan, A. D., et al. The impact of preexisting and post-transplant diabetes mellitus on outcomes following liver transplantation. Transplantation. 103 (12), 2523-2530 (2019).
  28. Gonzalez, H. D., Liu, Z. W., Cashman, S., Fusai, G. K. Small for size syndrome following living donor and split liver transplantation. World J Gastrointest Surg. 2 (12), 389-394 (2010).
  29. Mahmud, N., et al. Risk prediction models for post-operative mortality in patients with cirrhosis. Hepatology. 73 (1), 204-218 (2021).
  30. Kooby, D. A., et al. Impact of steatosis on perioperative outcome following hepatic resection. J Gastrointest Surg. 7 (8), 1034-1044 (2003).
  31. Ma, K., et al. A mesenchymal-epithelial transition factor-agonistic antibody accelerates cirrhotic liver regeneration and improves mouse survival following partial hepatectomy. Liver Transpl. 28 (5), 782-793 (2022).
  32. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
  33. Ramsey, H. E., et al. A20 protects mice from lethal liver ischemia/reperfusion injury by increasing peroxisome proliferator-activated receptor-alpha expression. Liver Transpl. 15 (11), 1613-1621 (2009).
  34. Arvelo, M. B., et al. A20 protects mice from D-galactosamine/lipopolysaccharide acute toxic lethal hepatitis. Hepatology. 35 (3), 535-543 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Расширенная гепатэктомиярегенерация печеничастичная гепатэктомиясиндром малой печенирезекция печенигепатопротекторная генная терапиягенная терапия с использованием гена A20маргинальные трансплантаты печенипеченочная недостаточность
Расширенная 78% гепатэктомия на мышиной хирургической модели
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.