Парадигмы поведенческой оценки у дрозофилы Модель расстройства аутистического спектра

Расстройство аутистического спектра (РАС) включает в себя гетерогенную группу неврологических расстройств. Он включает в себя ряд сложных расстройств развития нервной системы, характеризующихся мультиконтекстуальными и стойкими дефицитами в социальной коммуникации и социальном взаимодействии, а также наличием ограниченных, повторяющихся поведенческих и активных моделей и интересов¹. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), у 1 из 100 детей во всем мире диагностируется РАС с соотношением мужчин и женщин 4,2². Болезнь становится очевидной на втором или третьем году жизни. Дети с РАС демонстрируют отсутствие интереса к социально-эмоциональной взаимности, невербальному общению и навыкам взаимоотношений. Они демонстрируют повторяющееся поведение, такое как стереотипные моторные движения, негибкое и ритуализированное следование рутине, а также интенсивное внимание к ограниченным интересам. Дети с РАС демонстрируют высокую степень реакции на прикосновение, обоняние, звук и вкус, в то время как реакция на боль и температуру^{сравнительно низкая}. Пенетрантность этого расстройства также различна у разных пациентов, страдающих аутизмом, и, следовательно, вариабельность увеличивается.

В настоящее время клинический диагноз РАС основан на поведенческой оценке индивидуумов, поскольку не существует подтверждающего, основанного на биомаркерах или общего генетического теста, который охватывал бы все формы РАС³. Расшифровка генетических и нейрофизиологических основ была бы полезна для определения стратегий лечения. За последнее десятилетие большое количество исследований привело к идентификации сотен генов, которые либо удалены, либо мутировали, или уровни экспрессии которых изменены у пациентов с РАС. Текущие исследования подчеркивают валидацию вклада этих генов-кандидатов с использованием модельных организмов, таких как мышь или плодовая муха, у которых эти гены нокаутируются или сбиваются с ног, после чего проводятся тесты на поведенческие дефициты, подобные РАС, и выясняются основные генетические и молекулярные пути, вызывающие аномалии. Мышиная модель, повторяющая вариации числа копий (CNV) в хромосомных локусах человека 16p11.2, показывает некоторые поведенческие дефекты РАС ^4,5,6. Пренатальное воздействие тератогенного препарата вальпроевой кислоты (VPA) является еще одной моделью мыши, демонстрирующей черты, напоминающие человеческие ASD ^7,8. Кроме того, существует ряд мышиных моделей, которые демонстрируют генетический синдром-ассоциированный аутизм, например, одногенные синдромные модели, вызванные мутациями в Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c, и одногенные несиндромальные модели, вызванные мутациями в таких генах, как Cntnap2, Shank, Neurexin или Neuroligin ⁵.

Плодовая муха (Drosophila melanogaster) является еще одним известным модельным организмом для изучения клеточных, молекулярных и генетических основ множества заболеваний^{человека, включая} РАС. Дрозофилы и люди имеют общие высококонсервативные биологические процессы на молекулярном, клеточном и синаптическом уровнях. Плодовые мушки были успешно использованы в исследованиях РАС 10,11,12 для характеристики генов, связанных с РАС, и расшифровки их точной роли в синаптогенезе, синаптической функции и пластичности, сборке нейронных цепей и созревании; Было обнаружено, что гомологи генов, ассоциированных с РАС, играют роль в регуляции социального и/или повторяющегося поведения 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Плодовая муха также работала в качестве модели для скрининга генов РАС и их вариантов 15,22,23. Самая большая проблема в исследованиях РАС на мухах заключается в том, что, в отличие от других моделей заболеваний, не существует единой модели мухи с РАС. Чтобы понять влияние мутаций или подавления определенного гена РАС, исследователь должен проверить, достаточно ли поведенческие фенотипы имитируют симптомы пациентов с РАС, а затем перейти к пониманию молекулярных или физиологических основ фенотипов.

Следовательно, обнаружение РАС-подобных фенотипов имеет жизненно важное значение для исследований РАС на модели мухи. За эти годы появилось несколько поведенческих методов, которые позволяют нам обнаруживать аномалии, такие как дефицит социального поведения/взаимодействия, общения, повторяющегося поведения и реакции на раздражители. Кроме того, в различных лабораториях было внесено несколько модификаций и обновлений этих поведенческих методов в соответствии с конкретными требованиями, такими как масштабирование, автоматизация анализов, считывание, количественная оценка и методы сравнения. В этой видеостатье демонстрируются самые основные версии пяти поведенческих парадигм, которые в сочетании могут быть использованы для выявления поведенческих исходов РАС самым простым способом.

Агрессия – это эволюционно консервативное врожденное поведение, влияющее на выживание и размножение^. На агрессивное поведение по отношению к сородичам влияет «мотивация к социализации»^25,26, а также «общение»²⁷, которые скомпрометированы у людей с РАС. Агрессивное поведение хорошо описано у дрозофилы, а его количественная оценка с помощью надежного анализа агрессии 28,29,30 и хорошо изученная генетическая и нейробиологическая основа ³¹ делают его подходящей поведенческой парадигмой³² для оценки фенотипа РАС на модели мухи. На агрессию влияет социальная изоляция вдали от социальной среды, что приводит к усилению агрессии; То же самое наблюдалось, когда самцы мух содержались в изоляции в течение нескольких дней^33,34. Еще одним поведенческим анализом, который количественно оценивает общительность у мух, является Social Space Assay³⁵, который измеряет расстояния между ближайшими соседями и расстояния между мухами в небольшой группе мух, что делает его идеально подходящим для проверки роли ортологов гена ASD у мух 12,21,36,37^, а также у моделей мух с РАС, вызванных окружающей средой^{38. 39}.

Тест на ухаживание дрозофилы является еще одной поведенческой парадигмой, часто используемой для анализа на изменение социальных и коммуникативных навыков при круговых или генетических манипуляциях, включая гены, связанные с аутизмом 18,19,21,40. Повторяющиеся модели поведения преобладают у пациентов с РАС, которые повторяются у мух путем груминга — серии отчетливых, стереотипных действий, выполняемых для уборки и других целей. Он был успешно использован для анализа влияния мутаций гена РАС у мух ^21,41, а также воздействия химических веществ ^38,39. Многочисленные усовершенствования и автоматизация в анализе были описаны ранее 16,41,42,43; Здесь мы демонстрируем самую простую схему анализа, которую легко принять и количественно оценить.

Известно, что РАС влияет на способность к привыканию, обучению и памяти у некоторых пациентов 44,45,46,47,48,49,50, модельные организмы ^{РАС 51,52}, а также вызывает дефицит различного обонятельного поведения⁵⁰. Привыкание дрозофил к прыжку при выключении света ранее использовалось для скрининга генов РАС²³. Привыкание может быть измерено простым методом анализа обонятельного привыкания 53,54,55. Мы описываем метод индуцирования обонятельного привыкания и анализа результата с использованием классического бинарного анализа выбора запаха⁵⁶ на основе Y-лабиринта, который может быть использован для выявления дефектов привыкания при мутантном гене РАС или состоянии нокдауна гена. Чтобы оценить, является ли влияние мутации (или нокдауна гена) или фармакологического лечения на поведение мухи фенотипом, подобным РАС, можно использовать комбинацию этих 5 анализов, описанных здесь.

Подробную информацию обо всех материалах и реагентах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Анализ на агрессию

1. Подготовка арены для анализа на агрессию
   1. Возьмите стандартный планшет с 24 лунками (рисунок 1A) и используйте каждую лунку планшета в качестве отдельной «арены» (рисунок 1B) для агрессии мухи. Заполните половину каждой лунки обычным кормом для мух и дайте ему высохнуть в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию, на арене может быть предусмотрена точка фокусировки для агрессии, например, точка дрожжевой пасты или обезглавленная самка для обеспечения мужской агрессии.
   2. Возьмите любой прозрачный пластиковый/акриловый лист, достаточно, чтобы покрыть поверхность примерно тремя-четырьмя лунками. Перфорируйте лист, чтобы сделать небольшое отверстие диаметром ~2,5 мм для введения отдельных мушек в лунки через него.
2. Подготовка аспиратора от мухи
   1. Возьмите резиновую/силиконовую трубку длиной 30-50 см (рисунок 1C1).
   2. Возьмите наконечник пипетки объемом 200 мкл (или 1 000 мкл) и отрежьте его на расстоянии ~1 см от узкого кончика. Вставьте отрезанный конец в один конец резиновой трубки; Этот наконечник будет «ротовым концом», используемым для аспирации через рот.
   3. Возьмите еще один наконечник пипетки и отрежьте узкий конец этого наконечника, чтобы сделать отверстие, достаточное для того, чтобы муха могла проникнуть через него. Вставьте основание этого наконечника для пипетки в хвостовой конец трубки; это будет «конец мухи» аспиратора, откуда муха будет отсасывать (Рисунок 1C2).
   4. Вставьте кусок сетчатой ткани или тонкий слой ваты на «конец мухи» трубки – в место соединения трубки и кончика. Убедитесь, что муха, всасываемая в наконечник пипетки, остается в ловушке наконечника, перед сеткой.
   5. Загерметизируйте места соединения между трубкой и наконечниками пипетки с помощью парапленки.
3. Подготовка однокорпусных пробирок и групповых пробирок
   1. Подготовка однокорпусных труб
      1. Добавьте почти 500 μл свежеприготовленного корма для мух в микрофуговую пробирку объемом 2 мл (рис. 1D). С помощью мини-центрифуги вытяните продукты на нижнюю часть пробирки.
      2. Дайте пище застыть при комнатной температуре, держа крышку открытой в течение ночи. Накройте трубки тонким куском ткани, чтобы предотвратить попадание в них бродячих мух.
      3. Продырявите крышки микропробирок иглами для циркуляции воздуха и закройте крышки после того, как пища застынет.
   2. Приготовление флаконов с групповым размещением
      1. Возьмите обычные флаконы от мух и наполните минимальное количество флаконов свежеприготовленной пищей (Рисунок 1D).
4. Подготовка мух перед экспериментом
   1. Поддерживайте линии мух желаемых генотипов в обычных стеклянных/пластиковых бутылках, содержащих стандартный корм для мух, в инкубаторе при температуре 25 °C в течение 12-часового цикла свет/темнота.
   2. Соберите вновь отобранных (от 0 до 24 ч) мух нужного генотипа и разделите их по полу под наркозом углекислого газа с помощью стереомикроскопа.
   3. Вставляйте половину самцов мух по отдельности в «однокорпусные трубки». Держите вторую половину самцов мух в группе из 10 человек, а самок — в обычных «групповых пробирках», создавая социальные условия. Хранить все пробирки и флаконы при температуре 25 °C в течение 5 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте температуру 24-25 °C и влажность ~50% в комнате поведения. В качестве образцов использовались следующие штаммы мух: w¹¹¹⁸ и трансгетерозиготные мутантные мухи FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)⁵⁷. Мухи Fmr1 , которые содержались в изоляции в течение 5 дней, демонстрируют значительно сниженные приступы агрессии по отношению к другому самцу (Рисунок 1E).
5. Проведение эксперимента по агрессивному поведению
   1. Проведите эксперимент с агрессией во временном окне ZT0-ZT3, поскольку мухи демонстрируют пиковую активность в это время суток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ZT = время Zeitgeber в стандартном 12-часовом цикле свет/темнота; ZT0 = загорается, то есть в начале световой фазы, ZT3 = через 3 часа после начала световой фазы и так далее. ZT12 = свет выключен.
   2. Перенесите двух самцов мухи из камер с одиночным или групповым содержанием методом аспирации ртом на арену агрессии через отверстие в крышке; Немедленно отодвиньте отверстие, чтобы мухи не смогли убежать.
   3. Дайте мухам акклиматизироваться в пределах арены в течение 1-2 минут. Запустите таймер на 20 минут. Записывайте на видео мух в течение всех 20 минут, разместив камеру или мобильный телефон точно вертикально над ареной с помощью подставки. Убедитесь, что виды агрессивных схваток видны на видео.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте четкое освещение арены и избегайте попадания бликов/отражений от крышки непосредственно на объектив камеры.
   4. Повторите эксперимент для 15-20 пар мух для каждого генотипа и каждого типа жилищных условий.
      Примечание: Бессознательная предвзятость может быть сведена на нет двойным ослеплением контрольных и тестовых мух, а также видеофайлов, принадлежащих к нескольким генотипам.
6. Анализ данных анализа на агрессию
   1. Перенесите видеофайлы на компьютер с достаточно большим экраном, чтобы были видны агрессивные схватки.
   2. Посмотрите видео и посчитайте общее количество агрессивных боев за 20 минут^58,59.
   3. Собирайте и систематизируйте данные по каждому генотипу и каждому типу жилья в электронной таблице и выполняйте анализ данных с помощью любого статистического программного обеспечения. Выполните двухсторонний t-критерий и отобразите данные в виде прямоугольника и усов.

2. Анализ социального пространства

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол анализа, арена и анализ, описанные здесь, были описаны ранее^60,61.

1. Подготовка арены для анализа социального пространства (SSA)
   1. Поместите обе треугольные акриловые распорки (высота = 8,9 см, основание = 6,7 см и толщина = 0,3 см) на верхнюю часть прямоугольного стекла (13,5 см x 10,4 см, толщина 0,3 см) таким образом, чтобы прямые углы акриловых распорок совпадали с углами стекла (рис. 2A).
   2. Положите две прямоугольные акриловые распорки (6,7 см х 1,5 см, толщина = 0,3 см) на стеклянную панель, выровненную по основаниям двух треугольных распорок. После этого убедитесь, что четыре акриловые распорки окружают треугольную арену (~2,16 кв. см⁶¹) на прямоугольном стекле, которое не закрыто распорками (рис. 2A, B). Поместите наклейку с изображением линейки (рисунок 2C) на одну из треугольных распорок и убедитесь, что она видна сверху.
   3. Теперь поместите второе прямоугольное стекло (13,5 см x 10,4 см, толщина 0,3 см) поверх акриловых распорок так, чтобы оно совпадало со стеклом внизу; Акриловые распорки в конечном итоге оказывались зажатыми между стеклянным пространством, оставляя треугольное пространство посередине между двумя стеклянными панелями. Используйте четыре небольших зажима для крепления стекол и распорок.
2. Подготовка мух к SSA
   1. Соберите вновь отобранных (от 0 до 24 ч) мух нужного генотипа и разделите их по полу под холодной анестезией с помощью стереомикроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Охладите аппарат для холодной анестезии (можно использовать чашку Петри) в инкубаторе при температуре -20 °C. Поместите мух в пустые флаконы, погрузите эти флаконы в лед (в ведро со льдом) до тех пор, пока мухи не станут неподвижными, поместите их на холодную чашку Петри и начните сортировать.
   2. Храните самцов и самок мух отдельно в течение 24 часов в пищевых флаконах в инкубаторе при температуре 25 °C с 12-часовым циклом свет/темнота.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для продемонстрированных здесь экспериментов использовались штаммы мух w¹¹¹⁸ и трансгетерозиготные мутантные мухи FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
3. Проведение эксперимента SSA
   1. Поддерживайте те же условия эксперимента, что и при анализе на агрессию (температура: 24-25°C, влажность ~ 50%) и проводите эксперимент во временном окне ZT0-ZT3.
   2. Снимите нижний правый зажим для связующего и слегка сдвиньте прямоугольную распорку наружу, чтобы между двумя прямоугольными распорками образовался зазор (~0,5 см).
   3. Переложите мух (собранных накануне) из флакона с едой в пустой флакон. Перенесите их на арену социального пространства (треугольную область) с помощью мягкого устремления через пространство, созданное между прямоугольными распорками. Немедленно закройте пространство, сдвинув прямоугольную распорку и зажим для связующего вещества на свои места, и убедитесь, что не осталось места для побега мух.
   4. Удерживая камеру в вертикальном положении, осторожно постучите по камере 3 раза по мягкой подушечке, чтобы убедиться, что все мухи находятся у основания камеры в начале эксперимента.
   5. Зажмите камеру SSA в вертикальном положении и запустите таймер. Сделайте четкую фотографию арены через 20 минут, когда мухи сядут на свои места на арене и продемонстрируют минимальное движение. Избегайте бликов и неравномерного освещения.
   6. Повторите эксперимент 3 раза для той же популяции мух, отбивая мух и повторяя шаги из шагов 2.3.5 по 2.3.7 (внутренние репликации). Повторите 3 раза с другой популяцией мух того же генотипа/состояния (независимые повторы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заморозьте пробирную камеру, чтобы выбросить мух из камеры. Протрите стеклянные и пластиковые поверхности этанолом, чтобы удалить все запахи после одного раунда эксперимента с одной группой мух.
4. Анализ данных анализа социального пространства
   1. Проанализируйте изображения в программном обеспечении ImageJ⁶² и перечислите расстояния между ближайшими соседями, как описано ранее⁶¹.
   2. Выполняйте статистический анализ и стройте графики с помощью статистического программного обеспечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы мух, использованные для описанного здесь анализа SSA, были w¹¹¹⁸ и трансгетерозиготными мутантными мухами Fmr1 (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)⁵⁷. Мухи Fmr1 показывают значительно увеличенное расстояние от ближайших соседей (рисунок 2D).

3. Проба на ухаживание

1. Брачная палата
   1. Соберите все четыре части камеры ухаживания (рисунок 3А) вместе в порядке, показанном на рисунке 3В. Каждая перфорация центрального диска, зажатая между крышкой и основаниями, будет работать как «камера ухаживания» (Рисунок 3C).
2. Получение спаренных сук
   1. Запустите и обслуживайте несколько бутылок с культурой CS (Canton S, дикий тип) с ~60-100 самцами и самками мух в каждой бутылке с едой.
   2. Когда взрослые особи появятся, выбросьте всех взрослых мух и перенесите мух, выходящих из этих бутылок, каждые 2-3 часа в новые флаконы с пищей, дополненные небольшим количеством дрожжевой пасты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте переполнения флаконов. Будьте осторожны, чтобы не перенести старых мух, личинок или куколок в брачный флакон.
   3. Инкубируйте эти «брачные флаконы» в течение 4 дней, чтобы убедиться, что все самки спарились.
3. Подготовка однокорпусных трубок для самцов
   1. Добавьте около 500 μL корма для мух в каждую микрофуговую пробирку объемом 2 мл. С помощью миницентрифуги вытяните продукты вниз к нижней части пробирки.
   2. Дайте за ночь застыть пище, разрежьте крышку микрофуг-пробирки, накройте ее парапленкой и продырявите парапленку иглой для циркуляции воздуха.
4. Сбор и изоляция девственных самцов
   1. Установите скрещивание с 10-15 самцами и 20-30 девственными самками желаемых генотипов в отдельные пищевые флаконы.
   2. Соберите из потомства девственных самцов желаемых генотипов и храните их по отдельности в «однокорпусных пробирках» с помощью аспиратора. Каждые 5-6 ч продолжайте собирать только что закрытых самцов (до 40-50 самцов на каждый генотип) и выделять их в отдельные однокорпусные пробирки.
   3. Снова запечатайте крышку тубы с парапленкой.
5. Проведение эксперимента по брачному анализу
   1. После 5 дней изоляции испытуемых самцов проведите анализ ухаживания в течение временного окна ZT0-ZT3.
   2. Заранее настройте устройства видеозаписи, ориентируясь на рабочее место для анализа.
   3. С помощью аспиратора соберите одну предварительно спаренную самку (возрастом 6-10 дней) из брачных флаконов и вставьте в брачную камеру.
   4. С помощью аспиратора осторожно перенесите самца (контрольную/тестовую) муху из однокорпусной трубки в камеру ухаживания, содержащую одну предварительно спаренную самку, через передаточное отверстие. Быстро поверните крышку, чтобы закрыть камеру.
   5. Видеозапись поведения мух в течение 15 минут.
6. Анализ видеоданных и статистика
   1. Перенесите видеофайлы на компьютер; Обратите внимание на продолжительность времени, проведенного самцом в ухаживании в течение 15 минут, вручную просмотрев видео.
   2. Рассчитайте индекс ухаживания (ДИ) для каждого самца мухи, который представляет собой долю (или процент) времени, затраченного самцом на ухаживание за самкой в течение 15 минут.
   3. Подсчитайте общее количество попыток совокупления за 15 минут.
   4. Обратите внимание на продолжительность временной задержки, показанную самцом перед его первой попыткой ухаживания, как на латентность ухаживания (CL).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется анализировать 40-60 мужчин по каждому состоянию/генотипу для достижения статистической мощности и определения согласованности результатов ДИ.

4. Анализ грумингового поведения

1. Арена для анализа груминга
   1. Используйте небольшую круглую камеру объемом ~0,4 см³ в качестве арены для записи поведения груминга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Та же самая арена ухаживания, описанная в разделе 3, может быть использована для оценки грумингового поведения.
   2. Поскольку груминг включает в себя запись движений более тонких органов, таких как ноги, используйте видеозапись с высоким разрешением или контрастом. Чтобы следовать этому протоколу, используйте светодиодную панель, покрытую диффузионным стеклом, в качестве равномерно освещенной поверхности размером 20 см х 20 см. Поместите камеру ухаживания на верхнюю часть панели, чтобы свет проходил снизу через камеру.
2. Подготовка мух перед экспериментом
   1. Поддерживайте экспериментальный генотип мух в пищевых бутылочках при температуре 25 °C с 12-часовым циклом свет/темнота.
   2. Соберите вновь отобранных (от 0 до 24 ч) мух нужного генотипа и разделите их по полу под холодной анестезией с помощью стереомикроскопа, как описано в анализе социального пространства.
   3. Изолируйте самцов мух в однокорпусных трубках (как это используется в анализе на агрессию) на 24 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для продемонстрированного здесь эксперимента использовались следующие штаммы мух: W¹¹¹⁸ и трансгетерозиготные мутантные мухи FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
3. Проведение анализа грумингового поведения
   1. Поддерживать температуру 24-25 °C и влажность ~50%; Проводите эксперимент во временном окне ZT0-ZT3¹⁶.
   2. Перенесите самца мухи из однокомнатной трубки в арену для груминга с помощью аспиратора. Сразу же сдвиньте отверстие в крышке, чтобы мухи не смогли убежать.
   3. Поместите арену для груминга на диффузную светодиодную панель и дайте мухе акклиматизироваться в пределах арены в течение 1 минуты. Записывайте на видео полет в течение 10 минут, расположив камеру точно вертикально над ареной, установленной на подставке. Убедитесь, что типы схваток по грумингу видны и поддаются количественной оценке на видео.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поведение груминга включает в себя трение головы, глаз, усиков, хоботка, живота, гениталий и крыльев ногами (первая пара: Т1, вторая пара: Т2 или третья пара ног: Т3). Поведенческие параметры груминга, которые были учтены в этом исследовании, описаны в Andrew et al. ⁴¹ и продемонстрированы на рисунке 4.
   4. Повторите эксперимент для каждого генотипа.
   5. Анализ поведенческих данных груминга
      1. Проанализируйте видео и рассчитайте следующие четыре параметра: индекс груминга (процент времени, затраченного на груминг); задержка груминга (время до первого приступа груминга); номер для груминга; и средняя продолжительность схватки (общая продолжительность боя/количество схваток).
      2. Отметьте один схватку как оконченную, когда муха либо перестает показывать какой-либо из параметров и остается неподвижной в течение 2 с, либо останавливает схватку и проходит не менее 4 шагов.

5. Анализ на привыкание к обонянию

ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано на рисунке 5, окончательная сборка должна быть выполнена в день анализа Y-образного лабиринта^54,56.

1. Подготовка мух к привыканию
   1. Выращивайте мух нужных генотипов для всех экспериментов в инкубаторе с температурой окружающей среды 25 ^°C и влажностью 70% при стандартном 12 ч световом цикле: 12 ч темнового цикла (LD).
   2. Соберите 0-12 ч старых, только что закрытых мушек и пересадите ~30-40 мух в свежую среднюю бутылку с затянутой хлопчатобумажной пробкой.
   3. Назначьте коды каждой бутылке, чтобы экспериментатор не знал о генотипах, являющихся объектом эксперимента.
2. Индукция обонятельного привыкания
   1. Поместите 1 мл предпочтительного одоранта, разведенного парафиновой жидкостью (светлая), в микрофужную пробирку объемом 1,5 мл. Для контроля достаточно использовать 1 мл парафиновой жидкости в микрофужеру объемом 1,5 мл. Перемешайте содержимое в тубе в течение 10 минут, чтобы обеспечить равномерное перемешивание, а затем накройте ее равномерно перфорированной полиэтиленовой пленкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В видео будет использоваться 20% этилбутират.
   2. Используйте проволоку для подвешивания трубок, содержащих разбавленный одорант, или только разбавляющую жидкость в отдельных бутылках с мухами.
   3. Хорошо накройте бутылки ватой, а затем оберните крафт-бумагой, чтобы предотвратить диффузию паров одоранта. Пометьте контрольные флаконы и флаконы, содержащие запах, как наивные и подверженные воздействию запаха (привыкшие) соответственно. Выдерживайте эти индукционные флаконы в течение 3 дней в инкубаторе с вышеуказанными условиями.
3. Подготовка мух и аппарат Y-лабиринта
   1. Переложите мух из индукционных бутылок во флаконы, содержащие только пропитанную водой фильтровальную бумагу.
   2. Морите их голодом в течение примерно 16-18 часов при комнатной температуре до начала эксперимента для повышения мотивации.
   3. Убедитесь, что компоненты аппарата Y-лабиринт чистые и не имеют запаха; Соберите четыре части в вертикальном положении. Прикрепите камеры для скалолазания к Y-образному лабиринту, который затем подключается к верхней части адаптера. Плотно прикрепите дно Y-образного лабиринта к входному флакону, который служит центральным стержнем внизу, как показано на рисунке 5.
   4. Соедините сужающийся конец каждой лазающей камеры с флаконами с реагентами, содержащими одорант (^10-3 разбавления дистиллированной водой) с помощью силиконовых трубок без запаха.
   5. С помощью вакуумного насоса накачайте одорант с одинаковой скоростью потока (~120 мл/мин) из газовых баллонов на два плеча Y и дайте ему насытиться в течение 15 минут для консистенции.
4. Выполнение классического анализа Y-образного лабиринта
   1. Аккуратно введите голодных мух из каждого флакона во входную пробирку Y-образного лабиринта.
   2. Дайте им акклиматизироваться в течение короткого периода времени; соедините входной флакон с адаптером Y-образного лабиринта, чтобы начать тест; и пусть мухи взбираются по рукавам Y-образного лабиринта и попадают в ловушку в двух камерах сбора. Установите продолжительность каждого теста равной 1 минуте.
   3. По завершении опустите мухи обратно на дно входного флакона и поменяйте положение рукавов Y-образного лабиринта, чтобы избежать бокового смещения. Сделайте четыре показания для одного и того же набора мух.
   4. Запишите количество мух, взбирающихся на каждый из двух рукавов Y-образного лабиринта в течение определенного периода времени.
   5. Повторите анализ не менее чем для 8 партий, чтобы получить репрезентативный набор данных.
5. Анализ и интерпретация собранных данных
   1. Количественно оцените результаты, рассчитав индекс эффективности (PI), который можно представить в виде разницы между числом мух, выбирающих воздушный рукав (A), и числом мух, выбирающих рукав запаха (O), в виде доли от общего числа участвующих мух.
   2. Используйте статистические тесты (непарный t-критерий Стьюдента), чтобы проверить, является ли значимым PI наивных мух по сравнению с мухами, подверженными воздействию запаха.

Анализ на агрессию
В качестве модели ASD мухи были использованы мутантные мухи Fmr1 63,64. w1118 самцов использовали в качестве контроля, а Fmr1 трансгетерозиготу Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M - 57 самцов в качестве экспериментальных мух; Взрослые самцы содержались в изоляторах в течение 5 дней. Гомотипические самцы (с одинаковым генотипом, теми же условиями содержания) были введены в арену агрессии и их поведение регистрировалось в течение 20 минут. Подсчитывалось общее количество агрессивных схваток за 20 мин для каждого генотипа. Было обнаружено, что количество агрессивных схваток в течение 20 мин значительно меньше у мутантных самцов, чем у самцов контрольной группы (рис. 1Е). Это снижение агрессивности у мух Fmr1 может быть связано со снижением интереса к социальному взаимодействию с другой мухой. Напротив, самцы мутантных мух Fmr1 в группе/социальном жилье демонстрируют сопоставимое количество приступов агрессии, как и у 1118 мух (данные не показаны), что, вероятно, указывает на положительную роль социальной среды в индукции социального поведения.

Анализ социального пространства
Анализ социального пространства проводили у мух с w1118 и ASD model (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). Для каждой мухи рассчитывали расстояние до ближайшего соседа и проводили 10 биологических репликаций для каждого генотипа. Мутантные мухи демонстрируют значительно большее расстояние до ближайшего соседа, чем контрольные аналоги (рисунок 2D), что указывает на предпочтение большего расстояния от других мух.

Проба на ухаживание
Анализ ухаживания самцов был проведен для количественной оценки врожденного поведения ухаживания двух отдельных моделей РАС. Во-первых, брачное поведение трансгетерозиготных мух Fmr1 сравнивалось с поведением w1118; Мухи Fmr1 показали значительно более низкий индекс ухаживания, а также меньшее количество попыток совокупления (рисунок 3E1). Во втором эксперименте ряд, ортолог дрозофилы гена POGZ человека (широко распространенный генриска РАС 20), был сбит с ног путем экспрессии микроРНК короткой шпильки против ряда в нейронах тела гриба с использованием драйверной линии MB247-GAL4. Эти мушки с РАС были протестированы на любой дефект врожденного паттерна ухаживания; Индекс ухаживания и количество попыток совокупления рассчитывались по 15-минутным видео. У нокдаун-мух был значительно снижен индекс ухаживания, а также количество попыток совокупления (рис. 3E2), что указывает на их дефектную коммуникацию по отношению к самкам.

Груминговое поведение
Поведение груминга используется в качестве индикатора повторяющегося поведения у дрозофил 16,42,43. Поведение груминга было количественно оценено у трансгетерозиготных мух Fmr1 и сравнено с таковым у w1118. Задержка до первого груминга значительно снижена у мух Fmr1, в то время как средняя продолжительность и индекс груминга значительно увеличены у мух Fmr1 (Рисунок 4C), что указывает на улучшенное поведение по грумингу (или повторению) у мух с РАС. Напротив, общее количество приступов груминга у мутантных мух существенно не изменилось по сравнению с контрольными мухами.

Анализ на привыкание к обонянию
Привыкание было обнаружено дефектным у большого числа аутистов, и оно может быть использовано в качестве анализа для того же у дрозофилы23. Здесь обонятельное привыкание было проверено в модели РАС путем сбивания ряда в обонятельных локальных интернейронах, управляемых LN1-GAL4. Отвратительный одорант, 20% этилбутирата, использовался в этих экспериментах, чтобы вызвать привыкание у этих мух. Результаты показывают, что мухи с рядным сбивкой не привыкли после 3-дневного воздействия запаха (последние два столбца на графике на рисунке 5Е не показывают существенной разницы между наивными и привыкшими мухами) по сравнению с мухами дикого типа, которые демонстрируют типичное привыкание после воздействия этилбутирата в течение 3 дней (подвергшиеся воздействию мухи демонстрируют значительное снижение индекса продуктивности по сравнению с наивными мухами). Это указывает на то, что мухи не привыкают после воздействия этилбутирата в течение 3 дней и отталкиваются отталкивающим запахом, доказывая, что эти мухи с аутизмом имеют дефицит привыкания.

Рисунок 1: Арена агрессии и репрезентативные поведенческие паттерны. (A) Арена агрессии установлена в 24-луночный планшет с перфорированной крышкой для входа мухи. Вставка: Размеры одной арены с кормом для мух в ней. (В) Фотография однокорпусной трубки, содержащей одного изолированного самца мухи, и флакона с групповым содержанием, содержащей самцов и самок мух, повторяющая социальную среду. (C) Аспиратор для переноса мух на основе аспирации рта. Предметы, необходимые для сборки аспиратора от мухи, с указанием сторон трубки для входа мухи (конец мухи) и сторона, которая будет вставлена в рот (конец рта) (C1) и собранный аспиратор от мухи (C2). (D) Типичные агрессивные поведенческие модели между самцами: приближение, угроза крылом, фехтование, удержание, выпад, бокс и борьба. (E) Мутантные самцы мух Fmr1 демонстрируют сниженное агрессивное поведение по отношению к другим самцам по сравнению с контрольной группой. Ящичковая диаграмма, показывающая количество агрессивных схваток у социально изолированных самцов w1118 (контроль) по сравнению с трансгетерозиготными мухами Fmr1 (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Установка пробирной арены для социального пространства. (A) Диаграмма, показывающая размеры и расположение стеклянных стекол и акриловых дистанционных рамок. (B) Окончательное расположение компонентов арены, где акриловые распорки зажаты между стеклянными частями, оставляя небольшой зазор для входа мух внизу. Треугольное пространство, созданное между стеклянными деталями и распорками, является ареной SSA для мух, здесь мухи могут двигаться только в двух измерениях. (C) Фотография окончательной установки арены SSA с мухами внутри камеры. Аббревиатура: SSA = массив социального пространства. (D) Мухи модели ASD (Fmr1 трансгетерозиготные) демонстрируют повышенное дистанцирование друг от друга в анализе социального пространства по сравнению с w1118. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Арена ухаживания и репрезентативные поведенческие модели. Диаграммы, показывающие (А) конструкцию и (Б) расположение дисков на арене для брачного анализа. (В) Фотография арены для ухаживания после окончательной договоренности. (D) Репрезентативные изображения, показывающие поведенческие модели ухаживания наивного самца по отношению к спаривающейся самке: преследование, ориентация, мелькание крыльев, облизывание, попытка совокупления и совокупление. (E) Графики, показывающие индекс ухаживания и количество попыток совокупления в двух моделях РАС: (E1) Мушки с мутантным Fmr1 демонстрируют значительное снижение индекса ухаживания и попыток копуляции по сравнению с контролем w1118 . (Е2) в качестве другой модели РАС были использованы мухи-нокдауны, в которых рядовая шРНК экспрессировалась в нейронах организма гриба(MB247-GAL4); Значительное снижение брачного поведения наблюдалось после нокдауна Роу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Настройка арены и репрезентативные поведенческие модели поведения груминга. (A) Дисковая арена или арена в форме колеса (та же, что и на рисунке 3) устанавливается на светодиодной панели с диффузором для равномерного освещения снизу, а видео захватывается сверху. Это обеспечивает более высокий контраст, необходимый для выявления тонких движений придатков во время груминга. (Б) Фотографии моделей поведения по уходу, наблюдаемых у взрослых самцов мух. T1 =1-я пара ног, T2 =2-я пара ног, T3 = третья пара ног. Интуитивно понятная сокращенная номенклатура используется для выкроек груминга в B: T1-голова = голова, натертая первыми ногами; T1-T1 = первая пара ног, потертых друг о друга, и так далее. Аббревиатура: LED = светодиод. (C) Графики, показывающие результаты анализа груминга, выполненного у трансгетерозиготных мух Fmr1 в сравнении с w1118. Мутантные мухи Fmr1 показали значительно меньшую латентность во время первого приступа груминга, что указывает на раннее начало груминга по сравнению с контролем. Кроме того, средняя продолжительность и индекс груминга были значительно увеличены у мутантов Fmr1 , что свидетельствует об усиленном повторяющемся поведении у модельных мух с РАС. Напротив, общее количество приступов груминга у мутантных мух существенно не изменилось по сравнению с контрольной группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Установка для индукции и анализа для привыкания к обонянию и репрезентативного результата после анализа. (A) Компоненты установки для бинарного выбора запаха: (A1) Y-лабиринт, (A2) адаптер, (A3) расположение этих двух, (A4) пара сборных трубок для прикрепления в верхней части рукавов Y-образного лабиринта, (A5) стеклянная бутылка и стеклянные трубки для хранения раствора одоранта или воды, через которую воздух будет пузыриться перед тем, как попасть в Y-образный лабиринт. (B) Установка бутылок с едой для мух для индукции обонятельного привыкания; на рисунке (В1) показано, как микрофуговая трубка, содержащая одорант, подвешивается на медной проволоке посередине внутри бутылки; (B2) наконец, отверстие бутылки закрывается ватой и запечатывается коричневыми бумажными конвертами. (C) Фотография общего расположения Y-образного лабиринта. (D) Фотографии, показывающие распределение мух в камерах сбора после окончания эксперимента. (Д1) Наивные мушки (подвергшиеся воздействию только парафина без запаха, контроль) демонстрируют отталкивание к отвратительному одоранту (20% этилбутирата, используемого для индукции привыкания в этом исследовании) и выбирают в рукаве Y-образного лабиринта, наполненного обычным воздухом, в то время как (D2) обнаженные (привыкшие) мухи равномерно распределяются в обеих руках. Сокращение: ID = внутренний диаметр. (E) Результаты анализа обонятельного привыкания у сбитых с ног мух показали дефект привыкания. Мухи дикого типа (Canton S) после 3-дневного воздействия этилбутирата показали значительное снижение индекса работоспособности по сравнению с наивными мухами, что свидетельствует о привыкании. Когда потомки мух LN1-GAL4 x рядной шРНК подвергались воздействию в течение 3 дней, было обнаружено, что индекс продуктивности существенно не отличается от такового у наивных мух; это демонстрирует, что эти мухи-сбитые с ног не привыкли к 3-дневному воздействию одоранта, повторяя симптом человека типа РАС. Сокращения: РАС = расстройство аутистического спектра; shRNA = короткая РНК шпильки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.