Разработка биогибридного зонда атомно-силовой микроскопии на основе укуса комара

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) сообщила, что трансмиссивные болезни (ВБД) составляют более 17% всех инфекционных заболеваний, которые вызывают более 7 000 000 смертей в год во всем мире. Например, будучи самым смертоносным животным в мире, комары распространяют многочисленные патогены, такие как лихорадка денге, малярия и вирус Зика, через кровососущих членистоногих, что приводит к 700 миллионам инфекций каждый год^. Исследования в направлении разработки эффективных мер по предотвращению ВБД имеют решающее значение, включая имитацию поведения комаров при проникновении для изучения механизмов их укуса и изучение потенциальных барьеров, чтобы доказать их эффективность в предотвращении проникновения. Одна из ключевых задач заключается в разработке надлежащих подходов к проведению таких расследований. В литературе были предприняты усилия, в том числе разработка микромасштабных игл, напоминающих геометрию жала комара; однако многие материалы, используемые для изготовления этих микроигл (т.е. вязкоупругие материалы², кремний (Si), стекло, керамика³ и т.д.), имеют другие механические свойства, чем биологический материал хоботка комара. Инженерные материалы могут быть хрупкими и склонными к разрушению и изгибу ^3,4, в то время как хоботок комара может лучше выдерживать перелом или коробление⁴. Преимущество наличия биогибридного зонда, использующего губу комара вместо инженерных материалов, заключается в том, что он может быть более точным представлением механизма прокалывания комаров. Кроме того, специализированные инструменты должны быть интегрированы с микроиглами для выполнения количественных исследований, таких как точное измерение силы⁵, что нелегко достижимо при индивидуальной настройке с использованием специальных микроигл.

Подход, основанный на атомно-силовой микроскопии (АСМ), является многообещающим в том смысле, что он работает с использованием кантилевера с ультратонким наконечником, который аккуратно расположен близко к поверхности образца. Наконечник может либо сканировать поперек, либо прижиматься к поверхности, испытывая различные силы притяжения или отталкивания из-за его взаимодействия с образцом⁶. Эти взаимодействия приводят к отклонению консоли, которое отслеживается отражением лазерного луча от верхней части консоли на фотодетектор⁶. Исключительная чувствительность системы к движению позволяет АСМ проводить широкий спектр измерений, включая, помимо прочего, морфологическое картирование с точностью пикометра, измерения сил в диапазоне от пиконьютонов до микроньютонов и комплексные мультифизические исследования⁷. Например, вдавливание АСМ может быть выполнено для точной оценки реакции на приложенную силу образца, а также для измерения твердости, эластичности и других механических свойств образца путем сопряжения с соответствующими аналитическими моделями⁸. Зонд АСМ чаще всего изготавливается из кремния (Si) или нитрида кремния (Si₃N₄)⁸ длиной 20-300 мкм⁹ и радиусом наконечника порядка нескольких до десятков нанометров¹⁰. Радиус наконечника в нанометровом масштабе может быть идеальным для таких приложений, как визуализация с высоким разрешением; однако он не обладает характеристиками биологических жал для исследований, которые пытаются имитировать поведение проникновения с точки зрения жесткости, радиуса, формы и соотношения сторон. Например, микроигольчатая структура комара представляет собой пучок, который имеет соотношение сторон ~60¹¹ (длина ~ 1,5 мм до 2 мм; диаметр ~ 30 мкм)¹². Хотя можно предположить, что обычный зонд АСМ напоминает биологическое жало, такое как лабрум, его отличительные свойства материала и размеры не будут отражать реальную ситуацию во время укуса.

Чтобы обеспечить количественные исследования проникающего поведения, имитирующего биологические укусы насекомых или других животных с жалами, здесь разработан процесс изготовления биогибридных консолей AFM с биологическим жалом в качестве наконечника. В качестве примера была успешно продемонстрирована консоль AFM с прикрепленным кончиком губы комара. Используя существующую информацию из литературы о типичных силах введения, которые комар использует для прокалывания кожи жертвы^12,13, этот биогибридный кантилевер АСМ потенциально может обеспечить почти реальную имитацию укусов комаров при обычном АСМ. Протокол использования микробиологических стингеров для изготовления биогибридных консолей АСМ также может быть применен для разработки других биогибридных кантилеверов АСМ на основе острых жал для количественных исследований различных механизмов укуса.

Термины
Схема хоботка и его компонентов, представляющих интерес, показана на рисунке 1, и их определения следующие: (1) Хоботок: часть тела комара изо рта, которая позволяет комару питаться, со структурой сердцевины и раковины, состоящей из пучка (сердцевины) и лабиума (раковины), (2) Губа: темный и тупой внешний покров хоботка², (3) Пучок: группа тонких игл, содержащихся внутри половых губ, включая две верхние челюсти, две челюсти, гипофаринкс и губу², (4) Гипофаринкс: отвечает за секрецию слюны в кровоток хозяина², (5) Верхние челюсти: зубчатый член, помогающий в механизме питания², (5) Нижние челюсти: подобно верхней челюсти, они помогают комару в механизме питания и имеют острый кончик², (6) Губа: основной элемент для проникновения в кожу жертвы, который намного больше, чем верхние челюсти, мандибулы и глотка. Он также имеет сенсорные структуры, которые позволяют ему находить кровеносные сосуды и внутренние каналы под кожей², (7) Манипулятор: узел с тремя степенями свободы и точностью в микронном масштабе для позиционирования, позволяющий двигаться в направлениях XYZ, (8) Зажим в сборе: изготовленный на заказ зажим из 2 частей, установленный на манипуляторе, используемом для зажима консольного АСМ без наконечника во время эксперимента.

Вид комаров, используемый для этого протокола, представляет собой неинфицированную взрослую самку Aedes aegypti (A. aegypti), полученную в замороженном виде и хранящуюся в морозильной камере при температуре -20 °C. Вид был предоставлен Ресурсным центром NIH/NIAID по исследованию филяриатозных реагентов для распространения через BEI Resources, NIAID, NIH: Uninfected Aedes aegypti, штамм Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. Реагенты и оборудование, использованные для исследования, перечислены в Таблице материалов.

1. Рассечение половой губы от хоботка

1. С помощью пинцета поместите мертвого комара на предметное стекло под микроскопом и убедитесь, что на конце хоботка есть конический наконечник (рисунок 2A).
2. Удерживая комара на предметном стекле, аккуратно поместите лезвие скальпеля на половые губы рядом с головой комара (рисунок 2B).
3. Сделайте разрез по всей верхней половине половой губы (разрез примерно 80 мкм) с небольшой глубиной проникновения через толщу половой губы. Обязательно слегка надавите на лезвие, чтобы разрезать только половые губы, но не пучок, который лежит под ним.
4. Пинцетом крепко держите голову комара, а другим точным пинцетом слегка зажмите половые губы в любом положении между коническим кончиком и местом разреза (рисунок 2B).
   1. Потяните пинцет, удерживающий половые губы, в направлении конического кончика (рисунок 2C). Продолжайте тянуть пинцет до тех пор, пока половые губы не вырвутся и не будут полностью удалены из пучка.
5. Поместите комара под микроскоп и проверьте, присутствует ли кончик губы. Это можно определить по наличию конического наконечника на пучке (рис. 2D).

2. Отделение кончика губы от других членов пучка

1. Зажмите и закройте кончики набора прецизионных пинцетов и поместите кончик пинцета рядом с губой рядом с ее кончиком.
2. С помощью наконечника пинцета приложите легкое усилие к губе в направлении, перпендикулярном длине пучка (рисунок 3A).
3. Продолжайте проталкивать губу по предметному стеклу до тех пор, пока не будет достигнуто отделение губы от других элементов пучка.
4. Осмотрите образец под микроскопом, чтобы убедиться, что было достигнуто правильное разделение между губой и другими элементами пучка (рис. 3, слева). Если разделение не удалось, вернитесь к шагу 2.1.

3. Обрезка кончика губы

1. Пока губа все еще находится на предметном стекле, поместите лезвие скальпеля на губу на расстоянии примерно ~200 μм от кончика губы (рисунок 4A). Аккуратно приложите достаточное давление и разрежьте кончик губы до конца. Хотя кончик губы в идеале должен быть как можно короче, ~200 мкм — это лучшее, что может выдержать текущий подход.
2. Измерьте длину разрезанной губы, чтобы убедиться, что она не превышает 300 μм (Рисунок 4B), с помощью любого цифрового измерительного программного обеспечения. В этом протоколе использовался ImageJ¹⁴.

4. Захват кончика губы

1. С помощью точного пинцета найдите и изолируйте кончик губы на предметном стекле. Выбросьте все части, оставшиеся на предметном стекле, кроме кончика губы.
2. С такой же точностью пинцетом медленно и слегка зажмите губу, чтобы срезанный конец был свободен и не загораживался пинцетом. Кроме того, убедитесь, что ориентация губы параллельна направлению длины пинцета, а отрезанный конец губы направлен в сторону от корпуса пинцета.
3. После того, как образец будет плотно зажат, уберите усилие зажима, удерживающее кончики пинцета вместе. Кончик губы будет прилипать к одному из кончиков пинцета.
4. Под микроскопом осмотрите кончики пинцета и убедитесь, что кончик губы присутствует на одном из кончиков пинцета (рисунок 5). Если кончик губы не находится на пинцете, вернитесь к шагу 4.2, а если кончик губы не находится ни на пинцете, ни на предметном стекле, вернитесь к шагу 1.

5. Нанесение эпоксидной смолы на консольную балку без опрокидывания.

1. Поместите каплю (~0,05 мл) эпоксидной смолы на край нового предметного стекла, непосредственно отлив клей из оригинальной бутылки/контейнера. Поместите предметное стекло, содержащее эпоксидную смолу, под станцию зонда и сфокусируйтесь на нем.
2. Установите консоль AFM без наконечника на зажимной узел, закрепив основание (т. е. больший конец), оставив консольный конец свободным и подвешенным в пространстве. Убедитесь, что нижняя часть консоли АСМ направлена вниз.
3. Установите манипулятор на станцию зондов.
4. Поднимите ось Z манипулятора в положение, при котором консоль без опрокидывания находится на несколько миллиметров выше предметного стекла, содержащего эпоксидную смолу.
5. Вручную переместите манипулятор так, чтобы консоль без опрокидывания была видна в поле зрения камеры на измерительной станции.
6. С помощью манипулятора перемещайте консоль АСМ по осям X и Y до тех пор, пока кончик консоли не окажется прямо над эпоксидной смолой на краю предметного стекла.
7. Снова используя манипулятор, медленно опустите консоль без опрокидывания в направлении Z над краем предметного стекла.
8. Когда консоль опускается и приближается к предметному стеклу, продолжайте опускать консоль очень медленно, пока она не коснется эпоксидной смолы. Не опускайте консоль дальше.
9. Осторожно включите манипулятор, чтобы медленно переместить консоль в направлении X или Y, и извлеките консоль из ванны с эпоксидной смолой, непрерывно перемещая консоль в выбранном направлении до тех пор, пока консоль полностью не отделится от эпоксидной смолы на предметном стекле. Консоль без опрокидывания должна иметь миниатюрный пузырь эпоксидной смолы на конце, видимый под станцией зонда.
10. Поднимите консоль в направлении Z с помощью манипулятора.

6. Приклеивание кончика губы к консольной балке без опрокидывания.

1. Поверните манипулятор вокруг длинной оси консоли на 90 градусов и положите манипулятор на станцию зонда на бок. В этой конфигурации толщина по длине консоли АСМ находится в вертикальном направлении.
2. Расположите прецизионный пинцет, содержащий наконечник губы, под камерой станции зонда так, чтобы на мониторе компьютера была видна вся длина кончика губы.
3. Расположите узел манипулятора, удерживающий зажим и консоль без наконечника, под камерой станции зонда так, чтобы на мониторе компьютера была видна вся длина консоль без наконечника.
4. Наведите зондовую станцию микроскопа на кончик губы и консоль без наконечника.
5. Ориентируйте консоль перпендикулярно кончику губы, осторожно и вручную вращая манипулятор (рисунок 6A).
6. Используя степени свободы манипулятора, медленно перемещайте консоль без наконечника в направлениях XY так, чтобы клей на кантилевере соприкасался со срезанным концом кончика губы (рис. 6B).
7. Отверждайте эпоксидную смолу, затвердев на пересечении кантилевера и лабрума комара.
8. После того, как эпоксидная смола затвердеет, осторожно задействуйте манипулятор в направлениях XY и отодвиньте консоль от пинцета, убедившись, что кончик губы теперь стоит на бесконцевой консольной балке (рис. 6C).

Изображения сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) изготовленного биогибридного зонда АСМ можно найти на рисунке 7. Конец лабрума был успешно приклеен к консольной балке без опрокидывания. Из-за естественной кривизны жал комаров и ручного управления представленным протоколом крайне сложно получить кантилевер с наконечником жала, идеально перпендикулярным консоли. Смещенный от центра угол между жалом и воображаемой центральной линией, перпендикулярной кантилеверу, обычно составляет ~10 градусов. Хотя это кажется распространенной проблемой при установке датчика на консоль15 АСМ, непреднамеренный наклон должен быть учтен при выполнении анализа силы/напряжения. Было бы интересно, чтобы будущие исследования были сосредоточены на улучшении протокола изготовления и проведении исследований с использованием биогибридного зонда. Это первая попытка создания биогибридного зонда АСМ с использованием жала насекомого.

Рисунок 1: Схема хоботка комара. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Удаление губы хоботка комара. (A) Комар с полным хоботком, показывающим наличие неповрежденного конического кончика. (B) Расположение разреза половой губы и размещение пинцета на половой губе во время процесса удаления половой губы. (В) Направление вытягивания пинцета во время удаления половых губ. (D) Последний рассеченный пучок с неповрежденным концом после удаления губы, при этом конический кончик губы все еще присутствует и не поврежден. Масштабные линейки: 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Отделение губы от нежелательных элементов пучка. (A) Расположение пинцета и направление толкания пинцета как метод отделения членов пучка хоботка. (B) Хоботок после манипуляций, чтобы отделить губу от других членов пучка. Масштабные линейки: 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Изоляция желаемого кончика губы для крепления к консоли АСМ. (А) Расположение разреза губы для удаления кончика губы. Масштабная линейка: 200 μм. (B) Кончик губы, отрезанный от тела губы, имеет длину примерно 200-300 μм. Масштабная линейка: 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Крепление наконечника губы к пинцету перед процессом склеивания. Кончик губы прилип к одному из кончиков пинцета, при этом необрезанный конец губы был свободен и направлен в сторону от корпуса пинцета. Масштабная линейка: 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Последовательность крепления кончика губы к консоли без наконечника. (A) Ориентация консоль без наконечника в перпендикулярном положении по отношению к губе. (B) Слияние консольного станка без наконечника с губой и отверждение эпоксидного клея, используемого для затвердевания соединения между двумя компонентами. (C) Окончательно отвержденный биогибридный зонд АСМ без поддержки губы пинцетом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: СЭМ-изображения биогибридного зонда АСМ. (A) Глобальный вид кончика губы и консоли без наконечника. Масштабная линейка: 200 μм. (B) Увеличенный вид кончика губы. Масштабная линейка: 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы не могут заявить о конфликте интересов.